俞 佳,岑葉平,江玲麗,高有領(lǐng)

食源性病原微生物可引發(fā)疾病,它們可以通過(guò)水、土壤、空氣等媒介傳播,并在食品加工、運(yùn)輸和貯藏等環(huán)節(jié)污染食品,對(duì)人類(lèi)造成不同程度的危害[1-2]。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)統(tǒng)計(jì)顯示,每年約有1/10的人因食源性微生物感染而患病,給公共衛(wèi)生帶來(lái)嚴(yán)重負(fù)擔(dān),且5歲以下兒童具有更高的患病風(fēng)險(xiǎn)[3]。如今由食源性病原微生物引起的疾病仍時(shí)有發(fā)生,如何快速、高效地檢測(cè)食源性病原微生物成為食品安全問(wèn)題的關(guān)鍵所在。

微生物引發(fā)的食源性疾病為美國(guó)患者住院和死亡的主要原因,最常見(jiàn)的病原菌有單核細(xì)胞增多性李斯特菌(Listeriamonocytogenes,簡(jiǎn)稱(chēng)單增李斯特菌)、大腸桿菌O157∶H7(EscherichiacoliO157∶H7)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonellaenterica)、蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)、弧菌屬(Vibriospp.)、空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)和產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin-producingEscherichiacoli(STEC))等[4]。一旦從污染的食品中攝入這些病原菌,就會(huì)給人體造成不同程度的危害(表1)。以單增李斯特菌為例,它是一種重要的人獸共患病原體,研究證明,牛是其主要的無(wú)癥狀攜帶者,單增李斯特菌不僅可以通過(guò)牛和牛乳進(jìn)行傳播,而且在牛糞施肥后的土壤上也有較強(qiáng)的生存能力,從而給農(nóng)產(chǎn)品帶來(lái)污染的風(fēng)險(xiǎn)。此外,其他肉類(lèi)、奶制品、魚(yú)類(lèi)也是其傳播媒介[5]。單增李斯特菌可導(dǎo)致腸道感染,患者出現(xiàn)發(fā)熱、肌肉酸疼、惡心、嘔吐等癥狀,嚴(yán)重者還會(huì)穿越人體的大腦屏障和胎盤(pán)屏障,導(dǎo)致敗血癥、腦膜炎及孕婦流產(chǎn)[6],在免疫力低下人群中具有較高的病死率[7]。

表1 常見(jiàn)食源性病原菌對(duì)人的主要危害

傳統(tǒng)的食源性病原菌檢測(cè)方法一般采用平板培養(yǎng),并結(jié)合生化鑒定和血清型鑒定。該方法應(yīng)用范圍廣、準(zhǔn)確率高、操作簡(jiǎn)便,檢測(cè)成本低,至今仍是檢測(cè)病原微生物的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于其耗時(shí)長(zhǎng)、出現(xiàn)假陰性的概率較大[4],逐漸不能滿(mǎn)足當(dāng)下食品快速檢測(cè)的要求。隨著科學(xué)技術(shù)的日新月異,已建立了多種快速檢測(cè)食源性病原微生物的方法,并逐漸成為檢測(cè)行業(yè)的標(biāo)準(zhǔn)。本文總結(jié)食品中常見(jiàn)病原菌的各項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)并比較各自?xún)?yōu)缺點(diǎn),以期能為今后的食品安全快速與現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)提供參考和依據(jù)。

1 免疫識(shí)別檢測(cè)類(lèi)

1.1 免疫層析法 免疫層析法(Immunochromatographic Assay,ICA)是建立在層析法與抗原-抗體特異性反應(yīng)上的一種快速免疫識(shí)別檢測(cè)技術(shù)。其原理是待測(cè)樣品溶液與檢測(cè)試紙中的抗體反應(yīng)后,溶液因毛細(xì)管作用沿硝酸纖維素膜向上移動(dòng)。若溶液中含有目標(biāo)菌,可與在膜上的檢測(cè)線(T)上固定的特異性抗原或抗體結(jié)合并顯色,從而特異性檢出目標(biāo)病原菌。同時(shí),該膜上還有一條質(zhì)控線(C),無(wú)論有無(wú)目標(biāo)菌,該線上固定的特異性抗原或抗體都可以與結(jié)合墊上的抗體結(jié)合而顯色,從而判斷結(jié)果是否有效[16]。

免疫層析法包括膠體金免疫層析法、基于磁性納米顆粒的免疫層析法和熒光微球免疫層析法等[17-19]。其中膠體金免疫層析法具有檢測(cè)快速、準(zhǔn)確率高、成本低、便于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等特點(diǎn),在食品微生物的檢測(cè)中應(yīng)用較為廣泛[20-21]。我們前期建立了一種檢測(cè)單增李斯特菌溶血素(LLO)的膠體金試紙,在15 min內(nèi)即可對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)速度快,且具有特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好的特點(diǎn),檢出限可達(dá)3×105CFU/mL[20]。為了提高試紙的檢測(cè)效率,多聯(lián)檢測(cè)試紙應(yīng)運(yùn)而生。夏詩(shī)琪等[21]制備出了可同時(shí)檢測(cè)5種沙門(mén)氏菌的膠體金試紙,檢出限達(dá)到105～106CFU/mL,實(shí)現(xiàn)了對(duì)5種沙門(mén)氏菌的同時(shí)檢測(cè)。膠體金多聯(lián)檢測(cè)試紙大大提高了檢測(cè)效率,在食品檢測(cè)中具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

1.2 免疫吸附法

1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附法 酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)是基于抗原抗體反應(yīng)的一種檢測(cè)方法。該方法將抗體(或抗原)固定在固相載體上,使酶標(biāo)的抗原(或抗體)和待測(cè)樣本進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,根據(jù)加入含酶底物后溶液的顯色情況對(duì)樣本進(jìn)行定性和定量檢測(cè),具有檢測(cè)速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)學(xué)等檢測(cè)領(lǐng)域[4,22]。

傳統(tǒng)的ELISA方法具有設(shè)備昂貴、抗體制備流程復(fù)雜且不同批次的抗體質(zhì)量差異較大、容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)等局限性[4],現(xiàn)已開(kāi)發(fā)多種ELISA與其他技術(shù)相結(jié)合的新方法。Pang等[23]開(kāi)發(fā)了一種基于紙張的ELISA檢測(cè)方法(P-ELISA),使用該方法對(duì)致病性大腸桿菌O157∶H7進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)限可達(dá)到1×104CFU/mL,且無(wú)需依賴(lài)大型設(shè)備,攜帶方便,有利于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。Gu等[24]研制了一種特異性納米抗體,該抗體可與辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合,無(wú)需額外制備二抗,有效縮短了檢測(cè)時(shí)間,降低了檢測(cè)成本。研究顯示該方法檢測(cè)腸炎沙門(mén)氏菌的檢測(cè)限可達(dá)5×104CFU/mL,且經(jīng)8 h富集,在牛奶中的檢測(cè)限可達(dá)10 CFU/mL,與傳統(tǒng)ELISA方法相比具有更高的靈敏度。因此將ELISA與其他技術(shù)相結(jié)合,研發(fā)出更靈敏、快捷的檢測(cè)方法,是目前研究的熱點(diǎn)方向之一,應(yīng)用前景較廣闊。

1.2.2 熒光免疫吸附法 熒光免疫吸附法(Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay, FLISA)是利用免疫吸附原理,將抗體(或抗原)固定在固相載體上,并用熒光物質(zhì)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的辣根過(guò)氧化物酶等物質(zhì)標(biāo)記抗體(或抗原),使其與待測(cè)樣本進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合,激發(fā)熒光標(biāo)記物,最后通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱對(duì)目標(biāo)病原菌進(jìn)行定性或者定量鑒定[25]。

黃偉華等使用熒光微球作為標(biāo)記物,利用雙抗體夾心熒光免疫吸附法對(duì)單增李斯特菌進(jìn)行定量檢測(cè),并與傳統(tǒng)ELISA法進(jìn)行比較。結(jié)果顯示ELISA法的檢測(cè)限為107CFU/mL,熒光免疫吸附法的檢測(cè)限為105CFU/mL,靈敏度比ELISA法提高了兩個(gè)數(shù)量級(jí),且與其他致病菌無(wú)明顯交叉反應(yīng)[26]?？梢?jiàn)熒光免疫吸附法較酶聯(lián)免疫吸附法具有更高的靈敏度和特異性。

1.3 免疫磁珠分離技術(shù) 免疫磁珠分離技術(shù)(Immunomagnetic bead separation techniques, IMBS)是將特異性抗體包被于磁珠之中,以此來(lái)捕獲目標(biāo)抗原,并在磁場(chǎng)的作用下對(duì)目標(biāo)抗原進(jìn)行分離和富集,從而達(dá)到快速分離目標(biāo)抗原的目的。免疫磁珠分離技術(shù)有著效率高、可重復(fù)性好、速度快、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn),可代替?zhèn)鹘y(tǒng)檢測(cè)中選擇性增菌的步驟[27]。

Wang等[28]通過(guò)免疫磁珠分離技術(shù)與流式細(xì)胞相結(jié)合,富集并檢測(cè)了生菜和草莓中單個(gè)大腸桿菌O157活體細(xì)胞,該檢測(cè)過(guò)程需5.7 h,檢測(cè)限可達(dá)1 CFU/25 g。與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法相比,大大縮短了檢測(cè)時(shí)間,提高了檢測(cè)效率。但由于免疫磁珠價(jià)格過(guò)于昂貴,且只能對(duì)目標(biāo)病原菌進(jìn)行富集與分離,還需結(jié)合其他技術(shù)對(duì)病原菌進(jìn)行進(jìn)一步鑒定,限制了其在實(shí)際檢測(cè)中的廣泛應(yīng)用。

免疫學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)食源性病原菌具有準(zhǔn)確率高、特異性強(qiáng)、速度快等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)領(lǐng)域,但同時(shí)也存在設(shè)備或試劑昂貴、操作復(fù)雜等缺點(diǎn),如何進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化,是目前主要的研究熱點(diǎn)之一。

2 分子生物學(xué)檢測(cè)類(lèi)

2.1 傳統(tǒng)核酸檢測(cè)方法

2.1.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)由美國(guó)Mullis于1986年發(fā)明,它實(shí)現(xiàn)了核酸分子在體外短時(shí)間內(nèi)大量擴(kuò)增[29]。該方法通過(guò)設(shè)計(jì)病原菌的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并在瓊脂糖凝膠電泳后通過(guò)凝膠成像儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證,即可完成對(duì)目標(biāo)樣品檢測(cè)。PCR反應(yīng)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低等優(yōu)點(diǎn),已廣泛應(yīng)用于食源性病原菌的檢測(cè)之中[4]。但其每次只能檢測(cè)一種病原菌,且不能進(jìn)行定量,存在一定的假陽(yáng)性[4,30]。

為解決PCR反應(yīng)只能單通量檢測(cè)的缺陷,建立了多重PCR(Multiplex PCR,mPCR)技術(shù)。mPCR可針對(duì)多個(gè)目標(biāo)病原菌設(shè)計(jì)多對(duì)引物,使其在同一體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以實(shí)現(xiàn)多個(gè)病原菌的同時(shí)檢測(cè)。Tao等[31]建立了一種可同時(shí)檢測(cè)沙門(mén)氏菌、單增李斯特菌、致病性大腸桿菌等11種病原菌的通用引物介導(dǎo)的mPCR檢測(cè)方法,檢測(cè)限可達(dá)103～104CFU/mL,其中對(duì)霍亂弧菌和福氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)的檢測(cè)限可達(dá)102CFU/mL[31]。Boukharouba等[32]基于mPCR,建立了一種可同時(shí)檢測(cè)致病性大腸桿菌、單增李斯特菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的方法。該研究將四種病原菌于緩沖蛋白胨水(BPW)中進(jìn)行統(tǒng)一增菌后,使用mPCR法對(duì)其進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。該方法的檢測(cè)限可達(dá)10 pg/μL,且BPW肉湯可有效支持四種病原菌的共同生長(zhǎng),從而減少因不同病原菌各自分離培養(yǎng)所需的時(shí)間和成本。但mPCR的特異性不高,引物設(shè)計(jì)復(fù)雜,且仍存在不能定量分析,無(wú)法區(qū)分活菌和死菌,因而仍具有一定的局限性[33]。

2.1.2 熒光定量PCR 熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)是基于PCR反應(yīng),在反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光探針等熒光物質(zhì),利用熒光信號(hào)的變化對(duì)整個(gè)反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),即可得到DNA擴(kuò)增的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù),實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)病原菌的定量分析。與普通PCR相比,qPCR具有更高的特異性和靈敏度,且可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)病原菌的定量分析[34-35]。

Vizzini等[36]基于qPCR設(shè)計(jì)了一對(duì)引物CampyPFw和CampyPRv,可同時(shí)對(duì)4種彎曲桿菌進(jìn)行鑒定,該方法無(wú)需預(yù)增菌步驟,且具有較高的靈敏度,檢測(cè)限約為4.6×102cells/mL。王華健等[37]通過(guò)分別設(shè)計(jì)三對(duì)特異性引物和探針,建立了可同時(shí)檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7、沙門(mén)氏菌和單增李斯特菌的多重qPCR方法,結(jié)果顯示該方法具有較好的特異性,檢測(cè)限為104copies/μL,并具有較好的重復(fù)性。為改進(jìn)熒光定量PCR方法無(wú)法區(qū)分死菌與活菌的缺點(diǎn),張俊彥等利用疊氮溴化乙錠(EMA)與實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)相結(jié)合來(lái)檢測(cè)食品中的單增李斯特菌活菌。結(jié)果顯示,該方法與傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)法結(jié)果一致,且在10 h左右完成檢測(cè),時(shí)間遠(yuǎn)短于傳統(tǒng)檢測(cè)方法,檢測(cè)限可達(dá)55 CFU/反應(yīng)[38]。 qPCR的缺點(diǎn)為檢測(cè)成本較高,容易產(chǎn)生交叉污染,且加樣時(shí)溫度、速度等因素均會(huì)影響結(jié)果,對(duì)操作者的技術(shù)要求較高[33,39]。

2.1.3 數(shù)字PCR 數(shù)字PCR(digital PCR,dPCR)是可以對(duì)核酸分子進(jìn)行絕對(duì)定量的檢測(cè)技術(shù)。dPCR可將體系中的樣本分成幾十萬(wàn)份,使每個(gè)反應(yīng)單元盡可能僅包含一份核酸樣品,從而分別進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng),通過(guò)檢測(cè)到的熒光信號(hào)大小對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定性和絕對(duì)定量分析。dPCR技術(shù)在檢測(cè)中無(wú)需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線或添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),且檢測(cè)限低,準(zhǔn)確率高,在食源性病原菌的檢測(cè)中具有較大的優(yōu)勢(shì)[40]。

Suo等[41]開(kāi)發(fā)了一種芯片數(shù)字PCR(chip digital PCR,cdPCR)技術(shù)用以快速檢測(cè)復(fù)雜食品基質(zhì)中的鼠傷寒沙門(mén)氏菌,該方法僅需2 h完成檢測(cè),檢測(cè)限可達(dá)90 CFU/反應(yīng),捕獲效率為94.5%,該方法實(shí)現(xiàn)了預(yù)增菌與定量檢測(cè)的結(jié)合,有利于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。He等[42]基于微滴數(shù)字PCR(droplet digital PCR,ddPCR),建立了可從食品中檢測(cè)致病性大腸桿菌的方法,并可同時(shí)檢測(cè)其產(chǎn)生的志賀毒素。該方法無(wú)需預(yù)增菌,在蘋(píng)果汁中的檢測(cè)限可達(dá)2 CFU/mL。dPCR動(dòng)態(tài)范圍受反應(yīng)單元數(shù)量限制,在分析前需要對(duì)樣品進(jìn)行稀釋,且dPCR的儀器和試劑較昂貴,檢測(cè)成本較高[43]。

2.2 核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法

2.2.1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)由Notomi等于2000年首次發(fā)表[44],該方法通過(guò)兩對(duì)特異性引物識(shí)別目的基因的6個(gè)特異性序列,反應(yīng)在恒溫(60 ℃～65 ℃)下進(jìn)行,具體步驟如圖1[45]所示。LAMP方法反應(yīng)速度快,通常在1 h內(nèi)就可以完成對(duì)目標(biāo)樣品的檢測(cè),且特異性強(qiáng)、成本低。與PCR反應(yīng)相比,LAMP可直接對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè),無(wú)需進(jìn)行增菌,反應(yīng)的結(jié)果可通過(guò)不同方法(比濁法、鈣黃綠素等)用肉眼直接判斷,無(wú)需通過(guò)凝膠電泳檢測(cè),且LAMP反應(yīng)的靈敏度比PCR高10～100倍[46]。

注:A.起始物合成階段。1-2. 在Bst DNA聚合酶的作用下從內(nèi)部引物FIP開(kāi)始合成互補(bǔ)DNA鏈;3-5. 外部引物F3與模板結(jié)合,置換FIP連接的互補(bǔ)鏈,并在5′端處形成莖環(huán)結(jié)構(gòu);6-8. 在下游內(nèi)部引物BIP作用下延伸DNA鏈,并在下游外部引物B3作用下置換DNA,最終形成兩端都有莖環(huán)的結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物。B.循環(huán)擴(kuò)增階段。8-11. 雙莖環(huán)DNA作為第2階段循環(huán)擴(kuò)增的模板,在內(nèi)引物和Bst DNA聚合酶引導(dǎo)下進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增,最終擴(kuò)增出長(zhǎng)短不一的花椰菜狀DNA

Hassan等[47]建立了一種基于LAMP快速檢測(cè)肉類(lèi)和牛奶中金黃色葡萄球菌的方法,該方法以致病性金黃色葡萄球菌的femA基因和arcC基因?yàn)榘谢蜻M(jìn)行LAMP反應(yīng),整個(gè)檢測(cè)過(guò)程需要1.3 h,且該試驗(yàn)的靈敏度較PCR反應(yīng)提高了100倍。Jainonthee等[48]建立了一種基于RNA反轉(zhuǎn)錄(RT)與LAMP相結(jié)合的RT-LAMP法,用于實(shí)時(shí)檢測(cè)雞肉中的空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni),該方法使用9 min即可使反應(yīng)達(dá)到最佳閾值,且可在3 h內(nèi)完成整個(gè)檢測(cè)過(guò)程,檢測(cè)限可達(dá)103CFU/mL。但由于LAMP反應(yīng)至少需要設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物,引物設(shè)計(jì)較為繁瑣,且在檢測(cè)過(guò)程中容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增與污染,距離初步的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用還需要進(jìn)一步研究[49]。

2.2.2 重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù) 重組酶聚合酶擴(kuò)增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)技術(shù)也是一種等溫?cái)U(kuò)增技術(shù),該方法由Piepenburg等于2006年首次提出[50]。RPA通過(guò)重組酶與引物結(jié)合模板中的同源序列結(jié)合并插入模板中形成D-環(huán)結(jié)構(gòu),再在單鏈結(jié)合蛋白與DNA聚合酶作用下進(jìn)行延伸,使用凝膠糖電泳或熒光探針檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,以達(dá)到對(duì)目標(biāo)病原菌定性或定量檢測(cè)的目的(圖2[51])。相對(duì)于LAMP,RPA可在更低的溫度下(37 ℃～42 ℃)進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)時(shí)間僅需5～20 min,且靈敏度高,特異性強(qiáng),操作更為簡(jiǎn)便[52]。

注:A. 重組酶與引物結(jié)合,形成重組酶引物復(fù)合體;B. 重組酶引物復(fù)合體定位到DNA模板上的同源序列;C. 重組酶引物復(fù)合體插入DNA序列形成D-環(huán)結(jié)構(gòu),啟動(dòng)鏈置換反應(yīng);D. 單鏈結(jié)合蛋白與解開(kāi)的DNA鏈結(jié)合,防止進(jìn)一步置換;E. 在DNA聚合酶作用下,DNA開(kāi)始復(fù)制延伸;F.兩條新的雙鏈互補(bǔ)DNA形成

Li等[53]基于RPA技術(shù),結(jié)合光敏比色法來(lái)檢測(cè)沙門(mén)氏菌,結(jié)果顯示該試驗(yàn)在1 h內(nèi)即可完成,檢測(cè)限為5×103CFU/mL,對(duì)沙門(mén)氏菌進(jìn)行6 h增菌后,檢測(cè)限可達(dá)3 CFU/mL。Du等[54]將RPA技術(shù)與側(cè)流層析試紙結(jié)合,建立了一種快速檢測(cè)單增李斯特菌的方法,該方法可在15 min內(nèi)完成檢測(cè),檢測(cè)限為15 CFU/mL,對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)增菌6 h后,檢測(cè)限可達(dá)1.5 CFU/mL。目前RPA商業(yè)化的試劑盒較少,試劑價(jià)格相對(duì)較高,且沒(méi)有專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)引物的軟件,僅用于實(shí)驗(yàn)室研究,在食品檢測(cè)行業(yè)中還未得到廣泛應(yīng)用[55]。

2.3 基因芯片技術(shù) 基因芯片技術(shù)又稱(chēng)DNA微陣列技術(shù),其原理是將大量核酸探針片段按陣列方式固定在載體表面上,使被標(biāo)記的樣本核酸片段與之雜交,通過(guò)雜交時(shí)產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)弱對(duì)樣品進(jìn)行定性或定量分析。基因芯片技術(shù)具有通量高、特異性強(qiáng)、速度快、靈敏度高、可區(qū)分活菌與死菌,目前應(yīng)用比較廣泛。但基因芯片價(jià)格昂貴,且制備復(fù)雜,重復(fù)性較差,需要專(zhuān)業(yè)的操作人員,因此如何優(yōu)化該技術(shù),使之簡(jiǎn)便化與低成本化,是目前研究的熱點(diǎn)之一[56]。

Srinivasan等[57]設(shè)計(jì)了一種高密度微陣列同時(shí)鑒定14種食源性病原微生物,該技術(shù)使用金標(biāo)記銀增強(qiáng)(gold labeling with silver enhancement,GLS)方法,并通過(guò)使用高分辨率的平板掃描儀量化反應(yīng)過(guò)程中金沉積與銀增強(qiáng)所產(chǎn)生的信號(hào),從而對(duì)目標(biāo)樣品進(jìn)行定量分析。該高密度微陣列避免了假陽(yáng)性的產(chǎn)生,具有與PCR相似的靈敏度,且無(wú)需使用昂貴的激光掃描儀,是一種經(jīng)濟(jì)且可靠的微陣列檢測(cè)方法。Li等[58]設(shè)計(jì)了一種可視化DNA微陣列芯片,以同時(shí)檢測(cè)食品中常見(jiàn)的病原體。該方法將mPCR與基因芯片技術(shù)結(jié)合,將堿性磷酸酶及其底物引入試驗(yàn),可通過(guò)肉眼直接判斷結(jié)果,并通過(guò)比色法對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定量分析,該方法的檢測(cè)限小于102CFU/mL,具有較高的靈敏度。

2.4 新型快速核酸檢測(cè)方法

2.4.1 核酸-微流控芯片 核酸-微流控芯片技術(shù)是基于小型微流控芯片進(jìn)行核酸擴(kuò)增并檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,從而鑒別病原菌的一種快速檢測(cè)方法。微流控技術(shù)由Whitesides于2006年提出,該技術(shù)特征是使用微米級(jí)通道對(duì)流體進(jìn)行精密操控[59]。微流控技術(shù)可將樣品制備、反應(yīng)、分離、分析等步驟集成于一塊微小的芯片上,集成度高、檢測(cè)速度快、成本低、靈敏度高,可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[60]。將微流控芯片與核酸檢測(cè)結(jié)合,無(wú)需使用大型且昂貴的核酸擴(kuò)增設(shè)備,既降低了成本,又便于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),有較大的市場(chǎng)潛力。目前,應(yīng)用于食源性病原菌檢測(cè)中的核酸-微流控技術(shù)有PCR-微流控芯片技術(shù)、LAMP-微流控芯片技術(shù)和RPA-微流控芯片技術(shù)等(表2)。下面將應(yīng)用比較多的PCR-微流控技術(shù)與LAMP-微流控技術(shù)進(jìn)行介紹。

表2 核酸-微流控技術(shù)在食源性病原菌快速檢測(cè)中的部分應(yīng)用

Kopp等[61]于1998年首次建立了將PCR與微流控技術(shù)相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù),PCR-微流控技術(shù)與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比,體系溫度更為均勻,檢測(cè)的靈敏度與準(zhǔn)確率大大提高,是目前快速檢測(cè)食源性病原菌的研究熱點(diǎn)之一。Zhang等[62]建立了一種新型PCR-微流控芯片來(lái)檢測(cè)大腸桿菌O157∶H7,該技術(shù)通過(guò)在反應(yīng)通道中泵入磁珠,并對(duì)其施加多環(huán)高梯度磁場(chǎng),以高效獲取樣品中的DNA,結(jié)果表明該方法對(duì)大腸桿菌O157∶H7的檢測(cè)限可達(dá)12 CFU/mL,具有較高的靈敏度。為了降低檢測(cè)成本,方便現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),Salman等設(shè)計(jì)出一種便攜的分流PCR微流控裝置。該裝置在體系循環(huán)時(shí)可較快進(jìn)行加熱和冷卻,進(jìn)而縮短反應(yīng)時(shí)間。同時(shí),該技術(shù)通過(guò)結(jié)合低成本且高靈敏度的鎖定光電檢測(cè)器對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè),實(shí)現(xiàn)了對(duì)致病性大腸桿菌的定量檢測(cè),對(duì)致病性大腸桿菌dsDNA的檢測(cè)限可達(dá)0.7 ng/μL[63]。同時(shí),張道遠(yuǎn)等[64]設(shè)計(jì)出一種高集成度的數(shù)字PCR-微流控芯片,該芯片實(shí)現(xiàn)了數(shù)字PCR芯片的小型化,便于攜帶,且進(jìn)樣率高、樣品損耗少、成本較低,可以滿(mǎn)足一般實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)需求。

LAMP與微流控技術(shù)結(jié)合,可優(yōu)化LAMP的性能并縮短檢測(cè)時(shí)間,提高檢測(cè)效率、靈敏度和特異性。同時(shí)LAMP-微流控技術(shù)還可對(duì)病原菌進(jìn)行高通量檢測(cè)與現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè),市場(chǎng)前景廣闊[65]。Xiang等開(kāi)發(fā)了一種基于微流控芯片與LAMP結(jié)合的快速檢測(cè)方法,以檢測(cè)零食中11種常見(jiàn)的沙門(mén)氏菌血清型。該方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品的高通量檢測(cè),且在40 min內(nèi)可完成整個(gè)反應(yīng)過(guò)程,檢測(cè)限可達(dá)102～103CFU/mL。結(jié)果顯示該方法的血清型檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)方法一致,可滿(mǎn)足有關(guān)部門(mén)對(duì)沙門(mén)氏菌監(jiān)測(cè)的需求[66]。Luo等[67]建立了一種基于微流控芯片,并將LAMP和成簇規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)/Cas12a進(jìn)行系統(tǒng)集成來(lái)檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法。該技術(shù)通過(guò)兩個(gè)微小的通道分別添加反應(yīng)試劑,從而實(shí)現(xiàn)了在一個(gè)芯片上進(jìn)行兩步反應(yīng),避免LAMP溶液轉(zhuǎn)移到CRISPR/Cas反應(yīng)溶液時(shí)可能導(dǎo)致的氣溶膠污染和交叉污染的問(wèn)題。同時(shí),整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可在50 min內(nèi)完成,反應(yīng)速度快,且對(duì)粗提的基因組DNA檢測(cè)限可達(dá)118 pg/μL,具有較高的靈敏度。

使用核酸-微流控芯片技術(shù)檢測(cè)食源性病原菌,成本低、集成度高、靈敏度高且特異性好,便于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),具有取代傳統(tǒng)檢測(cè)法的潛力。但作為近幾年興起的新技術(shù),該方法還未被大范圍應(yīng)用,且具有對(duì)儀器精密度要求高等局限性,未來(lái)將往更全面、精準(zhǔn)且自動(dòng)化的方向發(fā)展[68]。

2.4.2 肽核酸熒光原位雜交技術(shù) 熒光原位雜交(Fluorescence In Situ Hybridization,FISH)技術(shù)是利用熒光標(biāo)記核酸探針,通過(guò)探針與目標(biāo)核酸的特異性雜交來(lái)激發(fā)熒光,產(chǎn)生熒光信號(hào),從而對(duì)目標(biāo)樣品進(jìn)行鑒定的一種快速檢測(cè)方法[75-76]。肽核酸(Peptide Nucleic Acid,PNA)是一種DNA類(lèi)似物,與DNA探針相比,具有更高的親和力、穩(wěn)定性和特異性,故而代替普通的核酸探針廣泛應(yīng)用于單增李斯特菌和沙門(mén)氏菌等食源性病原菌的鑒定中[74-76]。Rocha等[77]建立了一種基于PNA-FISH技術(shù)來(lái)快速檢測(cè)食品中單增李斯特菌的方法,該方法使用已知PNA探針與一種新型阻斷劑探針以1∶2比例耦合替代原有的PNA探針,結(jié)果顯示該方法在不同的食品基質(zhì)中對(duì)單增李斯特菌的檢測(cè)限可達(dá)0.5 CFU/mL(g),總體準(zhǔn)確度為99%,特異性高、靈敏度強(qiáng)、準(zhǔn)確度高,且使用離心法,在29 h內(nèi)可完成整個(gè)檢測(cè)過(guò)程,檢測(cè)速度較傳統(tǒng)方法快。楊彤等[75]建立了一種液相PNA-FISH技術(shù)來(lái)檢測(cè)沙門(mén)氏菌,該方法的檢測(cè)限可達(dá)104CFU/mL,與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相當(dāng),但該方法具有更好的特異性、準(zhǔn)確性與重復(fù)性,并大大縮短了檢測(cè)時(shí)間,為沙門(mén)氏菌的檢測(cè)提供了一個(gè)快速且較可靠的新方案。

PNA-FISH技術(shù)法檢測(cè)食源性病原菌,可以提高檢測(cè)的特異性與準(zhǔn)確度,并縮短檢測(cè)時(shí)間,但該技術(shù)需依賴(lài)熒光顯微鏡并使用PNA探針,價(jià)格昂貴,多用于實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè),較難在整個(gè)行業(yè)中推廣[78]。故如何優(yōu)化PNA-FISH技術(shù),降低成本,使其廣泛應(yīng)用到現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)之中,是該項(xiàng)研究的重中之重。

分子生物學(xué)檢測(cè)方法速度快,特異性強(qiáng),靈敏度高,但多需要借助大型的檢測(cè)儀器,給現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)帶來(lái)不便。核酸-微流控芯片技術(shù)的出現(xiàn),較好地解決了這個(gè)問(wèn)題,其儀器依賴(lài)性較小,方便攜帶,且集成度高,為現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)與實(shí)時(shí)檢測(cè)帶來(lái)可能。

3 生物傳感器檢測(cè)類(lèi)

3.1 電化學(xué)生物傳感器 生物傳感器主要由生物感受器和信號(hào)轉(zhuǎn)換器組成,可將信號(hào)識(shí)別、轉(zhuǎn)導(dǎo)、放大集于一體。生物傳感器基于細(xì)胞、組織、核酸、酶、抗體、抗原等物質(zhì)來(lái)識(shí)別目標(biāo)物質(zhì),并將其轉(zhuǎn)化為光、電、磁等其他信號(hào)輸出,從而完成對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的定性與定量檢測(cè)[79]。電化學(xué)生物傳感器通過(guò)感受器識(shí)別目標(biāo)物質(zhì)時(shí)產(chǎn)生的電流、電位、電阻或電導(dǎo)的變化來(lái)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定量,具有靈敏度高、成本低、操作簡(jiǎn)便、可實(shí)時(shí)分析、檢測(cè)速度快等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于食源性病原微生物的檢測(cè)之中[79]。

Nordin等[80]開(kāi)發(fā)了一種電化學(xué)DNA生物傳感器,其使用聚乳酸穩(wěn)定的金納米顆粒(PLA-AuNPs)來(lái)修飾電極,并利用DNA雜交來(lái)檢測(cè)副溶血性弧菌。該生物傳感器可以特異性區(qū)分不匹配的、非互補(bǔ)的和互補(bǔ)的核酸片段,且無(wú)明顯的交叉反應(yīng),具有較高的特異性和靈敏度。Saini等[81]基于碳納米纖維/金納米顆粒(CNF/AuNp)電極的電化學(xué)生物傳感器,首次使用磷脂酰肌醇特異性磷脂酶基因(PlcA)作為核酸探針,來(lái)檢測(cè)牛奶樣品中的單增李斯特菌。該方法在30 min內(nèi)可完成檢測(cè),靈敏度為3 461(μA/cm2)/ng,檢測(cè)限可達(dá)82 fg/6 μL。

3.2 光學(xué)生物傳感器 光學(xué)生物傳感器通過(guò)接收生物受體與被標(biāo)記的物質(zhì)直接發(fā)光或在反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生顏色、化學(xué)發(fā)光、熒光等光學(xué)信號(hào),并將其轉(zhuǎn)化為電信號(hào),從而對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)。此外,還有表面等離子體共振(SPR)和表面增強(qiáng)拉曼光譜等方法,通過(guò)反應(yīng)過(guò)程中環(huán)境光學(xué)特性的變化來(lái)檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì),無(wú)需額外提供標(biāo)記物。光學(xué)生物傳感器靈敏度高、檢測(cè)速度快、檢出率高,已廣泛應(yīng)用于食源性病原菌的檢測(cè)之中,但其儀器昂貴,且檢測(cè)時(shí)易受環(huán)境的干擾,對(duì)環(huán)境要求較高[82-84]。

Zheng等[84]開(kāi)發(fā)了一種基于多孔gold@platinum納米催化劑(Au@PtNCs)的光學(xué)生物傳感器,并與被動(dòng)式三維微混合器結(jié)合來(lái)快速檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌。該方法使用磁分離技術(shù),可在99 min內(nèi)分離得到10%的目標(biāo)菌,檢測(cè)限可達(dá)17 CFU/mL。Khateb等[85]基于局域表面等離子體共振(LSPR),開(kāi)發(fā)了一種不需要標(biāo)記物的光學(xué)生物傳感器。該方法無(wú)需預(yù)增菌步驟,只需2 min即可完成整個(gè)分析檢測(cè)過(guò)程,在牛奶中金黃色葡萄球菌的檢測(cè)限可達(dá)103CFU/mL。

3.3 質(zhì)量生物傳感器 質(zhì)量生物傳感器是基于共振現(xiàn)象,通過(guò)感應(yīng)傳感器表面微小的質(zhì)量變化對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè),無(wú)需標(biāo)記物的參與。根據(jù)換能器的不同可分為壓電生物傳感器和磁彈性生物傳感器。質(zhì)量生物傳感器具有高靈敏度、快速、便捷等特點(diǎn),但目前在食源性病原微生物的檢測(cè)方面應(yīng)用不廣泛,具有較大的發(fā)展?jié)摿86]。

劉素芹等[87]設(shè)計(jì)了一種以壓電生物傳感器為基礎(chǔ)的自動(dòng)化微生物檢測(cè)儀來(lái)檢測(cè)病原微生物。結(jié)果顯示用該方法檢測(cè)致病性大腸桿菌,檢測(cè)限可達(dá)到10 CFU/mL,與傳統(tǒng)平板分離法的準(zhǔn)確度相當(dāng),但更為快速、便捷,靈敏度更高。Wang等[88]設(shè)計(jì)了一種基于噬菌體磁彈性生物傳感器來(lái)檢測(cè)菠菜中的沙門(mén)氏菌。對(duì)沙門(mén)氏菌富集7 h后進(jìn)行檢測(cè),檢出限可達(dá)100 CFU/25 g,檢測(cè)速度比美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局BAM方法的檢測(cè)速度(24～26 h)快了3倍多。

生物傳感器法也是目前較新興的檢測(cè)方法,其可對(duì)目標(biāo)病原菌進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析,且具有較高的靈敏度,但由于其對(duì)儀器精密度的要求和對(duì)環(huán)境的要求較高,限制了其的廣泛應(yīng)用。

4 結(jié) 語(yǔ)

目前,對(duì)食源性病原菌的檢測(cè)技術(shù)仍以傳統(tǒng)的分離鑒定方法為主,各種現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)共存[4]。傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)分離鑒定法耗時(shí)長(zhǎng),不利于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),而新近發(fā)展的快速檢測(cè)技術(shù)耗時(shí)短,克服了這一缺點(diǎn)。但由于不同的現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)具有不同的優(yōu)勢(shì)與局限性,還需進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。如免疫學(xué)檢測(cè)方法利用抗原抗體反應(yīng)對(duì)病原菌進(jìn)行檢測(cè),速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高,但其抗體制備復(fù)雜且重復(fù)性較差,與其他技術(shù)相結(jié)合開(kāi)發(fā)出更靈敏、快捷的檢測(cè)方法,是將來(lái)研究的方向。

在分子生物學(xué)檢測(cè)方法中,mPCR可以實(shí)現(xiàn)快速多重檢測(cè);qPCR則解決了普通PCR不能定量的問(wèn)題;dPCR可對(duì)目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行絕對(duì)定量,且準(zhǔn)確度更高;基因芯片技術(shù)通過(guò)分子雜交原理,可對(duì)樣品進(jìn)行定量分析及實(shí)現(xiàn)大批量樣品的同時(shí)檢測(cè)。隨著等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的興起,LAMP、RPA等技術(shù)均被運(yùn)用到了食品中病原菌的檢測(cè)之中。這幾種方法均具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、速度快等特點(diǎn),但其操作復(fù)雜,且儀器試劑昂貴,需要專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員,給現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)帶來(lái)一定的困難。微流控技術(shù)的引入,則較好地解決了這個(gè)問(wèn)題。將微流控芯片與核酸檢測(cè)技術(shù)結(jié)合,既可以對(duì)樣品實(shí)現(xiàn)較為快速的檢測(cè),又避免依賴(lài)大型儀器,適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。目前基于微流控芯片的檢測(cè)技術(shù)正處于前期研發(fā)階段,在將來(lái)會(huì)向更全面、精確、簡(jiǎn)便且自動(dòng)化的方向發(fā)展。

生物傳感器檢測(cè)技術(shù)具有結(jié)果可視化、功能多樣化、智能化的特點(diǎn),檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。但由于其儀器昂貴,且光學(xué)生物傳感器對(duì)環(huán)境的要求較高,故而在實(shí)際應(yīng)用中仍需進(jìn)一步研究完善。

食源性病原菌的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)是有效監(jiān)測(cè)和預(yù)防食源性疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié),相信隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展,可建立更為準(zhǔn)確、快速、便捷且性?xún)r(jià)比高的檢測(cè)方法,應(yīng)用到現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)之中,以更好地預(yù)防病原菌的傳播與感染,保障廣大消費(fèi)者的食品安全,推進(jìn)改善民生福祉,助力健康中國(guó)行動(dòng)計(jì)劃。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：俞佳,岑葉平,江玲麗,等.常見(jiàn)食源性病原菌的快速檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào),2024,40(2):123-133. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.024