劉小琨,張蒼,王翊同

1.北京中醫(yī)藥大學,北京 100020; 2.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院皮膚科/北京市趙炳南皮膚病醫(yī)療研究中心,北京 100010

銀屑病是一種免疫介導的慢性炎癥性皮膚病,典型皮損表現(xiàn)為鱗屑性紅斑或斑塊,局限或廣泛分布[1]。銀屑病的發(fā)病機制尚不完全清楚,目前臨床普遍認為銀屑病是T細胞和樹突細胞介導的多基因疾病,以遺傳背景為基礎,以外界環(huán)境對免疫系統(tǒng)的刺激為誘因,以角質細胞的異常增生和局部炎癥為主要病理表現(xiàn)[2-3],感染、吸煙、寒冷干燥、焦慮、睡眠障礙等均是本病的危險因素[4-5]。1984—2017年間,我國的銀屑病發(fā)病率由0.123%上升到0.500%[6-7],且該病具有難治愈、高復發(fā)、病程長的特點[8]。銀屑病尚無治愈方法,目前的治療手段主要包括維A酸類、維生素D3類、糖皮質激素、免疫抑制劑、生物制劑和光療等[9]。上述治療方法雖可有效緩解銀屑病的病情,但長期使用存在感染風險增加、患惡性腫瘤風險升高、引發(fā)代謝性疾病和治療費用昂貴等問題。在保證安全性的前提下,長期控制病情、提高患者生活質量,是當前治療銀屑病的目標。預防和延緩銀屑病的復發(fā)是長期改善患者生活質量的有效途徑,也是治療的難點。因此,進一步探究銀屑病的發(fā)病機制,開發(fā)新的藥物是有必要的。

銀屑病屬中醫(yī)“白疕”范疇。筆者認為,“內有蘊熱、郁于血分”是銀屑病的基本病機,“從血論治”是銀屑病的基本治則。中醫(yī)辨證施治銀屑病,一般分為“血熱、血瘀、血燥”3種證型論治,對改善銀屑病的長期預后、預防銀屑病復發(fā)存在一定優(yōu)勢[1]。本研究從基因表達數據庫(gene expression omnibus,GEO)獲得原始數據,通過生物信息學方法探索與銀屑病相關的差異表達基因(differentially expressed genes,DEGs),并對其中的核心基因進行功能和通路的富集分析,探究銀屑病的病理機制與治療靶點,再將核心基因與中藥相互映射,為對銀屑病治療靶點有潛在干預作用的中藥提供理論支持,為銀屑病病理機制和潛在中藥的研究提供思路。

1 資料與方法

1.1 數據提取在美國國立生物技術中心的CEO[10]中檢索與銀屑病相關的數據集,提取GSE161683、GSE193128、GSE137218數據集的原始數據,所有數據集中樣本均取自銀屑病患者,其中銀屑病組為受累皮損,對照組為非受累的正常皮膚,僅保留基線期未進行干預的組織學樣本進行DEGs篩選。各基因芯片的芯片平臺、樣本例數、組織類型等詳細信息見表1。

表1 本研究所提取銀屑病組及對照組數據集的基本信息

1.2 DEGs篩選下載數據集與平臺文件后,用芯片平臺中的注釋文件對原始數據中的基因探針進行注釋,剔除沒有匹配到基因名(Gene symbol)的探針;若多個不同探針檢測同一基因,則選取這些探針的均值作為該基因的最終表達量。應用R語言“l(fā)immar”包篩選3個數據集中銀屑病組織和正常組織的DEGs[11-12],以校正后P<0.05,log2FC的絕對值>1.0篩選DEGs,log2FC為正數表示基因表達上調,log2FC為負數表示基因表達下調,應用R語言“ggplot2”包制作DEGs的熱圖和火山圖[13]。對3個數據集的DEGs取交集以增加結果的穩(wěn)定性,并繪制3個芯片DEGs的韋恩圖。

1.3 差異基因的功能注釋將DEGs導入DAVID數據庫[14](DAVID 6.8,http:://David.ncifcrf.gov)進行基因本體論(Gene Ontology,GO)功能、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,以校正后的P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。GO功能富集分析包含3個方面:細胞組分(cell component,CC)、分子功能(molecular function,MF)和生物過程(biological process,BP)。用R語言“ggplot2”包對結果進行可視化。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction network,PPI)網絡構建及核心基因篩選應用String數據庫[15](https://string-db.org/)構建DEGs的PPI網絡,篩選標準為 combined score>0.7,深入了解DEGs所對應的蛋白質在功能上的聯(lián)系,為深入認識疾病的發(fā)病機制提供依據。將PPI網絡的分析結果導入Cytoscape 3.9.0[16],應用Cytoscape的CytoHubba插件[17]和MCODE插件[18]篩選核心基因。CytoHubba插件根據節(jié)點(本研究中為基因)在網絡中的屬性進行排名,根據Degree值對基因進行排序,Degree值更高的基因更傾向于是關鍵基因。將Degree值較高的基因應用MCODE插件進行模塊分析,篩選條件為MCODE score>5,degree cutoff=2,node score cutoff= 0.2,Haircut=true,Fluff=false,Max depth=100,K-score=2。

1.5 靶點對接及中藥預測將篩選出的核心基因映射到Coremine Medical數據庫(http://www.coremine.com/),篩選出與核心基因相關的中藥,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 DEGs篩選結果基于GSE161683、GSE193128、GSE137218數據集分別獲得557、3 898、3 200個DEGs,DEGs分別以火山圖和熱圖展示(見圖1、圖2),3個數據集的共同DEGs有474個,其中包括306個上調基因,168個下調基因,DEGs韋恩圖見圖3。

圖1 DEGs的聚類熱圖

注:橫坐標軸為log2 FC,縱坐標軸表示-log10(Padj.)。

圖3 DEGs韋恩圖

2.2 DEGs的GO功能和KEGG通路富集分析結果GO功能和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),上調的DEGs主要與角化作用、殺傷其他生物的細胞、固有免疫應答、角質形成細胞分化、對病毒的防御反應等生物學過程相關,與角質包膜、細胞外區(qū)域、細胞外隙、細胞質、細胞外泌體等細胞組分相關,與絲氨酸型內肽酶活性、2′-5′-寡腺苷酸合成酶(OASs)活性、CXCR趨化因子受體結合、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶激活劑活性、趨化因子活性等分子功能相關,富集在白細胞介素-17(interleukin-17,IL-17)信號通路、核苷酸寡聚化結構域樣受體(nucleotide oligomerization domain like receptor,NLR)信號通路、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用、細胞因子-細胞因子受體相互作用、甲型流感等信號通路,見圖4。

圖4 上調DEGs的GO功能和KEGG通路富集分析

2.3 PPI的構建和關鍵基因的篩選在String數據庫中導入上調DEGs構建PPI網絡,選擇combined score>0.7為PPI關系的閾值,導出相關TSV格式文件,使用Cytoscape軟件的CytoHubba插件進行進一步分析。根據Degree值定義前15個關鍵基因:STAT1、RSAD2、IFIT3、IFI44L、IFIT1、CXCL10、MX1、CDK1、IFI44、OASL、OAS1、OAS2、OAS3、CCNA2、CCNB1。15個關鍵基因的PPI網絡見圖5。然后使用Cytoscape軟件的MCODE插件對15個關鍵基因進行模塊分析,模塊分析后得到一個重要模塊:STAT1、RSAD2、IFIT3、IFI44L、IFIT1、CXCL10、MX1、IFI44、OASL、OAS1、OAS2、OAS3,見圖6。

2.4 中藥預測結果將上述12個核心基因映射到Coremine Medical數據庫,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義,篩選治療銀屑病的潛在中藥,共篩選出中藥56種,這些中藥可能為治療銀屑病藥物的潛在來源,見表2。

表2 關鍵基因的中藥預測結果

3 討論

銀屑病是由多種遺傳及環(huán)境因素引起的慢性炎癥性皮膚病。一般認為,銀屑病是由IL-17介導的免疫疾病,涉及IL-17、IL-23、TNF-α等細胞因子[19]。在外界免疫刺激下,樹突狀細胞產生 IL-23,從而誘導Th-17等細胞產生IL-17、IL-22 和IFN-α等促炎細胞因子,誘導多種炎癥和角質形成細胞的異常增殖[20]。長期定植于外周組織的組織常駐記憶T細胞產生IL-17并促進局部的皮膚炎癥則與銀屑病的頻繁復發(fā)相關[20]。

3.1 核心基因的功能與免疫炎癥、角質形成細胞的異常增生、抗病毒感染相關遺傳是銀屑病發(fā)病的重要因素,大約40%的銀屑病或銀屑病關節(jié)炎患者有家族史[21]。全基因組關聯(lián)研究已經確定了60多個易感基因座,其中許多包含參與免疫系統(tǒng)調節(jié)的基因[22]。本研究結果提示,銀屑病患者的皮損與正常皮膚之間的基因表達存在顯著差異。富集分析提示,上調的DEGs主要與免疫炎癥及角質形成細胞的異常增生相關,還與病毒感染等銀屑病的誘發(fā)因素有關,這與既往的研究結果一致[23-24]。

STAT1和STAT3是參與調節(jié)細胞周期和免疫反應的核轉錄因子,在常見細胞因子和生長因子的下游被激活,一般認為它們之間存在拮抗作用[25]。STAT1和STAT3可通過JAK/STAT通路調節(jié)包括IL-17等細胞因子的表達,介導免疫炎癥反應。與健康人相比,尋常型銀屑病患者的STAT1、STAT3和IL-17表達水平較高,而經過烏司奴單抗治療40周后,這些基因的轉錄活性降低[26]。

RSAD2、MX1與Ⅰ型干擾素信號通路介導的固有免疫的抗病毒反應相關,IFIT3及IFIT1的抗病毒作用則與NOD樣受體信號通路相關[27]。體外實驗顯示,抑制IFIT3可降低角質形成細胞的增殖能力和CXCL1、CCL20、IL-1β和IL-6的分泌[28]。Raposo等[29]發(fā)現(xiàn),這些抗病毒基因在銀屑病皮損局部表達上調。這可以解釋為什么銀屑病患者皮損合并感染的風險顯著小于特應性皮炎患者。一方面,病毒感染、外傷等免疫刺激誘發(fā)銀屑病;另一方面,銀屑病皮損局部的抗病毒免疫增強。這一有趣的現(xiàn)象強調了在銀屑病發(fā)病過程中免疫系統(tǒng)的主導作用。目前,這些抗病毒基因在銀屑病皮損形成過程中起到的具體作用尚不明確,有待于進一步研究。

CXCL10是一種趨化因子,在銀屑病中可介導自然殺傷細胞向真皮乳頭的遷移、募集中性粒細胞和Th1細胞放大炎癥反應,角質細胞形成CXCL10依賴于STAT1。銀屑病患者血清中的CXCL10水平升高,CXCL10可作為監(jiān)測銀屑病活動的血清學標志物[24,30]。

OASs是一組具有多種抗病毒活性的IFN誘導酶家族,包括OAS1、OAS2、OAS3和OASL。在銀屑病中,OAS1、OAS2和OAS3可通過調節(jié)細胞周期和增強IFN-1誘導的JAK信號通路促進表皮角質細胞增殖[31]。

3.2 預測中藥是治療銀屑病的潛在藥物本研究篩選的可干預銀屑病的潛在中藥大致可分為5類:清熱藥(黃芩、水牛角、大青葉等)、理血藥(當歸、赤芍、牡丹皮等)、滋陰藥(何首烏、生地黃、墨旱蓮、鱉甲膠等)、燥濕藥(天南星、半夏等)和溫陽藥(淫羊藿、鹿茸等)。

既往研究提示,清熱涼血類中藥可通過降低血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和抑制表皮細胞過度增殖等改善銀屑病皮損[32-33]。黃芩苷可以通過抑制STAT1磷酸化起到抗炎作用[34],并可抑制新生血管生成[35]。芍藥總苷可通過抑制STAT1和STAT3磷酸化以抑制Th17的分化與角質形成細胞的增殖,減輕動物實驗中被誘導的銀屑病炎癥反應[36]。由生地黃、何首烏、白芍等養(yǎng)血滋陰藥組成的當歸飲子,可降低銀屑病患者外周血中IFN-γ、IL-17A的表達水平,改善銀屑病皮損[37]。淫羊藿苷可使基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶抑制物-1蛋白表達下調,可能通過此機制起到抑制銀屑病新生血管生成的作用[38]。

中醫(yī)治療銀屑病多從血論治,有血熱、血瘀、血燥等證型。一般認為,尋常型銀屑病的進行期以血熱證為主,靜止期及消退期則以血虛及血瘀為主。在銀屑病進行期,患者的皮損色鮮紅、不斷擴大,全身癥狀見舌紅苔黃、脈弦滑數、心煩燥熱、便秘溲赤等,此時當用苦寒截斷病情,扭轉病勢。在疾病發(fā)展過程中,血熱證是證型轉化的關鍵。熱邪擾動血分,毒熱煎熬陰血,氣血運行不暢而成血瘀,耗傷陰血則成血虛,生風化燥而為血燥等證型變化[39]。因此,目前關于中藥干預銀屑病的分子機制研究更多集中于清熱涼血藥物。

熱為無形之邪,濕為有形之邪。銀屑病具有皮損肥厚的特點,因頑濕聚集,則形成斑塊浸潤。濕邪所致皮膚病的病程多呈發(fā)作期與緩解期交替的過程,病程漫長,反復不愈[40]。這與銀屑病慢性易復發(fā)的病程特征相符合。銀屑病患者常合并濕邪內蘊,此時則需燥濕藥物祛除病理產物。濕邪在銀屑病反復不愈的過程中起到重要作用,是證型轉化的另一關鍵因素。濕性黏滯,濕熱伴生導致熱邪內伏,疾病纏綿不愈或反復發(fā)作;濕邪阻滯津液輸布代謝,濕邪日久作為病理因素導致陰虛的生成。

銀屑病患者皮損多表現(xiàn)為冬重夏輕,日光浴作為輔助療法有助于銀屑病緩解,這提示在“熱、瘀、濕”等實邪之外,患者尚有陽虛的一面[41]。衛(wèi)陽虧虛則皮損多由外感誘發(fā);冬季腠理閉塞,陽氣難以外達,則皮損加重;夏季或日光浴促使腠理疏通,陽氣外達,則皮損易愈。既往研究顯示,陽虛外寒證占尋常型銀屑病27%左右[42]。多種因素可導致銀屑病患者成為陽虛證:一方面為素體陽氣虧虛;另一方面,長期應用清熱涼血藥物、久病陰損及陽、不適當應用激素及免疫抑制劑導致元氣虛損。對于陽虛型銀屑病患者而論,陽虛為本虛,血熱為標實,其病情復雜,為本虛標實之證。其“火”為“虛火”“伏火”,平素陽氣相對充實,則伏火潛藏不發(fā)病;若因種種誘因傷及陽氣,陽虛則伏火不能潛藏,虛陽浮越而發(fā)為熱毒,表現(xiàn)為肌膚腠理的“血熱”。此時若僅清熱涼血則更傷陽氣,因此需補益脾腎陽氣,元陽充盛則虛火不生,衛(wèi)陽充盛則可御外邪、腠理調和。

本研究的結果與臨床治療銀屑病的方向大致相同,養(yǎng)陰清熱與溫陽看似相反的治療方向,卻是對于不同病機患者的最恰當治療方式,突出中醫(yī)“辨證論治”的特點和優(yōu)勢。生物信息學分析的結果也提示,“清熱類”與“溫陽類”等藥物通過不同靶點均能對銀屑病皮損起到有效干預的可能,為中醫(yī)藥辨證治療銀屑病提供了理論依據。另外,本研究結果中部分藥物在臨床上并不常用或較少應用于銀屑病的治療,為開發(fā)銀屑病新藥提供參考。目前,關于中藥治療銀屑病的機制研究主要集中在清熱解毒、涼血活血類藥物方面,對于燥濕化痰和溫陽補腎類藥物治療銀屑病的分子機制尚須更多研究證實。

本研究提示,銀屑病患者皮損中上調的DEGs主要參與免疫炎癥、角質形成細胞的異常增生、抗病毒感染等生物學過程,涉及IL-17、NOD樣受體、病毒感染等信號通路,其中的關鍵基因在銀屑病皮損的形成過程中起到核心作用,預測的中藥為治療銀屑病的潛在藥物,為后續(xù)銀屑病分子機制及其藥物的研究提供了潛在靶標,未來尚需實驗驗證相關中藥及其活性成分的作用,進一步探索銀屑病的潛在治療靶點。