王艷梅,董浩然

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院/河南省中醫(yī)院,河南 鄭州 450002; 2.河南中醫(yī)藥大學(xué),河南 鄭州 450046

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)具有高發(fā)病率和高病死率,已經(jīng)成為全球公共衛(wèi)生的重大挑戰(zhàn)[1-2]。COPD的主要癥狀包括咳嗽、咳痰、喘息和胸悶等,歸屬于“肺脹”“喘證”“咳嗽”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,COPD的病因?yàn)樘禑巅辗?濁痰內(nèi)蘊(yùn)于肺,肺氣阻滯導(dǎo)致血瘀;病機(jī)為外邪襲肺,導(dǎo)致肺氣不宣、升降失司,因而喘咳不止。COPD穩(wěn)定期以本虛為主,治療應(yīng)固本培元、調(diào)理肺氣、宣肺化痰[3]。中醫(yī)藥在治療COPD方面具有顯著優(yōu)勢(shì),副作用少,遠(yuǎn)期療效較好。

陳皮(CitrusReticulata)-紫蘇子(PerillaeFructus)是臨床治療COPD的常用藥對(duì),陳皮味辛、苦,性溫,歸脾、肺經(jīng),具有燥濕化痰、理氣宣肺的功效;紫蘇子味辛,性溫,歸肺、大腸經(jīng),能夠降氣疏壅、祛痰止咳[4]。陳皮與紫蘇子聯(lián)用,一升一降,調(diào)節(jié)肺之宣發(fā)與肅降,治節(jié)得伸而諸氣皆順,邪有路出,疾病得以緩解。目前,陳皮、紫蘇子配伍治療COPD的作用機(jī)制尚未明確,因此本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討陳皮-紫蘇子藥對(duì)治療COPD的作用機(jī)制,并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,以評(píng)估相關(guān)活性成分的藥理作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞THP-1細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院研究院細(xì)胞資源中心,編號(hào):SCSP-567。

1.2 藥物與試劑柚皮素、川陳皮素(批號(hào):MUST-18050808、MUST-16070901)購自成都曼思特生物科技有限公司;木犀草素、花生四烯酸、β-谷甾醇(批號(hào):C29N10Q104574、Q16M11Q111761、R21O8F6338)購自上海源葉生物科技有限公司;白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒(BD公司,貨號(hào):9249866);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)ELISA試劑盒(R&D Systems,貨號(hào):P302933);脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(Sigma,貨號(hào):039M4004V);乙酸佛波酯(phorbol myristate acetate,PMA)(MCE,貨號(hào):HY-1873)。

1.3 儀器Synergy HTX型全波長酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK公司);SQP型電子天平(德國Sartorius公司);3131型CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);iCytal型細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(中國卓微公司);1300 A2型生物安全柜(美國Thermo公司);Primo Vert型倒置生物顯微鏡(德國ZEISS公司)。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.1.1 陳皮-紫蘇子活性成分與作用靶點(diǎn)篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索陳皮、紫蘇子的化學(xué)成分與作用靶點(diǎn),以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性(drug likeness,DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選,并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道加以補(bǔ)充。借助Uniprot(https://www.uniprot.org)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org)數(shù)據(jù)庫獲取作用靶點(diǎn)的規(guī)范基因名稱。

2.1.2 陳皮-紫蘇子核心成分篩選利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),篩選度值(Degree)排名前5位的化合物,將其作為陳皮-紫蘇子藥對(duì)的核心成分。

2.1.3 COPD相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及交集靶點(diǎn)獲取以“Chronic Obstructive Pulmonary Disease”為關(guān)鍵詞,通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索COPD相關(guān)靶點(diǎn),并篩選Relevance score≥40的靶點(diǎn)。通過微生信平臺(tái)(https://www.bioinformatics.com.cn/)繪制陳皮-紫蘇子作用靶點(diǎn)與COPD相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖,得到交集靶點(diǎn)。

2.1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選將藥物與COPD的交集靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(https://www.string-db.org/),物種設(shè)置為“Homo sapiens”,置信度為0.7,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),篩選大于平均度值的靶點(diǎn)作為陳皮-紫蘇子藥對(duì)治療COPD的核心靶點(diǎn)。

2.1.5 基因本體(Gene Ontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析基于藥物與COPD的交集靶點(diǎn),通過Metascape數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO分析(P<0.05)和KEGG分析(P<0.05)。富集結(jié)果根據(jù)P值進(jìn)行升序排序,并利用微生信在線平臺(tái)繪制高級(jí)氣泡圖。

2.1.6 核心成分-核心靶點(diǎn)分子對(duì)接從RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載核心靶點(diǎn)的PDB結(jié)構(gòu),將其作為受體;通過TCMSP數(shù)據(jù)庫和PumChem數(shù)據(jù)庫獲取核心成分的3D結(jié)構(gòu),將其作為配體;利用Autodock軟件進(jìn)行分子對(duì)接,使用Discovery Studio軟件構(gòu)建分子對(duì)接模擬圖。

2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

2.2.1 藥物制備使用萬分之一天平分別稱取木犀草素2 mg、β-谷甾醇5 mg、柚皮素5 mg、川陳皮素4 mg、花生四烯酸4 mg,使用二甲基亞砜(DMSO)配制成質(zhì)量濃度為40 g·L-1木犀草素、50 g·L-1β-谷甾醇、50 g·L-1柚皮素、40 g·L-1川陳皮素、40 g·L-1花生四烯酸儲(chǔ)備液備用,正式實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋成相應(yīng)濃度。

2.2.2 分組、造模及給藥THP-1細(xì)胞采用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基,在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將THP-1細(xì)胞接種于24孔板,調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105mL-1,PMA(20 μg·L-1)誘導(dǎo)12 h,分為空白組、模型組、木犀草素組、β-谷甾醇組、柚皮素組、川陳皮素組。除空白組外,其余各組加入LPS(2 mg·L-1)建立細(xì)胞炎癥模型;在此基礎(chǔ)上,木犀草素組加入不同濃度木犀草素(0.25 mg·L-1、0.5 mg·L-1、1 mg·L-1、2 mg·L-1),β-谷甾醇組加入不同濃度β-谷甾醇(1.56 mg·L-1、3.13 mg·L-1、6.25 mg·L-1、12.5 mg·L-1),柚皮素組加入不同濃度柚皮素(3.13 mg·L-1、6.25 mg·L-1、12.5 mg·L-1、25 mg·L-1),川陳皮素組加入不同濃度川陳皮素(2 mg·L-1、4 mg·L-1、8 mg·L-1、16 mg·L-1),花生四烯酸組加入不同濃度花生四烯酸(1 mg·L-1、2 mg·L-1、4 mg·L-1、8 mg·L-1),各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h。

2.2.3 ELISA檢測(cè)細(xì)胞IL-6和TNF-α含量收集細(xì)胞上清液,1 000 r·min-1離心5 min,取上清。按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作,檢測(cè)各組細(xì)胞炎癥因子IL-6、TNF-α含量。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果

3.1.1 陳皮-紫蘇子活性成分與作用靶點(diǎn)通過 TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選陳皮、紫蘇子的活性成分和作用靶點(diǎn),結(jié)果顯示,陳皮活性成分5個(gè)(谷甾醇、柚皮素、川陳皮素等),作用靶點(diǎn)91個(gè);紫蘇子活性成分14個(gè)(豆甾醇、花生四烯酸、木犀草素等),作用靶點(diǎn)223個(gè),見表1。

表1 “陳皮-紫蘇子”活性成分與作用靶點(diǎn)信息

3.1.2 “藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)及核心成分基于陳皮-紫蘇子藥對(duì)的19個(gè)活性成分及其作用靶點(diǎn),利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),見圖1。拓?fù)浞治鲲@示,Degree值排名前5位的化合物分別是紫蘇子中的木犀草素、β-谷甾醇、花生四烯酸,陳皮中的柚皮素、川陳皮素,他們可能是陳皮-紫蘇子藥對(duì)的核心成分。

注:CP:陳皮;ZSZ:紫蘇子。

3.1.3 COPD相關(guān)靶點(diǎn)及陳皮-紫蘇子抗COPD潛在靶點(diǎn)通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到288個(gè)COPD相關(guān)靶點(diǎn);利用微生信平臺(tái)繪制韋恩圖,得到34個(gè)交集靶點(diǎn),將其作為陳皮-紫蘇子藥對(duì)干預(yù)COPD的潛在靶點(diǎn),見圖2A。

注:A:交集靶點(diǎn)韋恩圖;B:交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

3.1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)及陳皮-紫蘇子抗COPD核心靶點(diǎn)針對(duì)34個(gè)潛在靶點(diǎn)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),該網(wǎng)絡(luò)包括34個(gè)節(jié)點(diǎn)、208條邊。根據(jù)平均度值篩選得到16個(gè)核心靶點(diǎn),包括IL-6、TNF、血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)等,見圖2B。

3.1.5 KEGG通路分析和GO功能分析KEGG富集分析得到13條通路(P<0.05),主要包括白細(xì)胞介素-17(interleukin-17,IL-17)信號(hào)通路、細(xì)胞因子受體互作通路、低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)信號(hào)通路、AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)信號(hào)通路、內(nèi)吞與鐵死亡等,見圖3A。GO富集分析得到3550個(gè)生物過程(biological process,BP)、385個(gè)分子功能(molecular function,MF)、264個(gè)細(xì)胞組成(cellular component,CC)。其中,BP主要涉及蛋白質(zhì)磷酸化調(diào)控、平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)、凋亡信號(hào)通路、激酶活性的調(diào)節(jié)、組織重塑、白細(xì)胞分化等;MF主要涉及細(xì)胞因子活性、磷酸酶結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、激酶調(diào)節(jié)活性、ATP酶結(jié)合等;CC主要涉及膜筏、細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)吞囊泡、細(xì)胞膜、細(xì)胞連接、IL-6受體復(fù)合物、TNF受體超家族復(fù)合體、PML小體等,其中一些功能已被證明與COPD的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[5-8],見圖3B—3D。

注:A:KEGG通路圖;B:BP分析圖;C:CC分析圖;D:MF分析圖。

3.1.6 分子對(duì)接一般認(rèn)為,分子對(duì)接結(jié)合能小于-4.25 kcal·mol-1表示有親和力,小于 -5.0 kcal·mol-1表示結(jié)合活性較好,小于 -7.0 kcal·mol-1表示結(jié)合活性較強(qiáng),且結(jié)合能越低代表配體與受體的結(jié)合能力越強(qiáng)[9]。將核心成分(木犀草素、β-谷甾醇、花生四烯酸、柚皮素、川陳皮素)與核心靶點(diǎn)(IL-6、TNF)進(jìn)行分子對(duì)接,結(jié)果顯示,結(jié)合能均小于-4.25 kcal·mol-1,見圖4、表2。

圖4 核心成分-核心靶點(diǎn)分子對(duì)接模擬圖

表2 分子對(duì)接結(jié)果

3.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果與正常組比較,模型組IL-6、TNF-α含量升高(P<0.01);與模型組比較,各濃度柚皮素組IL-6、TNF-α含量均降低(P<0.01,P<0.05),見圖5A、5F;與模型組比較,各濃度川陳皮素組IL-6、TNF-α含量均降低(P<0.01,P<0.05),見圖5B、5G;與模型組比較,各濃度β-谷甾醇組IL-6、TNF-α含量均降低(P<0.01,P<0.05),見圖5C、5H;與模型組比較,各濃度木犀草素組IL-6、TNF-α含量均降低(P<0.01,P<0.05),見圖5D、5I;與模型組比較,各濃度花生四烯酸組IL-6、TNF-α含量均降低(P<0.01,P<0.05),見圖5E、5J。

注:A-E:各組細(xì)胞IL-6含量;F-J:各組細(xì)胞TNF-α含量。與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

4 討論

COPD通常由長期暴露于有害顆?；驓怏w,引起氣道和(或)肺泡異常[10],導(dǎo)致肺部慢性炎癥,進(jìn)而出現(xiàn)持續(xù)氣流受限、咳喘、咳痰等呼吸系統(tǒng)癥狀,炎癥消退是病情治愈的關(guān)鍵。COPD患者氣道上皮受損,產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子,引發(fā)氣道炎癥反應(yīng),臨床上以咳嗽、咳痰最為常見[11]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,“肺為貯痰之器”,痰濁最易內(nèi)停于肺,影響肺的宣發(fā)、肅降功能。COPD的病變主要在肺,以氣虛衰弱為本、寒飲內(nèi)停為標(biāo)?；颊叨嘁蚰昀象w衰,長期氣血虧虛、肺氣郁滯,加上外邪入侵,入里化熱,痰熱壅肺導(dǎo)致肺氣宣降不利[12]。因此,治療應(yīng)以宣肺通氣為主,通過祛邪宣肺、降氣化痰、活血化瘀等方法,消除痰壅氣逆,緩解咳嗽、氣喘等癥狀。

陳皮-紫蘇子是治療COPD的常用藥對(duì),經(jīng)典方劑蘇子降氣湯[13-14]、華蓋散[15-16]中均有兩藥配伍應(yīng)用。陳皮、紫蘇子均具有理氣化痰、止咳平喘的功效;紫蘇子性潤,擅長理氣化痰、溫中降逆;陳皮性燥,擅長理氣化痰、理氣和胃;二者合用,燥潤相得,既不傷陰,又能潤燥化痰。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析陳皮-紫蘇子藥對(duì)治療COPD的作用機(jī)制,篩選出5個(gè)核心成分,即木犀草素、β-谷甾醇、花生四烯酸、柚皮素和川陳皮素。木犀草素具有祛痰、止咳、消炎等作用,能改善COPD患者肺功能,降低血清IL-6含量[17];同時(shí),其可抑制急性肺損傷小鼠細(xì)胞焦亡,減輕肺損傷[18],并緩解新生敗血癥小鼠肺損傷[19]。β-谷甾醇通過抑制Ⅱ型免疫反應(yīng)和膠原蛋白沉積從而改善氣道炎癥和氣道重塑[20],通過抑制白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)表達(dá)改善小鼠肺部炎癥反應(yīng)[21],同時(shí)能夠減輕哮喘小鼠的肺部炎癥[22]。柚皮素可通過抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)從而保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷[23],并能通過調(diào)控巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體活化改善急性肺損傷[24]。川陳皮素可抑制核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信號(hào)通路從而改善小鼠急性肺損傷炎癥反應(yīng)[25]。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)挖掘出16個(gè)陳皮-紫蘇子藥對(duì)治療COPD的核心靶點(diǎn),其中多個(gè)靶點(diǎn)與炎癥反應(yīng)相關(guān),如IL-6、TNF、白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)等。研究表明,氣道炎癥因子與細(xì)胞相互作用可促進(jìn)COPD的發(fā)生與發(fā)展,并可誘發(fā)COPD急性加重[26-28]。Vitenberga等[29]發(fā)現(xiàn),COPD患者支氣管組織中IL-6、TNF-α表達(dá)水平升高。Kleniewska等[30]研究表明,在COPD患者的急性加重期,痰和血清中IL-6、TNF-α濃度升高。IL-6能夠誘導(dǎo)急性反應(yīng),快速產(chǎn)生IL-6有助于增強(qiáng)機(jī)體在感染或組織損傷期間的防御能力[31]。IL-6是預(yù)測(cè)COPD急性加重的有效指標(biāo),對(duì)于COPD的診斷和治療具有重要意義[32]。TNF-α與肺部炎癥密切相關(guān),血清TNF-α水平與COPD患者的病情緩解程度呈負(fù)相關(guān)[33]。

陳皮-紫蘇子藥對(duì)治療COPD主要作用于 HIF-1信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路、內(nèi)吞作用及鐵死亡等通路。已有研究證實(shí),這些通路與COPD的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。HIF-1高表達(dá)可能與肺功能下降和生活質(zhì)量下降有關(guān)[34]。HIF-1信號(hào)通路激活可能參與COPD的病理生理過程,穩(wěn)定HIF-1表達(dá)有助于減輕組織炎癥,降低血清HIF-1濃度可延緩COPD病情進(jìn)展[35]。IL-17 細(xì)胞因子家族包括多個(gè)成員,如IL-17A、IL-17C,能夠介導(dǎo)COPD的炎癥反應(yīng),造成肺部炎癥和組織損傷[36]。AMPK是COPD的潛在治療靶點(diǎn),能夠減少異常炎癥反應(yīng)和細(xì)胞衰老[37]。在COPD的病情發(fā)展中,巨噬細(xì)胞的吞噬功能缺陷可導(dǎo)致未能清除的細(xì)胞發(fā)生繼發(fā)性壞死,從而激發(fā)氣道炎癥[38]。鐵死亡是一種鐵依賴性的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡方式,鐵穩(wěn)態(tài)破壞與COPD的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[39]。

綜上所述,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討陳皮-紫蘇子藥對(duì)干預(yù)COPD的潛在機(jī)制。通過分子對(duì)接技術(shù)評(píng)估藥物活性成分與核心靶點(diǎn)的親和力,并結(jié)合體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這些活性成分的抗炎作用。陳皮-紫蘇子藥對(duì)可通過多成分、多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮治療COPD的作用,其機(jī)制可能與抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。