周巖 豆發(fā)福 周亞?wèn)| 沈振

在許多疾病中,微小RNAs(miRNAs)似乎是一個(gè)很有前途的靶分子[1]。研究表明,人體各種體液中存在大量無(wú)細(xì)胞miRNAs,可用于結(jié)直腸癌(CRC)早期診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)[2]。本研究采用微陣列分析和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證對(duì)CRC病人和非癌對(duì)照者的血清樣本進(jìn)行分析,識(shí)別最可能用于CRC篩查或早期檢測(cè)的新型、基于血清的生物標(biāo)志物。

對(duì)象和方法

一、對(duì)象

2019年4月～2021年3月我院CRC病人手術(shù)組織和血清樣本75例(CRC組),男性40例,中位年齡67.8歲。同期20例因腹股溝疝而接受手術(shù)的病人組織和血清樣本20例(對(duì)照組),男性14例,中位年齡65.2歲。CRC病人均行手術(shù)治療,包括開(kāi)腹手術(shù)、結(jié)腸切除術(shù)或僅進(jìn)行組織病理學(xué)分析的活組織檢查(不進(jìn)行切除);均經(jīng)病理和細(xì)胞學(xué)診斷證實(shí)。腫瘤體積為64.0 cm3(范圍:1.0～1 650 cm3)。排除自身免疫性疾病、心血管疾病、嚴(yán)重肝腎疾病、血液病和傳染病,以及服用免疫抑制藥物者。本研究獲得了醫(yī)院機(jī)構(gòu)審查委員的批準(zhǔn)。所有研究者均簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

二、方法

1.標(biāo)本采集:在術(shù)前24小時(shí)和術(shù)后第3天,采集5 ml空腹外周血樣本,4 ℃下以1 500 r/min離心10分鐘,儲(chǔ)存在-80 ℃,待檢。

2.血清和組織miRNAs提取:將1 ml血清或10 μg組織樣本與750 μl Trizol LS試劑混合,純化總RNA后,10 μl無(wú)核酸酶水溶解。采用NanoDrop N-100分光光度計(jì)和Quanti-iT核糖綠RNA分析試劑盒測(cè)定RNA濃度。采用Agilent 2100生物分析儀和小型RNA微陣列分析RNA質(zhì)量。

3.miRNA微陣列分析:采用安捷倫miRNA標(biāo)記試劑用pCp-Cy3標(biāo)記總RNA,與人類miRNA寡核苷酸微陣列雜交。基因表達(dá)洗滌緩沖液試劑盒洗滌陣列,并用安捷倫DNA微陣列掃描儀掃描。采用特征提取軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)字轉(zhuǎn)換后,采用GeneSpring GX軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。將微陣列上斑點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)化為陣列的總信號(hào)強(qiáng)度,并以百分比表示。

4.qRT-PCR驗(yàn)證 :采用MultiScribe逆轉(zhuǎn)錄酶和miRNA特異性引物對(duì)血清miRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用TaqMan microRNA試劑盒和7300實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)通過(guò)實(shí)時(shí)PCR對(duì)miR-141進(jìn)行定量。評(píng)估樣本中miR-141相對(duì)檢測(cè)水平,以2-ΔΔCT法計(jì)算。Cel-miR-39作為內(nèi)標(biāo)物。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0軟件分析數(shù)據(jù)。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位值(四分位距)描述,采用Mann-Whitney檢驗(yàn)或Wilcoxon檢驗(yàn)。二分類變量用例(頻數(shù))描述,進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。miR-142-3p診斷CRC的最佳截止值用受試者工作特征(ROC)曲線和曲線下面積(AUC)確定。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1.miRNAs微陣列分析:在所有檢測(cè)的組織樣本中,共檢測(cè)到164個(gè)miRNA,其中CRC組織樣本中69個(gè)miRNAs顯著上調(diào)(P<0.05,圖1A);此外,CRC血清樣本中52個(gè)miRNAs的表達(dá)量高于對(duì)照組(P<0.05,圖1B)。然而只有12種miRNAs同時(shí)在CRC組織和血清樣本中表達(dá)上調(diào),其中miR-141上調(diào)最顯著(圖1C)。

2.qRT-PCR檢測(cè)血清樣本中miR-141表達(dá)水平:CRC組病人術(shù)前血清miR-141相對(duì)表達(dá)量顯著高于非癌對(duì)照組[2.50(1.06,3.12)vs.0.97(0.68,1.21),Z=-5.842,P<0.05]。經(jīng)ROC曲線分析,術(shù)前血清miR-141用于診斷CRC的AUC為0.927(95%CI:0.862～0.992,圖2A),當(dāng)血清miR-141≥1.418時(shí),用于區(qū)分CRC組和非癌對(duì)照組人群時(shí)的準(zhǔn)確性為90.53%,敏感性和特異性分別為89.33%和95.0%。當(dāng)血清癌胚抗原(CEA)和糖類抗原-199(CA-199)高于正常閾值(CEA≥5 ng/ml,CA-199≥37 U/ml)時(shí),CRC診斷的準(zhǔn)確性分別為62.11%和63.16%。聯(lián)合檢測(cè)血清miR-141、CEA、CA-199,可將常規(guī)腫瘤標(biāo)志物(CEA+CA-199)的診斷AUC值提高至0.944(95%CI:0.899～0.998,圖2B)。

A:血清miR-141診斷CRC的ROC曲線; B:血清miR-141、CEA、CA-19-9三者聯(lián)合診斷CRC的ROC曲線圖

3.手術(shù)對(duì)血清miR-141表達(dá)的影響:對(duì)照組術(shù)后血清miR-141相對(duì)表達(dá)量為0.84(0.74,1.02),與術(shù)前[0.97(0.68,1.21)]比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CRC組術(shù)后血清miR-141相對(duì)表達(dá)量為1.90(1.32,2.28),低于術(shù)前[2.50(1.06,3.12),P<0.05]。對(duì)于CRC組病人,接受根治性切除者術(shù)后血清miR-141相對(duì)表達(dá)量顯著低于術(shù)前[1.85(1.29,2.22)vs.2.55(2.07,3.18),P<0.05],對(duì)于未接受根治性切除術(shù)者,術(shù)后血清miR-141相對(duì)表達(dá)量略低于術(shù)前[2.28(1.72,2.74)vs.2.45(2.06,2.85)],但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

4.CRC病人術(shù)前血清miR-141表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系:根據(jù)血清miR-141表達(dá)水平的中位值,將CRC病人分為低表達(dá)亞組(≤2.50,37例)和高表達(dá)亞組(>2.50,38例)。CRC病人血清miR-141表達(dá)水平與腫瘤UICC分期、Dukes分期和組織學(xué)分級(jí)有關(guān)(P<0.05),與其他臨床特征無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 CRC病人術(shù)前血清miR-141表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系(例)

討論

miRNA在癌癥中表達(dá)及臨床意義是目前研究熱點(diǎn)之一[1-2]。本研究結(jié)果表明,164種miRNAs在CRC組織中表達(dá)上調(diào),然而其中多數(shù)miRNAs的內(nèi)源性表達(dá)水平在CRC組血清樣本中沒(méi)有上調(diào),這表明腫瘤組織和血清樣本中miRNAs表達(dá)譜并不完全一致,CRC細(xì)胞似乎只是將一部分miRNAs分泌到體液循環(huán)中。miR-141是一種與癌癥相關(guān)的miRNA,它在CRC組織樣本和血清中均表達(dá)上調(diào),這表明miR-141可能參與CRC的發(fā)生和進(jìn)展,而且血清miR-141對(duì)于CRC診斷的準(zhǔn)確性較高。

CRC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲是一個(gè)多基因參與的過(guò)程,其中包括腫瘤抑制基因的失活和癌基因的激活[3]。miRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)癌基因或抑癌基因,在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡和耐藥性等惡性過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4-5]。研究表明,miR-141可以調(diào)節(jié)各種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能,但是不同組織中miR-141的調(diào)控作用存在較大差異。例如,與非骨轉(zhuǎn)移性前列腺癌比較,miR-141在骨轉(zhuǎn)移性前列腺癌中表達(dá)下調(diào),且miR-141通過(guò)抑制前列腺癌骨轉(zhuǎn)移中的NF-κB通路發(fā)揮腫瘤抑制作用[6]。Li等[7]研究發(fā)現(xiàn),miR-141可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。有研究表明,miR-141在多種癌癥中上調(diào),并作為致癌miRNA發(fā)揮作用。Li等[8]研究發(fā)現(xiàn),宮頸癌組織中miR-141表達(dá)高于正常宮頸組織。miR-141過(guò)度表達(dá)也被證明能促進(jìn)鼻咽癌、卵巢癌和CRC的生長(zhǎng)[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn),miR-141在CRC組織和血清中的表達(dá)上調(diào),且與腫瘤分期和組織分化有關(guān),說(shuō)明miR-141可能是CRC診斷和治療的候選靶點(diǎn)。

手術(shù)切除原發(fā)性腫瘤灶后,CRC血清miR-141水平顯著下調(diào),表明miR-141是由腫瘤細(xì)胞分泌的,當(dāng)然并不能排除miR-141也由其他細(xì)胞分泌的可能性。ROC曲線確定miR-141的高靈敏度和特異性,說(shuō)明其可作為診斷生物標(biāo)志物的使用。當(dāng)血清miR-141≥1.418時(shí),區(qū)分CRC組和對(duì)照組人群的準(zhǔn)確性為90.53%。而CEA、CA-199診斷的準(zhǔn)確性僅為62.11%和63.16%[11],聯(lián)合檢測(cè)血清miR-141、CEA、CA-199可提高常規(guī)腫瘤標(biāo)志物的臨床診斷價(jià)值。

本研究證實(shí)了miR-141對(duì)于CRC的診斷有較高的準(zhǔn)確性,但缺少隨訪證據(jù),無(wú)法證實(shí)其在病人預(yù)后中的作用。本研究只能間接解釋血清中部分miR-141來(lái)源于腫瘤組織,但是其來(lái)源問(wèn)題尚不能完全明確。

總之,血清miR-141對(duì)CRC的診斷具有良好的敏感性和特異性,聯(lián)合常規(guī)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)可提高常規(guī)腫瘤標(biāo)志物的診斷準(zhǔn)確性。