吳琦琦，劉軼，周明，李帥，李曉燕，劉雁鳴，文亮（湖南省藥品檢驗(yàn)檢測研究院，長沙 410001）

美沙拉秦（嗪），化學(xué)名為5-氨基-2-羥基苯甲酸[1-2]，是臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病的一線藥物[3-4]。由瑞典PharmaciaAB公司開發(fā)，于英國TillotsLabs公司1985年首次上市。目前國內(nèi)共有3家企業(yè)生產(chǎn)。本品已知雜質(zhì)共有16種[5]，大多含有硝基苯或氨基苯結(jié)構(gòu)片段，具有潛在的基因毒性。通過基因毒性預(yù)測軟件Derek和Sarah分析，其雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E、雜質(zhì)I、雜質(zhì)J、雜質(zhì)M、雜質(zhì)N、雜質(zhì)S均為陽性，其中雜質(zhì)A為對氨基酚，因可誘導(dǎo)DNA的斷裂而具有明確的遺傳毒性?！稓W洲藥典》對這些雜質(zhì)進(jìn)行了嚴(yán)格的控制；而國內(nèi)現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有3個，部分標(biāo)準(zhǔn)缺失有關(guān)物質(zhì)項，部分標(biāo)準(zhǔn)雜質(zhì)檢出能力差，可能會存在質(zhì)量風(fēng)險。潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病根治困難、易反復(fù)發(fā)作，一旦患病，往往需要長期服藥[6]。因此，亟須對其首選藥物——美沙拉秦（嗪）腸溶片上市后的安全性、有效性及質(zhì)量可控性進(jìn)行相關(guān)的評價性研究[7]。

1 儀器與試藥

Agilent1260高效液相色譜儀、Agilent 1260 2D-6120二維液質(zhì)聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；梅特勒托利多V20水分測定儀（瑞士梅特勒托利多公司）；瑞士萬通XP205電子天平（精度0.01 mg）。

美沙拉秦（嗪）腸溶片：企業(yè)1（51批次樣品）、企業(yè)2（32批次樣品）、企業(yè)3（32批次樣品）；甲醇為色譜純，磷酸氫二鉀、10%四丁基氫氧化銨水溶液為分析純，水為純化水。

2 方法

2.1 液相色譜條件

色譜柱為Agilent1 C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相A為磷酸鹽緩沖液（取磷酸氫二鉀4.35 g，加水溶解并稀釋至1000 mL，用磷酸調(diào)pH值至7.2）-TBAH溶液[取10%四丁基氫氧化銨水溶液80 mL，加水稀釋至200 mL，用硫酸溶液（1→2）調(diào)節(jié)pH值至7.5]-甲醇-水（250∶50∶100∶600）；流動相B為磷酸鹽緩沖液-TBAH溶液-甲醇-水（250∶50∶500∶200），按表1梯度洗脫，流速為1.0 mL·min－1；柱溫為40℃；檢測波長為240 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution

2.2 質(zhì)譜參數(shù)

采用ESI離子源、正離子及負(fù)離子全掃描模式，m/z范圍為70～1000，掃描時間0.2 s，噴霧電壓2.5 kV，去溶劑溫度500℃，去溶劑氣體800 L·h－1。

2.3 溶液的制備

取供試品10片，研細(xì)，精密稱取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于美沙拉秦40 mg），置100 mL量瓶中，加甲醇20 mL和0.2 mol·L－1磷酸二氫鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液0.5 mL，置500 mL量瓶中，用0.2 mol·L－1磷酸二氫鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液。臨用時新制。

3 結(jié)果

3.1 雜質(zhì)譜

采用“2.1”項下條件對115批美沙拉秦（嗪）腸溶片樣品進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖1所示。主要檢出4種雜質(zhì)，雜質(zhì)3為歐洲藥典中雜質(zhì)G，3家企業(yè)樣品均有檢出，其余為未知雜質(zhì)，且均為企業(yè)1生產(chǎn)的樣品特有。各雜質(zhì)含量測定結(jié)果如表2所示。

圖1 美沙拉秦（嗪）腸溶片雜質(zhì)譜Fig 1 Impurity spectrum of mesalazine enteric-coated tablets

表2 各雜質(zhì)含量測定結(jié)果(%)Tab 2 Content of impurities (%)

3.2 雜質(zhì)1、雜質(zhì)2來源分析

首先考慮是否為原輔料引入。各企業(yè)所用原輔料如表3所示。將企業(yè)1所用原輔料分別采用“2.1”項下條件測定，結(jié)果如圖2所示，均無該3個雜質(zhì)峰，證明不是原輔料直接引入。

圖2 企業(yè)1原輔料色譜圖Fig 2 API and excipients chromatograms of enterprise 1

表3 美沙拉秦(嗪)腸溶片處方Tab 3 Prescription of mesalazine enteric-coated tablets

從該企業(yè)的留樣庫里調(diào)取了5批留樣（均為本次研究涉及的批次），采用“2.1”項下條件進(jìn)樣測定，結(jié)果與市售樣品一致。提示該雜質(zhì)可能在出廠時已經(jīng)存在，不由儲存產(chǎn)生。

取處方量的原輔料進(jìn)行壓片前工藝的模擬，分別于原輔料混合、制粒、60℃干燥3 h 3個步驟取樣測試。結(jié)果如圖3所示，從原輔料混合后，雜質(zhì)1就開始出現(xiàn)，并在制粒、干燥后該雜質(zhì)逐漸增多。

圖3 企業(yè)1制粒過程樣品色譜圖Fig 3 Chromatogram of sample pelletizing process from enterprise 1

對比3家企業(yè)所用輔料，發(fā)現(xiàn)乳糖、微晶纖維素和滑石粉是企業(yè)1所特有，分析乳糖的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，乳糖是由葡萄糖及半乳糖所組成的雙糖，即由葡萄糖的第四個碳原子上的羥基與半乳糖中第一個碳原子的β-半縮醛羥基失水成苷鍵而得。因此仍然保持著葡萄糖分子上所含醛基的還原性。如圖4所示，美沙拉秦結(jié)構(gòu)中含有伯胺基，在加熱的條件下能與還原糖發(fā)生羰氨反應(yīng)（Maillard反應(yīng)），氨基與羰基縮合生成席夫堿。溫度20～25℃即可發(fā)生Maillard反應(yīng)，一般每相差10℃，反應(yīng)速度相差3～5倍，30℃以上速度加快，高于80℃時，反應(yīng)速度受溫度和氧氣影響小。水分含量在10%～15%時，反應(yīng)易發(fā)生。該企業(yè)工藝參數(shù)顯示，本品為濕法制粒，干燥溫度為60℃，均利于Maillard反應(yīng)的發(fā)生。

圖4 乳糖與美沙拉秦的反應(yīng)Fig 4 Reaction of lactose with mesalazine

用“2.2”項下方法測試雜質(zhì)1的分子量，如圖5所示，在負(fù)離子模式下，分子離子峰質(zhì)荷比為476，正離子模式下，分子離子峰的質(zhì)荷比為478，證明該雜質(zhì)的分子量為477。乳糖的分子量為342，美沙拉秦的分子量為153，兩者縮合脫水后的分子量恰好就是477。雜質(zhì)2與雜質(zhì)1質(zhì)荷比相同，可能為雜質(zhì)1的異構(gòu)體。

圖5 雜質(zhì)1質(zhì)譜圖Fig 5 Mass spectrum of impurity 1

綜上所述，雜質(zhì)1可能為輔料乳糖與美沙拉秦原料在生產(chǎn)過程中發(fā)生了Mailard而產(chǎn)生的。

3.3 雜質(zhì)4來源分析

與同企業(yè)未檢出雜質(zhì)4批次的樣品比較，檢出雜質(zhì)4的樣品除去包衣后的片芯顏色都偏深，且片子硬度偏軟，其水分分別為3.24%與3.41%。于企業(yè)1留樣庫里調(diào)取了同批次的留樣進(jìn)行測定，結(jié)果如表4所示。從企業(yè)留樣庫里調(diào)取的同樣批次的樣品均未檢出雜質(zhì)4，片芯顏色均顯類白色，且片子硬度較大，水分值分別為1.94%與2.08%。提示樣品在流通儲存過程中發(fā)生了變化（硬度變小，水分增加），該雜質(zhì)可能于流通儲存環(huán)節(jié)中產(chǎn)生。

表4 不同來源美沙拉秦樣品中雜質(zhì)4的檢測情況Tab 4 Detection of impurity 4 in mesalazine samples from different sources

將美沙拉秦原料及3個企業(yè)的樣品分別進(jìn)行高溫、高濕、光照、高溫＋高濕四種條件的影響因素試驗(yàn)，結(jié)果如表5所示。在單獨(dú)的光照、高溫及高濕的條件下，本品的性狀及雜質(zhì)4沒有改變，但在高溫及高濕的共同作用下，企業(yè)1樣品的性狀發(fā)生了改變，同時產(chǎn)生了雜質(zhì)4（見圖6）。企業(yè)2及企業(yè)3樣品的性狀均未發(fā)生改變，也未產(chǎn)生雜質(zhì)4。

圖6 企業(yè)1雜質(zhì)色譜圖Fig 6 Impurity chromatogram of enterprise 1

表5 各因素對不同來源美沙拉秦樣品中雜質(zhì)4的影響Tab 5 Effect of various factors on impurity 4 in mesalazine samples from different sources

分析各企業(yè)處方發(fā)現(xiàn)，企業(yè)1使用了輔料微晶纖維素。微晶纖維素吸濕性強(qiáng)，在高濕度下會吸濕增加水分，水分作為反應(yīng)介質(zhì)，增加了系統(tǒng)的塑性和分子流動性，同時形成水膜，反應(yīng)就在此發(fā)生，進(jìn)一步引起美沙拉秦降解，雜質(zhì)顯著增加。

企業(yè)2和企業(yè)3的處方未使用微晶纖維素，其樣品比較穩(wěn)定，高溫高濕放置7 d后，性狀未發(fā)生變化，雜質(zhì)未見增加。

用LC-MS測試雜質(zhì)4的分子量，結(jié)果如圖7所示，負(fù)離子模式下，分子離子峰質(zhì)荷比為260；正離子模式下，分子離子峰的質(zhì)荷比為262。證明該雜質(zhì)的分子量為261。

圖7 雜質(zhì)4質(zhì)譜圖Fig 7 Mass spectrum of impurity 4

根據(jù)其分子量初步推測，雜質(zhì)4的結(jié)構(gòu)可能為圖8所示。具體情況還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

圖8 雜質(zhì)4可能的結(jié)構(gòu)圖Fig 8 Possible structure of impurity 4

4 討論

4.1 不同處方的樣品雜質(zhì)譜有較大差異

本文對市售各企業(yè)多批樣品進(jìn)行了有關(guān)物質(zhì)考察，共檢出4個主要雜質(zhì)，其中雜質(zhì)1、雜質(zhì)2和雜質(zhì)4為企業(yè)1生產(chǎn)的樣品的特有雜質(zhì)，雜質(zhì)3為所有樣品的共有雜質(zhì)。提示不同處方的樣品雜質(zhì)譜有較大差異。

4.2 企業(yè)1處方不合理，應(yīng)對其進(jìn)行變更

雜質(zhì)1、雜質(zhì)2為企業(yè)1處方中輔料與原料發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生的，同時，企業(yè)1處方中的輔料還可能會促進(jìn)雜質(zhì)4的生成。提示企業(yè)1處方不合理，應(yīng)對其進(jìn)行變更。

4.3 原輔料相容性應(yīng)引起重視

《藥用輔料與藥物相容性研究指導(dǎo)原則》指出：藥物制劑中各種藥用輔料、藥用輔料的雜質(zhì)及藥物活性成分之間不得發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，不產(chǎn)生新化學(xué)成分或雜質(zhì)，進(jìn)而不影響藥物的療效。乳糖與美沙拉秦會產(chǎn)生Maillard反應(yīng)，生成雜質(zhì)，含美沙拉秦的制劑中應(yīng)避免使用乳糖作為輔料。

微晶纖維素吸濕性強(qiáng)，在高濕度下會吸濕增加水分，可能會引起美沙拉秦降解速率的增大，使制劑雜質(zhì)顯著增加，含美沙拉秦的制劑中也應(yīng)避免使用微晶纖維素作為輔料。

4.4 小結(jié)

本文對目前市售的不同處方的美沙拉秦（嗪）腸溶片的雜質(zhì)進(jìn)行全面分析，通過建立新的雜質(zhì)檢測方法及雜質(zhì)譜，從雜質(zhì)種類、雜質(zhì)個數(shù)、雜質(zhì)來源、不同處方樣品的穩(wěn)定性等方面進(jìn)行分析，從而對其產(chǎn)品質(zhì)量及生產(chǎn)工藝進(jìn)行評價，同時，使各企業(yè)對自身產(chǎn)品質(zhì)量狀況、同品種質(zhì)量現(xiàn)狀以及產(chǎn)品質(zhì)量改進(jìn)等各方面有客觀的認(rèn)識和了解，為藥品監(jiān)督管理部門今后對美沙拉秦（嗪）腸溶片的監(jiān)督管理提供了參考。