楊學芳，董馨憶，普吉霞，劉建昆，馬 立 ，張志畢,

（1.昆明醫(yī)科大學，云南昆明 650500；2.解放軍聯(lián)勤保障部隊第九二〇醫(yī)院，云南昆明 650032；3.大理農(nóng)林職業(yè)技術學院，云南大理 671003）

肝臟纖維化（Hepatic Fibrosis，HF）是一種肝臟組織無效的損傷-修復，是多種慢性肝臟疾病中后期共同的病理過程，主要的病理表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）積累和瘢痕形成[1]。當肝臟受到嚴重破壞或持續(xù)損傷時，ECM 大量積累，纖維增生向肝實質(zhì)細胞間隙延伸，并逐漸形成纖維索及纖維間隔，纖維間隔繼續(xù)發(fā)展則連接形成纖維包裹[2]。HF 之前的肝臟病變都是可逆的，但是當肝臟疾病發(fā)展到肝硬化和肝癌階段，是不可逆轉(zhuǎn)的，所以在HF 階段及時阻止并逆轉(zhuǎn)肝臟疾病的發(fā)展，對于各種肝臟疾病的治療具有重要的意義[3]。

人類機體很容易受到氧化應激的傷害，氧化應激是指機體內(nèi)活性氧（ROS）積累過多，造成細胞和組織損傷的一種病理狀態(tài)，ROS 誘導的細胞損傷及炎癥反應，影響細胞膜和細胞器的結構，釋放大量的炎癥因子，導致肝星狀細胞（Hepatic Stellate Cells，HSC）活化、增殖和細胞外基質(zhì)的合成、積累，導致HF 的形成[4]。研究發(fā)現(xiàn)ROS 與酒精性肝病和病毒性肝炎導致的HF 發(fā)生具有密切的關系，在HF 患者或?qū)嶒炐訦F 模型動物的血清和肝臟組織中，都檢測到高濃度的ROS 表達[5-6]。研究表明轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming Growth Factorβ1，TGF-β1）與ROS具有協(xié)同作用，共同介導HF 的發(fā)生。一方面TGFβ1 激活細胞膜氧化酶和促進細胞線粒體復合物IV 活性，導致細胞ROS 合成增加；另一方面，TGFβ1 抑制抗氧化還原酶的表達，降低細胞清除ROS 的能力，導致細胞內(nèi)ROS 積累[7]。ROS 的積累會促進了TGF-β1 的表達，TGF-β1 與細胞膜表面受體結合后招募Smad2 和Smad3 形成蛋白復合物，Smad2/3蛋白復合物被ROS 介導的磷酸化激活后轉(zhuǎn)移進入細胞核，作為轉(zhuǎn)錄因子與下游靶基因DNA 結合，激活a-SMA、膠原纖維等HF 基因的表達，導致HF 發(fā)生[8]，因此抗氧化是治療HF 的重要方法。

辣木（Moringa oleiferaLam.）主要分布于我國云南、廣東、福建、臺灣等地[9]，2012 年，辣木葉被衛(wèi)生部批準為新資源食品。辣木含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、多糖、多酚等多種營養(yǎng)成份和活性物質(zhì)，具有抗氧化、抑菌、降血糖、降血脂、抗腫瘤、清熱解毒等功效，是一種藥食同源的中草藥[10-11]。研究發(fā)現(xiàn)辣木葉乙醇提取物具有較強的抗氧化作用[12]，對高脂飲食導致的肝損傷及高脂血癥[13]、CCl4誘導的肝損傷[14]、奧氮平誘導的糖脂代謝紊亂[15]和肝癌[16]都具有一定的保護作用，其保護作用機制與抗氧化損傷、提高脂肪代謝速率和促進肝癌細胞凋亡有關，但是對辣木葉對肝纖維化是否具有改善作用缺乏目前尚無報道。

因此，本研究建立大鼠肝纖維化模型，用辣木葉水提物（LM）灌胃治療后檢測LM 對大鼠肝纖維化病理損傷、肝臟功能和氧化應激的影響，旨在探討LM 對肝纖維化的改善作用，為辣木葉資源的開發(fā)利用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級雄性大鼠 60 只，6 周齡的，體重180～200 g，購買自昆明醫(yī)科大學實驗動物學部，動物生產(chǎn)使用許可證SYXK（滇）K2020-0006，本研究獲得昆明醫(yī)科大學實驗動物倫理委員會的批準通過（批準編號：kmmu20211491）；硫代乙酰胺（純度≥98%）Sigma 公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、羥脯胺酸（HYP）試劑盒 南京建成生物工程有限公司；PCIII、IV-C ELISA試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司；LN ELISA 試劑盒、HA ELISA 試劑盒 武漢華美生物工程有限公司；TGF-β1、α-SMA 一抗 武漢華美生物工程有限公司；Smd2 一抗、Smad3 一抗 ABclonal 公司；總RNA提取試劑盒 Axygen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 Thermo Scientific 公司；實時熒光定量PCR 試劑盒 寶生生物工程有限公司；秋水仙堿片 云南昊邦制藥有限公司；辣木葉干粉 陜西泰科生物科技有限公司。

Synergy2 型多功能酶標儀 美國Biotek 公司；Centrifuge5804R 型冷凍離心機 德國Eppendorf 公司；EG1150 石蠟包埋機、RM2245 切片機、DMLIM顯微鏡 德國Leica 公司；GCZX3 型垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀 美國BD 公司；QuantStudioTM 6 Flx 型實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time PCR）儀 美國Thermo Fisher 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 辣木葉水提取物制備 辣木葉干粉200 g，加入2 L 超純水煮沸10 min，冷卻到室溫后用2 μm 濾膜過濾，溶液經(jīng)5000 r/min 離心10 min 后真空冷凍干燥，得到褐綠色的辣木葉水提物粉末（LM），-20 ℃冷凍保存，每次灌胃前需用生理鹽水現(xiàn)配為相應的濃度。

1.2.2 動物分組及處理 60 只大鼠隨機分為空白組、模型組、秋水仙堿組（100 mg/kg·d）、LM 高、中、低劑量組（劑量分別為200、100、50 mg/kg·d），每組10 只，除空白組外，其余組大鼠隔天注射硫代乙酰胺（TAA，劑量160 mg/kg）1 次，共注射8 周[17]，自造模開始后的第5 周開始灌胃，藥物組灌胃1 mL/kg 藥物，1 次/d，空白組和模型組灌胃等量生理鹽水，灌胃至第8 周結束后處死大鼠，取大鼠血清和部分肝臟-80 ℃保存，另一部分肝臟用10%甲醛溶液固定。

1.2.3 檢測指標

1.2.3.1 體重和肝臟指數(shù)檢測 給藥處理期間每周檢測1 次大鼠體重，給藥結束后取大鼠肝臟，用預冷生理鹽水快速清洗后濾紙吸干，稱量肝臟質(zhì)量，計算肝臟指數(shù)，肝臟指數(shù)=肝臟重量/大鼠體重×100。

1.2.3.2 肝臟功能、氧化應激水平和HF 指標檢測大鼠血清樣根據(jù)試劑盒說明書檢測轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST 濃度評價肝臟功能；檢測肝臟ROS、MDA 濃度和SOD 活性，評價肝臟氧化應激水平和抗氧化能力；檢測血清HF 四項指標（PCIII、IV-C、LN、HA）和羥脯氨酸（HYP）濃度，評價HF 程度。

1.2.3.3 肝臟組織病理學觀察 肝臟組織于甲醛固定液中固定7 d。脫水透明后石蠟包埋，切片后脫蠟、水化，然后進行Masson 染色，封片后顯微鏡下觀察肝臟纖維化水平，根據(jù)Ishak 評分標準評估大鼠HF 程度，根據(jù)肝臟纖維化嚴重程度評分為0～6 分，分值越大代表纖維化程度越嚴重[18]。

1.2.3.4 肝臟TGF-β1/Smads 通路基因表達檢測蛋白表達檢測：肝臟組織約30 mg，加入蛋白裂解液后超聲勻漿，冰浴裂解30 min 后12000 r/min 離心10 min，取上清用BCA 法檢測蛋白濃度，10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳后將蛋白質(zhì)通過濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫2 h 封閉后加入一抗孵育過夜，清洗后加入二抗室溫孵育2 h，ECL 化學放光檢測蛋白表達，Image J 軟件分析目的蛋白條帶相對表達量。mRNA 表達檢測：肝臟組織約20 mg提取總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。NCBI 網(wǎng)站設計大鼠TGF-β1、Smad2/3、α-SAM、β-actin（內(nèi)參）基因引物，并通過Blast 確定引物的特異性。根據(jù)實時熒光定量試劑盒操作說明檢測目的基因mRNA表達水平。采用2-△△CT法分析每個基因mRNA 的相對表達量。引物信息見表1。

表1 PCR 引物序列Table 1 Sequence of PCR primer

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5.0 進行統(tǒng)計分析和繪圖，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析方法，P＜0.05 代表組間差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 大鼠一般情況觀察

實驗觀察發(fā)現(xiàn)空白組大鼠精神狀態(tài)好，毛發(fā)光澤，體重增長穩(wěn)定。與空白組比較，模型組大鼠精神萎靡，毛發(fā)干枯且顏色暗淡，進食和飲水減少，行動遲緩，體重極顯著降低（P＜0.01），肝臟指數(shù)極顯著增加（P＜0.01），符合文獻[17]報道的HF 模型特征。與模型組比較，給藥后（第8 周）LM 組和秋水仙堿組大鼠精神狀態(tài)均有所改善，進食和飲水量增加，毛發(fā)恢復光澤，體重均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），肝臟指數(shù)也顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。本結果顯示LM 具有改善大鼠精神狀態(tài)和顯著下調(diào)肝臟指數(shù)的作用，見表2。

表2 LM 對HF 大鼠體重和肝臟指數(shù)的影響Table 2 Effects of LM on body weight and liver index in HF rats

2.2 辣木葉對HF 大鼠肝臟功能的保護作用

結果見表3，與空白組比較，模型組大鼠血清AST 和ALT 濃度都顯著升高（P＜0.01），表明HF 大鼠肝臟功能受到損傷。秋水仙堿是逆轉(zhuǎn)肝纖維和的藥物之一，陶柏楠等[19]、胥文娟等[20]研究發(fā)現(xiàn)秋水仙堿能夠降低HF 大鼠血清ALT 和AST，改善肝臟功能，本研究也發(fā)現(xiàn)，秋水仙堿組大鼠血清ALT 和AST 濃度較模型組顯著降低（P＜0.01），表明秋水仙堿能夠改善HF 大鼠肝臟功能。與模型組比較，LM高、中、低劑量都能夠顯著降低HF 大鼠血清AST和ALT 濃度（P＜0.05 或P＜0.01）。本結果顯示LM能夠改善大鼠肝臟功能。

表3 LM 對HF 大鼠血清AST、ALT 濃度和肝纖維化評分的影響Table 3 Effects of LM on serum AST,ALT levels and liver fibrosis score in HF rats

2.3 LM 改善HF 大鼠肝纖維化病理損傷

HF 病理損傷和肝纖維化評分如圖1 和表2 所示，空白組大鼠肝臟組織細胞大小均勻，排列規(guī)整，細胞形態(tài)清晰，沿中央靜脈呈現(xiàn)放射狀分布，無炎性細胞浸潤，也無變形和壞死。模型組大鼠肝臟細胞排列混亂，肝細胞顯著變性，肝小葉結構遭到破壞，細胞染色不均，部分細胞呈空泡樣改變，外基質(zhì)分泌較多，匯管區(qū)纖維增生嚴重，形成清晰的纖維間隔，HF 評分極顯著增加（P＜0.01），表明本研究成功建立了大鼠HF模型。與模型組比較，秋水仙堿組HF 大鼠肝臟組織纖維增生顯著減少，肝細胞空泡樣改變得到顯著緩解，炎性浸潤程度降低，肝臟細胞排列相對規(guī)整，HF評分極顯著降低（P＜0.01）。而LM 高劑量組大鼠肝臟組僅能觀察到少量纖維增生和聚集，無肝細胞變性盒空泡樣改變，HF 評分較模型組極顯著降低（P＜0.01），LM 抗HF 病變的療效和降低HF 評分較秋水仙堿組有更大程度的改善，LM 中、低劑量組也能在不同程度上緩解HF 大鼠HF 組織病變，并極顯著降低HF 評分（P＜0.01）。

圖1 LM 減輕HF 大鼠肝纖維化損傷（200×）Fig.1 LM attenuates liver fibrosis injury in HF rats (200×)

2.4 LM 降低HF 大鼠肝纖維化指標

肝臟細胞的炎性改變可以刺激纖維組織增生，導致血清HF 四項指標（PCIII、IV-C、LN 和HA）的異常升高，升高的幅度隨著HF 的程度加重而增加，因此血清肝纖四項的濃度可以作為評價HF 程度的指標[21]。HYP 是膠原纖維的主要成分之一，當肝臟內(nèi)膠原纖維異常增多時，肝臟組織中的HYP 含量也會隨之升高，因此HYP 含量與HF 程度密切相關[22]。血清肝纖四項檢測結果見表4，與空白組比較，模型組大鼠血清肝纖四項指標和肝臟HYP 含量都極顯著高于空白組（P＜0.01），表明HF 大鼠肝纖維化病變嚴重。與模型組比較，秋水仙堿組肝纖四項和HYP 濃度都顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），而LM 也能夠顯著降低大鼠血清中肝纖四項指標和HYP 的含量（P＜0.05，P＜0.01），并且呈現(xiàn)劑量依賴關系。整體分析，LM 高劑量組對肝纖四項和HYP 含量的影響與秋水仙堿組相當。本結果顯示LM 能夠抑制大鼠HF 的發(fā)生和發(fā)展。

表4 LM 對HF 大鼠肝纖維化指標含量的影響Table 4 Effects of LM on the content of liver fibrosis markers in HF rats

2.5 LM 對肝臟組織氧化應激的影響

HF 的發(fā)生與氧化應激密切相關，課題組前期已證實LM 具有抗氧化作用[15]，LM 對HF 大鼠肝臟氧化應激影響的結果見表5，與空白組比較，模型組大鼠肝臟組織氧化應激指標ROS 和MDA 含量都極顯著高于空白組（P＜0.01），抗氧化酶SOD 活力顯著降低（P＜0.01），表明HF 大鼠肝臟組織處于氧化應激狀態(tài)，肝臟組織抗氧化損傷能力降低。與模型組比較，LM 組大鼠肝臟組織ROS 和MDA 含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），肝臟SOD 活力顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），表明LM 具有抗氧化作用，可降低HF 大鼠肝臟組織的氧化應激水平。

表5 LM 對HF 大鼠肝臟組織氧化應激的影響Table 5 Effects of LM on oxidative stress in liver tissue in HF rats

2.6 LM 對肝臟TGF-β1/Smads 通路基因表達的影響

mRNA 檢測結果見表6，模型組大鼠肝臟組織TGF-β1/Smads 通路基因，包括TGF-β1、Smad2、Smad3和α-SMA基因mRNA 表達較空白組都極顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，秋水仙堿組α-SMA基因mRNA 表達極顯著降低（P＜0.01），而TGF-β1、Smad2、Smad3基因mRNA 表達無明顯變化；LM 高劑量組TGF-β1基因mRNA 表達顯著降低（P＜0.05）；LM 高、中劑量組Smds2基因mRNA表達顯著降低（P＜0.05）；LM 高、中、低劑量組Smds3和α-SMA基因mRNA 表達都顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表6 LM 對HF 大鼠肝臟TGF-β1/Smads 通路基因mRNA 表達的影響Table 6 Effects of LM on mRNA expression of TGF-β1/Smads pathway genes in the liver of HF rats

蛋白表達檢測結果見圖2，與空白組比較，模型組大鼠肝臟TGF-β1、Smad2、Smad3 和α-SMA基因蛋白表達都極顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，秋水仙堿組TGF-β1、Smad2、Smad3和α-SMA蛋白表達都極顯著降低（P＜0.01）；LM 高、中劑量組TGF-β1、Smad2、Smad3和α-SMA蛋白表達都顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；LM 低劑量組Smad3和α-SMA表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）?；虮磉_檢測結果顯示模型組大鼠肝臟組織TGF-β1/Smads 通路被激活，肝星狀細胞被活化，而LM 能夠下調(diào)TGF-β1/Smads 通路表達，抑制肝星狀細胞的活化。

圖2 LM 對HF 大鼠肝臟TGF-β1/Smads 通路基因蛋白表達的影響Fig.2 Effects of LM on protein expression of TGF-β1/Smads pathway genes in the liver of HF rats

3 討論與結論

HF 的發(fā)生與氧化應激和炎癥損傷密切相關，TGF-β1、血小板衍生生長因子（Platelet Derived Growth Factor，PDGF）、腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）等細胞因子使靜息狀態(tài)的HSC 被激活，合成以α-SMA 為標志物的活化蛋白，被活化的肝星狀細胞進一步轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，肌成纖維細胞在各種細胞因子、趨化因子、生長因子的作用下，不斷增殖并分泌ECM[23]。此外，ROS 等刺激會導致ECM 在肝臟組織中積累，形成纖維化瘢痕，影響肝臟的正常功能。所以消除損傷因素，降低HSC 的活化和增殖，是治療HF 的主要策略之一[24]。辣木葉富含抗氧化活性物質(zhì)，因此推測其可能通過抗氧化作用清除ROS 等肝損傷因素，逆轉(zhuǎn)肝纖維化。

肝毒試劑TAA 誘導大鼠肝臟發(fā)生氧化應激，TAA 處理后大鼠肝臟ROS 含量和脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA[25-26]含量都顯著增加，肝臟處于氧化應激損傷狀態(tài)，肝臟組織內(nèi)的ALT 和AST 會釋放進入血液中[27]，血清中ALT 和AST 含量可以作為評價肝臟功能的指標[28]。本研究檢測也證實了TAA 誘導氧化應激損傷后，肝臟ROS 和MDA 含量都顯著增加，血清ALT 和AST 濃度顯著增加，大鼠肝臟功能受到損傷，而LM 能夠顯著的降低肝臟氧化應激狀態(tài)，保護肝臟功能。

肝星狀細胞被激活后，會大量合成、分泌PCIII、IV-C、LN、HA 等肝臟膠原纖維成份，這些成份血清含量可以作為評價HF 的指標[29]。HYP 是膠原蛋白中特有的氨基酸成份，肝臟組織中HYP 含量也可以評價HF 程度[30]。本研究檢測了大鼠血清PCIII、IV-C、LN、HA 和肝臟HYP 含量，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠上述指標都顯著升高，表明TAA 處理成功誘導了大鼠HF 的發(fā)生。LM 處理后，大鼠HF 指標顯著降低，表明LM 成功減緩了大鼠肝臟纖維組織沉積，該結果也通過Masson 染色的結果得到了驗證。

在HF 發(fā)生過程中，ROS 能顯著促進TGFβ1 的表達[31]，而TGF-β1 可通過抑制抗氧化還原酶的表達，如谷氧還原蛋白、過氧化氫（catalase，CAT）、SOD、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）等，降低細胞清除ROS 的能力，導致細胞內(nèi)ROS 進一步積累。TGF-β1 與受體結合后，招募Smads 蛋白形成復合物，Smads 蛋白復合物被磷酸化后轉(zhuǎn)移進入細胞核內(nèi)，激活下游HF靶基因的表達，導致肝星狀細胞活化標志物α-SMA 表達上調(diào)[32]、ECM 合成和分泌增加[3]。因此，TGF-β1 和ROS 協(xié)同作用，一方面促進HSC 活化和增殖，增加ECM 的合成；另一方面能夠抑制與ECM 降解相關的蛋白表達，抑制ECM 的降解。本研究發(fā)現(xiàn)，在TAA 誘導的纖維化肝臟組織內(nèi)，肝臟組織ROS 和MDA 含量顯著增 加，TGF-β1/Smads 通路激活，TGF-β1 表達顯著增加，其結合蛋白Smad2/3 表達也顯著增加，因此ROS-TGF-β1/Smads 通路的激活是HF 發(fā)生的重要因素。而LM 處理后，大鼠肝臟組織ROS 和MDA 濃度都顯著降低，TGF-β1、Smad2/3和、下游靶基因α-SMA表達都顯著降低，膠原纖維含量也顯著降低，表明LM 可能通過抗氧化作用提高機體清除ROS 的能力，抑制ROS-TGF-β1/Smads通路的激活，進而抑制下游肝星狀細胞的活化和ECM 的合成、分泌，減輕HF 損傷。

多項研究表明，辣木葉提取物具有抗氧化、抗炎、增強免疫力等廣泛的藥理作用[10]，本研究結果顯示LM 能夠提高機體抗氧化能力，顯著降低HF 大鼠肝臟ROS 含量，改善大鼠HF 損傷。作用機制研究結果顯示，LM 能夠顯著抑制HF 大鼠肝臟TGFβ1/Smads 通路TGF-β1、Smad2/3和下游α-SMA、膠原纖維基因的表達，推測LM 可能通過調(diào)控ROSTGF-β1/Smads 通路發(fā)揮抗肝纖維化作用，但是LM改善HF 的藥效物質(zhì)基礎還需要進一步的研究。