陸夢(mèng)柯，王梓琴，張 春，王 菲，陳志璽，王亞妮，TANG Mengze，劉 蕊，唐旭東,,

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州 730000；2.甘農(nóng)生物科技有限公司，甘肅慶陽(yáng) 745600；3.波士頓大學(xué)，美國(guó)馬薩諸塞州 02215；4.深圳清華大學(xué)研究院創(chuàng)新中藥及天然藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518000；5.廣東省創(chuàng)新中藥及天然藥物研究工程中心，廣東深圳 518000）

近年來(lái)，全球肥胖人數(shù)飛速增長(zhǎng)，肥胖已成為全球范圍日益關(guān)注的健康問(wèn)題。研究表明超重和肥胖不僅會(huì)增加死亡風(fēng)險(xiǎn)[1]，也是誘發(fā)糖尿病、冠心病、高血壓、脂肪肝、腫瘤等疾病的高危因素[2]。目前，用于治療肥胖的手段有運(yùn)動(dòng)、藥物、手術(shù)、飲食干預(yù)、針灸推拿等[3-5]，然而這些方法卻存在著見(jiàn)效慢、副作用多、難以堅(jiān)持等問(wèn)題，因此積極有效輔助干預(yù)治療肥胖是當(dāng)今社會(huì)高度關(guān)注的問(wèn)題。

沙棘別名醋柳、酸刺、沙棗，為落葉灌木、小喬木或喬木。果實(shí)為假果類(lèi)，常見(jiàn)黃色、黃綠色、紅色、淺黃色、橘紅色；果型多為圓形和卵型[6]。在我國(guó)，沙棘藥用歷史悠久，唐朝時(shí)期藏族醫(yī)藥早期著作《月王藥診》中記載沙棘可助飲食開(kāi)胃消化和增強(qiáng)體魄[7]，元朝時(shí)蒙古族經(jīng)典著作《飲膳正要》記載沙棘熬成膏可生津止咳[8]，明朝《本草綱目》記載了沙棘用于治療消化系統(tǒng)疾病的方法[9]。1977 年，沙棘被收錄入《中國(guó)藥典》[10]，1989 年，沙棘被列為藥食同源中藥。沙棘富含黃酮、多酚、多糖、維生素和不飽和脂肪酸等活性成分，具有其抗炎、抗癌、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗氧化等作用[11]。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，沙棘具有一定降脂減肥的作用[12]，沙棘黃酮可抑制體重增加、改善肝臟脂質(zhì)累積[13]，沙棘多糖能激活棕色脂肪，改善機(jī)體熱量，抑制體重增加和脂質(zhì)累積[14]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以系統(tǒng)生物學(xué)、高通量組學(xué)、生物信息學(xué)為基礎(chǔ)，將藥理與網(wǎng)絡(luò)生物相結(jié)合，開(kāi)啟了一種多靶標(biāo)與多種疾病間復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系的新研究模式，賦予了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的整體性、系統(tǒng)性特點(diǎn)，為中醫(yī)藥的證候研究、方劑配伍、新藥開(kāi)發(fā)等提供了新的思路和方法[15]。分子對(duì)接是一種主要通過(guò)電場(chǎng)力分析受體配體的性質(zhì)特征以及相互作用來(lái)預(yù)測(cè)二者之間結(jié)合模式與親和力的一種模擬方法。在中醫(yī)藥領(lǐng)域，利用分子對(duì)接技術(shù)將小分子活性物質(zhì)與相關(guān)的靶蛋白進(jìn)行對(duì)接，可以從分子水平闡明中藥藥效成分與作用機(jī)制[16]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)結(jié)合，為闡釋現(xiàn)代中藥（復(fù)方）藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)與技術(shù)支持[17]。

目前對(duì)沙棘降脂減肥的研究多集中于某類(lèi)成分或某一通路靶點(diǎn)，本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)探討沙棘多成分、多靶點(diǎn)、多通路降脂減肥的協(xié)同作用機(jī)制和沙棘防治肥胖潛在的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，為后續(xù)研究及臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙棘藥材 甘肅甘農(nóng)生物科技有限公司提供，深圳清華大學(xué)研究院馬驥教授鑒定為胡頹子科植物沙棘Hippophae rhamnoidesL.的成熟果實(shí)；3T3-L1小鼠前脂肪細(xì)胞 上海中喬新舟生物科技有限公司；MTT 上海麥克林生化科技有限公司；PBS 磷酸鹽緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清、DEME高糖培養(yǎng)基、0.25%胰酶消化液、青霉素-鏈霉素溶液 美國(guó)Gemini 公司；小牛血清 美國(guó)Gibco 公司；二甲基亞砜（DMSO）、乙醇 分析純，四川西隴科學(xué)有限公司；石油醚 分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)。

AG 135 電子天平 瑞士梅特勒托利多公司；MOV-313 P 熱風(fēng)干燥箱、MCO-15 A CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 日本SANYO 公司；CK 40-32 PH 倒置顯微鏡

日本OLYMPUS 公司；冰箱 海爾集團(tuán)；生物安全柜 新加坡藝思高科技有限公司；400 R 離心機(jī)、Multiskan FC 酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo 公司；水浴鍋群安實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；CR-30 B+超純水機(jī) 上海杲森儀器設(shè)備有限公司；液氮罐 中科美菱低溫科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接

1.2.1.1 沙棘活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)篩選 使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine System Pharmacological，TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索沙棘的活性成分，并設(shè)置藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類(lèi)藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 對(duì)活性成分初步篩選[18]，獲得有效成分及其相關(guān)作用靶點(diǎn)。將獲得的靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）對(duì)其名稱(chēng)進(jìn)行校正，去除無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)，得沙棘化合物靶點(diǎn)集。將最終獲得的沙棘有效成分及靶點(diǎn)信息導(dǎo)入至Cytoscape 3.9.1，生成“活性成分-作用靶點(diǎn)”相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.1.2 肥胖靶點(diǎn)篩選 以“obesity”為關(guān)鍵詞，對(duì)人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（online mendelian inheritance in man，OMIM），GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)，DisGe-NET 數(shù)據(jù)庫(kù)，TTD（Therapeutic Target Database）靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索。將四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)的搜索結(jié)果進(jìn)行合并去重，得到肥胖靶點(diǎn)。

1.2.1.3 繪制韋恩圖及蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò) 將上述所得沙棘活性成分靶點(diǎn)與肥胖靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.0.2（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index 2.0.2.html），繪制VEEN 圖，得到沙棘靶點(diǎn)與肥胖靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)，即為沙棘抗肥胖的潛在靶點(diǎn)。將交集靶點(diǎn)上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)（Search tool for recurring instances of neighbouring genes，https://cn.string-db.org/），在“Multiple proteins”項(xiàng)下種類(lèi)定義為“Homo sapiens”進(jìn)行分析，設(shè)定最低互相作用評(píng)分條件為0.400，即中等置信度[minimum required interaction score：medium confidence（0.400）]，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，建立藥物靶蛋白-疾病靶蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果以TSV 格式文件導(dǎo)出。使用CytoScape 3.9.1 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jì)算度（degree）值，并以degree≥60 為界限篩選出沙棘抗肥胖的核心靶點(diǎn)。

1.2.1.4 GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析

將上述所得交集靶點(diǎn)導(dǎo)入David 數(shù)據(jù)庫(kù)https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp，“select identifier”項(xiàng)選為官方基因名official gene symbol，種屬選為人Homo sapiens，進(jìn)行基因本體論Gene Ontology（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū) Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路分析，得到GO 功能富集分析圖和KEGG 通路分析圖。

1.2.1.5 成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述各項(xiàng)得到的沙棘活性成分、交集靶點(diǎn)與KEGG 信號(hào)通路信息導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 構(gòu)建沙棘成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.1.6 分子對(duì)接 選擇沙棘抗肥胖的PPI 網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的潛在活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.rcsb.org/structure）中下載關(guān)鍵靶點(diǎn)的pdb 格式，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載活性成分的mol 2 格式。利用Autodock Dock 1.5.7 軟件進(jìn)行去水加氫處理后保存，并將抗肥胖的關(guān)鍵靶點(diǎn)與相應(yīng)活性成分進(jìn)行分子對(duì)接。分子對(duì)接結(jié)果用Pymol 2.2.0 進(jìn)行可視化處理。

1.2.2 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 沙棘提取物制備 沙棘鮮果洗凈挑揀后，50 ℃鼓風(fēng)干燥。陰涼通風(fēng)處密封貯存。

沙棘水提物[19]：稱(chēng)取15.00 g 沙棘干果，加入150 mL 超純水，浸泡1 h，水浴回流1 h，放冷抽濾，收集濾液；重復(fù)提取三次，每次1 h。合并濾液，旋蒸水浴揮至浸膏狀，-80 ℃凍存。

沙棘油[20]：稱(chēng)取120.00 g 沙棘果，加1200 mL石油醚（沸程30～60 ℃）浸泡過(guò)夜，索氏回流提取至無(wú)色。提取液旋蒸、水浴揮干溶劑，得沙棘油，4 ℃保存。

1.2.2.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3T3-L1 小鼠前脂肪細(xì)胞，棄去完全培養(yǎng)基，加入1 mL PBS 清洗后，用1 mL 胰酶消化2～3 min，加入3 mL完全培養(yǎng)基終止消化。離心后，棄去廢液，加入1 mL完全培養(yǎng)基，使用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為35000 個(gè)/mL，接種于96 孔板，每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液。設(shè)置空白組（含100 μL 完全培養(yǎng)基）、對(duì)照組（含細(xì)胞的100 μL 細(xì)胞培養(yǎng)液）、藥物組（沙棘水提物、沙棘油濃度分別設(shè)置為100、125、250、500 μg·mL-1），每組3 個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后，吸去各藥物組培養(yǎng)基，加入含不同濃度藥物的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24、48、72 h。每孔加入10 μL MTT，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，取出，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO。放入酶標(biāo)儀，振蕩5 min，于570 nm處測(cè)其吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率[21]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Graph Pad Prism 9.0.0 等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，組間差異均使用單因素方差分析，P＜0.05 表示存在顯著性差異，兩兩比較用LSD-T 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接

2.1.1 沙棘活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn) 基于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)篩選符合OB≥30%、DL≥0.18 值的活性成分共33 個(gè)，其中22 個(gè)活性成分有對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)（表1），沙棘活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)蛋白去重后共196 個(gè)。繪制沙棘活性成分與靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。

表1 沙棘活性成分表Table 1 Active components of Hippophae fructus

2.1.2 肥胖靶點(diǎn) 通過(guò)OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards-數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索肥胖相關(guān)基因，篩選DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)中Score≥0.02 的靶點(diǎn)，GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中Relevance＞1.247 的靶點(diǎn)，將所得的肥胖靶點(diǎn)合并去重，共得2971 個(gè)疾病靶點(diǎn)。

2.1.3 韋恩圖及PPI 網(wǎng)絡(luò) 將沙棘活性成分靶點(diǎn)及疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny，繪制Veen 圖（圖2）得到二者交集靶點(diǎn)，即得沙棘治療肥胖的潛在靶點(diǎn)151 個(gè)，包括TNF、IL6、CASP3、FOS、MAPK8、PPARA。將151 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String 在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖3），利用CytoScape 3.9.1 軟件進(jìn)行拓?fù)浞治?。以degree≥60 篩選出33 個(gè)核心作用靶點(diǎn)：AKT1、TNF、IL6、TP53、VEGFA、IL1B、CASP3、CTNNB1、ESR1、PPARG、PTGS2、HIF1A、EGFR、MYC、MMP9、EGF、PTEN、FOS、CXCL8、CAT、CCND1、CCL2、NFKBIA、IL10、NOS3、HMOX1、MMP2、ERBB2、ICAM1、RELA、CASP8、BCL2L1、MAPK8。

圖2 沙棘靶點(diǎn)與肥胖靶點(diǎn)交集韋恩圖Fig.2 Venn diagram of the intersection of Hippophae fructus targets and obesity targets

圖3 PPI 蛋白網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI protein network diagram

2.1.4 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析將交集靶點(diǎn)呈遞到David 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG 通路富集分析和GO 功能分析。

KEGG 分析結(jié)果顯示共有173 條富集顯著的信號(hào)通路，對(duì)count 值≥25 的信號(hào)通路進(jìn)行氣泡圖展示，結(jié)果見(jiàn)圖4。其中惡性腫瘤通路顯示出較強(qiáng)關(guān)聯(lián)，沙棘抗肥胖的其他相關(guān)信號(hào)通路有：脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、剪切力與動(dòng)脈粥樣硬化通路、乙型肝炎等。

圖4 KEGG 通路富集分析氣泡圖Fig.4 Bubbles in enrichment analysis of KEGG pathway

GO 富集分析包括GO 生物過(guò)程（biological process，BP）分析、分子功能（molecular function，MF）分析和細(xì)胞組分（cellular component，CC）分析。選取count 值≥25 的GO 各項(xiàng)富集分析結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，按照相關(guān)度排列。GO-BP 分析結(jié)果表示沙棘主要通過(guò)RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、基因表達(dá)的正調(diào)控、DNA 轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控等生物過(guò)程發(fā)揮抗肥胖的作用（見(jiàn)圖5）；GO-CC 分析結(jié)果表示可通過(guò)細(xì)胞溶質(zhì)、細(xì)胞核、質(zhì)膜等細(xì)胞組分達(dá)到治療肥胖的效果（見(jiàn)圖6）；GO-MF 分析結(jié)果表示沙棘可通過(guò)蛋白結(jié)合、同蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚活性等分子功能治療肥胖（見(jiàn)圖7）。

圖5 GO-BP 分析結(jié)果Fig.5 Analysis results of GO biological process

圖6 GO-CC 分析結(jié)果Fig.6 Analysis results of GO cellular component

圖7 GO-MF 分析結(jié)果Fig.7 Analysis results of GO molecular function

2.1.5 成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將篩選所得沙棘活性成分、藥物-疾病交集靶點(diǎn)與KEGG 信號(hào)通路信息導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建沙棘成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見(jiàn)圖8。此網(wǎng)絡(luò)圖共計(jì)186 個(gè)節(jié)點(diǎn)和724 條邊，其中22 個(gè)紅色菱形節(jié)點(diǎn)表示沙棘活性成分，13 個(gè)紫色六邊形節(jié)點(diǎn)表示信號(hào)通路，151 個(gè)藍(lán)色圓形節(jié)點(diǎn)表示交集靶點(diǎn)蛋白。從該圖中可知活性成分SJ22（Quercetin）、SJ14（Kaempferol）、SJ12（Beta-sitosterol）、SJ11（Isorhamnetin）SJ16（Stigmasterol）、SJ10（Beta-carotene）、SJ1（Pelargonidin）可能是沙棘治療肥胖的關(guān)鍵活性成分，惡性腫瘤、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、PI3K-Akt 可能是關(guān)鍵作用通路。該分析結(jié)果展示出沙棘治療肥胖病癥過(guò)程中多成分、多靶點(diǎn)、多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)。

圖8 成分-靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)Fig.8 Pathway network of components-targets-signalings

2.1.6 分子對(duì)接 選擇沙棘抗肥胖的PPI 網(wǎng)絡(luò)中度值≥95 的關(guān)鍵靶點(diǎn)AKT1、IL-6、VEGFA、TNF 與其對(duì)應(yīng)的潛在活性成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。對(duì)接結(jié)合能見(jiàn)表2。結(jié)合能＜0 kcal·mol-1，表明受體分子與配體分子能自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能≤-5.0 kcal·mol-1表明受體與配體之間有較好的結(jié)合活性。結(jié)合能絕對(duì)值越高，對(duì)接能力越強(qiáng)，對(duì)接后分子穩(wěn)定性越高，均方根偏差（RMSD）越小表示對(duì)接結(jié)果越準(zhǔn)確。部分分子對(duì)接結(jié)果可視化見(jiàn)圖9。

圖9 成分-靶點(diǎn)對(duì)接可視化Fig.9 Visualization of component-target docking

表2 分子對(duì)接結(jié)合能Table 2 Binding energy of molecular docking

2.2 MTT 檢測(cè)沙棘提取物對(duì)3T3-L1 小鼠前脂肪細(xì)胞增殖作用的影響

3T3-L1 小鼠前脂肪細(xì)胞具有增殖分化的能力，是常用的體外脂肪生成模型[22]。脂肪細(xì)胞數(shù)目擴(kuò)增和體積肥大是影響體內(nèi)脂肪總重的主要因素，細(xì)胞數(shù)量受到細(xì)胞凋亡和增殖等活動(dòng)的影響，因此抑制脂肪增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡也被視為肥胖治療手段[23]。

利用MTT 法檢測(cè)沙棘提取物不同濃度、不同作用時(shí)間對(duì)3T3-L1 前脂肪細(xì)胞的增殖的影響，結(jié)果見(jiàn)圖10。由圖10A 可知，與對(duì)照組相比，沙棘水提物與沙棘油作用于3T3-L1 前脂肪細(xì)胞24 h 后，125、250 μg·mL-1沙棘水提物與100、125 μg·mL-1沙棘油對(duì)細(xì)胞有短暫的促增殖效果（P＜0.01，P＜0.05），100 μg·mL-1沙棘水提物與250 μg·mL-1沙棘油無(wú)較為明顯變化。250 μg·mL-1的沙棘水提物與沙棘油則表現(xiàn)出抑制細(xì)胞增殖的效果（P＜0.01，P＜0.05）。隨著藥物作用時(shí)間的增長(zhǎng)至48 h（見(jiàn)圖10B），除250 μg·mL-1的沙棘水提物與100 μg·mL-1的沙棘油外與對(duì)照組無(wú)顯著性差異外，其余各組均表現(xiàn)出顯著抑制細(xì)胞增殖的效果（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。藥物作用時(shí)間至72 h 后，除100 μg·mL-1沙棘油與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異外，其余各組均表現(xiàn)出顯著抑制細(xì)胞增殖的效果（見(jiàn)圖10C）（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

圖10 沙棘提取物對(duì)3T3-L1 小鼠前脂肪細(xì)胞增殖的影響Fig.10 Effect of Hippophae fructus extracts on the proliferation of 3T3-L1 preadipocytes

3 討論與結(jié)論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討沙棘抗肥胖的有效成分和作用機(jī)制，并利用3T3-L1 小鼠前脂肪細(xì)胞進(jìn)行體外驗(yàn)證。

本研究篩選出22 個(gè)具有對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的沙棘活性成分，槲皮素、山奈酚、β-胡蘿卜素、α/β-谷甾醇、麥角甾烯醇、表兒茶素可能為沙棘抗肥胖潛在活性成分。研究表明，槲皮素能改善與代謝綜合征相關(guān)的異常，如肥胖、血脂異常和葡萄糖不耐受等病癥[24]，它能通過(guò)靶向PPARα/γ調(diào)控糖異生改善肝臟脂肪蓄積[25]。山奈酚可促進(jìn)成熟脂肪細(xì)胞中Cebpa基因表達(dá)的下調(diào)和脂質(zhì)積累的減少，調(diào)節(jié)3T3-L1 細(xì)胞的成脂分化，進(jìn)而達(dá)到抗肥胖作用，也可通過(guò)調(diào)節(jié)能量平衡、下丘腦炎癥相關(guān)中樞過(guò)程、腸道菌群等途徑達(dá)到抗肥胖的目的[26-28]。β-胡蘿卜素是類(lèi)胡蘿卜素的一種，也是維生素A 的主要來(lái)源。類(lèi)胡蘿卜素可參與脂肪組織代謝和炎癥的調(diào)節(jié)，β-胡蘿卜素通過(guò)β3-AR/p38 MAPK/SIRT 信號(hào)通路上調(diào)調(diào)節(jié)脂肪分解和脂肪氧化，誘導(dǎo)3T3-L1 白色脂肪細(xì)胞褐變[29]。

通過(guò)構(gòu)建沙棘與疾病的靶點(diǎn)Veen 圖與PPI 網(wǎng)絡(luò)，篩選出151 個(gè)沙棘抗肥胖的潛在作用靶點(diǎn)。AKT1 是脂肪細(xì)胞分化和克隆擴(kuò)增過(guò)程中極為重要的信號(hào)分子[30]，周坤[31]研究表明山楂多糖、黃酮提取物能夠通過(guò)PI3K/AKT 通路起到調(diào)節(jié)肥胖小鼠糖脂代謝異常的作用。白色脂肪組織中的脂肪細(xì)胞以及M1 巨噬細(xì)胞可分泌大量的TNF-α及IL-6 等促炎因子，加快肥胖及其相關(guān)代謝病的發(fā)展[32]，高脂小鼠表現(xiàn)出明顯的體質(zhì)量增加、糖脂代謝紊亂、回腸炎癥水平增加[33]。IL-6 因子可促進(jìn)脂肪組織脂解，刺激脂質(zhì)代謝[34]。嚴(yán)歡等[35]發(fā)現(xiàn)小麥麩皮多酚提取物能降低大鼠肝勻漿中IL-6、TNF-α等因子的含量，減輕肥胖引起的慢性炎癥，減肥效果良好。VEGFA 為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，能促進(jìn)血管生成、增強(qiáng)血管通透性，調(diào)節(jié)脂肪組織的分化和能量代謝等過(guò)程[36]，VEGFA表達(dá)下調(diào)后能夠促進(jìn)白色脂肪的棕色化，降低體重、增強(qiáng)葡萄糖清除能力以及胰島素敏感性，并且對(duì)高脂食物誘導(dǎo)的肥胖具有一定的抗性[37]。

結(jié)合篩選得到的沙棘抗肥胖交集作用靶點(diǎn)，進(jìn)行KEGG 通路分析和GO 功能分析，探討其抗肥胖分子作用機(jī)制。結(jié)果提示惡性腫瘤通路富集靶點(diǎn)最多，是沙棘抗肥胖較為顯著通路。肥胖是癌癥誘發(fā)因素之一，研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌[38]、乳腺癌[39]、結(jié)直腸癌[40]、甲狀腺癌[41]等都與肥胖有密切的關(guān)系[42]。肥胖相關(guān)癌癥的發(fā)生與體內(nèi)生長(zhǎng)激素和脂肪因子水平升高、腸道菌群失調(diào)、腫瘤代謝改變和慢性低度炎癥等微環(huán)境變化有著密切關(guān)系[43-44]，脂肪細(xì)胞分泌高水平的IL-6、TNF、脂肪因子和瘦素，組織炎癥加重，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖[45]。研究人員通過(guò)癌癥與肥胖等代謝疾病間的相關(guān)性研究，期望達(dá)到早期識(shí)別、應(yīng)對(duì)癌癥發(fā)生[46]。沙棘成分-靶點(diǎn)-通路圖表明沙棘可通路多成分、多靶點(diǎn)、多通路的協(xié)同作用達(dá)到抗肥胖。將AKT1、TNF、IL-6、VEGFA 四個(gè)核心靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)活性成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，結(jié)果表明各結(jié)合能均＜-7 kcal·mol-1，對(duì)接結(jié)果良好，有較好的結(jié)合活性。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，濃度為100、125、250 μg·mL-1的沙棘水提物與沙棘油短時(shí)間（24 h）作用于3T3-L1 前脂肪細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞增殖。隨著藥物作用時(shí)間的增長(zhǎng)（48 h），各個(gè)濃度（100～500 μg·mL-1）的沙棘水提物與沙棘油均表現(xiàn)出一定的抑制細(xì)胞增殖的作用（250 μg·mL-1的沙棘水提物與100 μg·mL-1的沙棘油除外）。在作用時(shí)間達(dá)到72 h 時(shí)，僅100 μg·mL-1的沙棘油與對(duì)照組差異不顯著，各組藥物對(duì)抑制細(xì)胞增殖均有顯著效果（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。

綜上所述，本研究探討了沙棘抗肥胖的潛在有效成分和作用機(jī)制，為進(jìn)一步臨床研究和產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供參考。