王艷芳 樊霞

摘要：矮化栽培是蘋果栽培現(xiàn)代化發(fā)展的趨勢，應用矮化砧木是實現(xiàn)蘋果矮化栽培、標準化管理的主要途徑。為完善和優(yōu)化蘋果矮化砧木組培繁殖再生體系，以蘋果矮化砧木M9T337為試驗材料，分別用75%酒精和1 g/kg升汞進行消毒處理，以篩選外植體最佳消毒方案；以M9T337單芽莖段為材料，研究不同培養(yǎng)基配方組合對組培苗污染率、增殖系數(shù)、株高、長勢、生根個數(shù)和生根率等指標的影響。結(jié)果表明，最適合外植體消毒的方法為75%酒精30 s＋1 g/kg升汞9 min，最佳M9T337初代培養(yǎng)基、繼代培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基配方分別為MS +6-BA 0.8 mg/L + NAA 0.4 mg/L、MS+ BA 1.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L和1/3MS+ IBA 0.1 mg/L。本試驗建立了蘋果矮化砧木M9T337高效離體快繁技術(shù)體系，篩選出了適宜于M9T337最佳擴繁、生根培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞：組織培養(yǎng)；矮化砧木；M9T337；蘋果

中圖分類號：S661.1? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ? ? ? 文章編號：2097-2172（2024）02-0163-04

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.02.012

Study on Tissue Culture and Rapid Propagation Techniques of

Apple Dwarf Rootstock M9T337

WANG Yanfang 1， FAN Xia 2

（1. Tianshui Vegetable Industry Development Office， Tianshui Gansu 741000， China; 2. Tianshui

Fruit Tree Research Institute， Tianshui Gansu 741000， China）

Abstract： Dwarfing cultivation is the developmental trend of modern apple production. Promotion and application of dwarfing rootstock is the main way to realize apple dwarfing cultivation， standardized management for apple production. To improve and optimize the tissue culture and regeneration system of apple dwarf rootstocks， in this study， apple dwarfing rootstock M9T337 was used to screen the best disinfection plan for explants using 75% ethanol and 1 g/kg mercuric chloride， respectively. M9T337 stem-segment with single bud was used to study the effects of different culture-medium combinations on the pollution rate， multiplication coefficient， plant height， growth， rooting number， and rooting rate of tissue culture seedlings. The results showed that 75% ethanol for 30 s + 1 g/kg mercuric chloride for 9 min had the best disinfection effect. The optimal formulations of primary medium， secondary medium and rooting medium were MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.4 mg/L， MS+BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L and 1/3MS+IBA 0.1 mg/L， respectively. In this experiment， the efficient in vitro rapid propagation technology system of apple dwarf rootstock M9T337 was established， and the best propagation and rooting medium suitable for M9T337 were selected as well.

Key words： Tissue culture; Dwarfing rootstock; M9T337; Apple

喬砧蘋果園普遍存在管理效率低、投入高、果實產(chǎn)量低品質(zhì)差等問題，矮化栽培是提高蘋果園管理水平和促進高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要途徑，因地制宜地選擇矮砧類型對發(fā)展矮密蘋果栽培非常重要。蘋果矮化砧的特點是樹體矮小，宜密植，根系發(fā)達，繁殖快，具有高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和管理方便等特點，易于機械化作業(yè)。M9T337是由荷蘭木本植物苗圃檢測服務中心選育的無病毒M9選拔系，比M9矮化程度高20%，意大利、法國及荷蘭等歐美國家已用M9T337繁育的大苗來建園，并成功獲得高紡錘樹形。該砧木根系發(fā)達、須根多、壓條易繁殖，新生苗木生長整齊，具有良好的苗圃性狀，豐產(chǎn)，早果，易于推廣。

目前M9T337主要采用組培快繁和壓條繁殖的無性繁殖方式，但是壓條繁殖苗木的機體得不到有效更新，植株生長勢弱［1 ］，成苗率低，易受季節(jié)和母體數(shù)量的限制［2 ］，不能大量生產(chǎn)。與傳統(tǒng)的繁殖方法相比，組織培養(yǎng)苗木擺脫了季節(jié)的限制，能在人工控制條件下達到周年生產(chǎn)，可在較短時間內(nèi)獲得大量的組培苗［3 ］，大大簡化了傳統(tǒng)育苗（如扦插、嫁接等）的煩瑣步驟，且能在較小的面積內(nèi)大規(guī)模生產(chǎn)［4 - 5 ］，可有效降低生產(chǎn)成本。組織培養(yǎng)的苗木根系發(fā)達，栽植成活率高、樹體健壯、抗病性強、早果豐產(chǎn)，且能夠保持遺傳性狀的穩(wěn)定性，組織培養(yǎng)育苗在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛應用［6 ］，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。2015年，我們從陜西華圣公司引進M9T337，定植于天水市果樹研究所蘋果種質(zhì)資源圃，并于2020年建立M9T337無菌系，同時進行了擴繁繼代、生根培養(yǎng)研究，以期為M9T337規(guī)?；a(chǎn)及遺傳轉(zhuǎn)化體系構(gòu)建奠定基礎。

1? ?材料與方法

1.1? ?試驗材料

試驗材料為天水市果樹研究所蘋果種質(zhì)資源M9T337（2015年從陜西華圣公司引進定植），樹齡6 a，樹體生長健壯，新梢發(fā)育良好。2020年4月下旬晴天上午取生長健壯、發(fā)育良好的幼嫩新梢，切取頂端3～4節(jié)作為外植體及時送實驗室處理。

1.2? ?試驗方法

1.2.1? ? 外植體消毒與初代培養(yǎng)? ? 將外植體置于? ? 1 000倍洗潔精液中浸泡30 min，然后用流水沖洗10 min。用75%酒精浸泡30 s，無菌水沖洗5次，升汞溶液1 g/kg分別浸泡8、9、10 min，再用無菌水沖洗5次。將經(jīng)消毒處理的外植體置于無菌濾紙上，吸取多余的水分，切去受傷截面，取1.5～2.0 cm單芽莖段作為外植體接入啟動分化培養(yǎng)基（滅菌后在培養(yǎng)室靜置3 d以上）［7 ］。試驗共設3個處理，分別為Ⅰ：MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.4 mg/L；Ⅱ：MS+6-BA 0.8 mg/L+ NAA 0.4 mg/L；Ⅲ：MS+ 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L。每瓶（培養(yǎng)基）2個芽，接種10瓶，3次重復，轉(zhuǎn)入溫度為18～22 ℃、濕度為55%～75%、光照強度為500～1 500 Lx的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。每3 d觀察1次，對褐化的外植體及時更換培養(yǎng)基。40 d后調(diào)查外植體生長情況。

污染率=（污染數(shù)/接種數(shù)）×100%

褐化率=（褐化數(shù)/接種數(shù)）×100%

成活率=（成活數(shù)/接種數(shù)）×100%

1.2.2? ? 繼代擴繁培養(yǎng)基篩選? ? 以初代培養(yǎng)所獲長勢健壯的組培苗為材料，選取2～4 cm長的莖段，切取約1.3～1.7 cm的帶芽莖段進行繼代培養(yǎng)擴繁［8 - 9 ］，繼代培養(yǎng)基6-BA、NAA濃度組合見表1［10 - 11 ］。

基于篩選出的最佳擴繁繼代培養(yǎng)基，設置4個不同濃度CH（水解酪蛋白）處理，即 0.2、0.3、0.4、0.5 g/L，每組處理接種10瓶，每瓶接種4個外植體，重復3次。40 d后調(diào)查外植體的擴繁數(shù)和幼苗高度及長勢。

1.2.3? ? 生根培養(yǎng)基篩選? ? 選取長勢健壯、葉色濃綠的組培苗，截取長約2.0 cm的帶芽莖段接入含有不同濃度IBA（0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mg/L）的1/3MS基本培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)［12 ］。培養(yǎng)室溫度22～26 ℃、濕度55%～75%、光照強度1 800～2 400 Lx。每組處理接種10瓶，每瓶接種4個外植體，重復3次，40 d后調(diào)查外植體的生根數(shù)和增殖倍數(shù)。

生根率=（生根的芽苗數(shù)/接種的芽苗總數(shù)）×100%

生根單株數(shù)=生根總條數(shù)/生根株數(shù)

2? ?結(jié)果與分析

2.1? ?不同消毒時間對M9T337外植體消毒效果的影響

M9T337外植體經(jīng)過消毒滅菌后接種到初代培養(yǎng)基5 d后出現(xiàn)不同程度的污染。如表2所示，75%酒精浸泡30 s后，用1 g/kg升汞活液消毒9 min和10 min處理用的外植體污染率均顯著低于消毒8 min處理，成活率顯著高于消毒8 min處理。褐化率隨著消毒時間的延長逐漸上升。從污染率、褐化率、成活率等3個指標看，75%酒精浸泡30 s+1 g/kg升汞消毒9 min效果最佳，且最佳初代培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.4 mg/L。

2.2? ?不同濃度激素配比對M9T337生長增殖的影響

選取初代培養(yǎng)里長勢健壯的植株進行繼代培養(yǎng)，將其接種于不同激素組合的培養(yǎng)基中［13 ］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)獲得的新生莖尖數(shù)均顯著高于不加激素的對照處理（表3）。其中，在6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L處理中，M9T337新生株的株高最高，為1.87 cm，增殖系數(shù)為5.18，且增殖芽生長良好，說明適宜于M9T337的最佳繼代培養(yǎng)基為MS+ 6-BA 1.0 mg+NAA 0.5 mg/L。

2.3? ?不同濃度CH對M9T337生長增殖的影響

在1 L MS+ 6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L培養(yǎng)基中分別加入不同濃度的CH［14 ］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.4 g/L CH處理的增殖系數(shù)顯著高于0.2、0.3 g/L CH處理，其芽長勢好、葉色濃綠、健壯（表4）。但CH濃度增大至0.5 g/L時，培養(yǎng)基出現(xiàn)不凝固現(xiàn)象，試管苗的株高顯著低于0.4 g/L CH處理，并且出現(xiàn)生長遲緩、長勢下降、污染加重的現(xiàn)象。

2.4? ?不同濃度IBA對M9T337生根的影響

在1/3MS培養(yǎng)基中分別加入不同濃度IBA，生根培養(yǎng)結(jié)果如表5所示。當IBA濃度為0.10 mg/L時，瓶苗生根率為89.5%，顯著高于其他處理，且根潔白、粗壯、整齊；當IBA濃度為0.04 mg/L時，生根率為59.6%，顯著低于其他處理，側(cè)根細且較少，根較短。IBA濃度為0.08、0.10 mg/L處理平均生根數(shù)分別為5.52、5.86條/株，顯著高于其他處理，但0.8 mg/L處理的根莖部誘發(fā)出愈傷組織，且根的發(fā)育呈現(xiàn)畸形，不利于根及莖尖正常生長，不利于移栽成活?？梢姡琁BA濃度0.10 mg/L 的1/3MS培養(yǎng)基有利于M9T337的生根和生長。

3? ?討論與結(jié)論

植物離體培養(yǎng)的關(guān)鍵在于外植體的建立，而外植體的采集時間和消毒時長等因素影響無菌系的建立。在試管苗的組培快繁中，升汞常用于外植體的消毒，殺菌時間太短達不到消毒效果，時間太長會引起植物中毒死亡或者褐化嚴重。本研究發(fā)現(xiàn)，對于蘋果砧木M9T337而言，外植體的消毒方式以75%酒精浸泡30 s加1 g/kg升汞消毒9 min效果最好，最佳初代培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.4 mg/L。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，在外植體采集時，天氣情況可影響初代培養(yǎng)的成活率，晴天采集成活率較高，其原因有待進一步研究。基本培養(yǎng)基組成成分和植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對植物試管苗增殖快繁具有重要影響。本研究中，不同配比細胞分裂素6-BA和NAA對M9T337試管苗增殖有顯著影響。在繼代擴繁培養(yǎng)中，當6-BA與NAA濃度在一定范圍內(nèi)，莖段的增殖系數(shù)隨著2種激素濃度的增加而增加。其中，6-BA 1.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L處理的株高較高，且葉片較大，枝條更為粗壯，新生莖尖數(shù)最多。但是當激素濃度超過一定范圍時，組培苗生長被抑制，生長量和有效莖尖數(shù)下降，玻璃苗增多，試管苗生長出現(xiàn)異常［15? ］。

本研究發(fā)現(xiàn)，CH對M9T337試管苗增殖有重要影響。當培養(yǎng)基中加入0.4 g/L的CH時，能有效促進M9T337芽的分化增殖生長，且芽葉色濃綠、生長健壯，增殖系數(shù)高［16 - 17? ］。隨著CH濃度進一步增加，雖然芽的增殖系數(shù)提高，但試管苗污率染也顯著增加，提示高濃度CH在促進試管苗增殖的同時可能也會利于細菌的繁殖。為了得到較高的增殖倍數(shù)，同時將細菌污染率控制在閾值之內(nèi)，適宜的CH濃度或其他藥劑代替CH還需進一步研究。生根培養(yǎng)是離體快繁的關(guān)鍵，直接影響工廠化繁育的成敗。王淑華等［18? ］研究表明，‘嘎啦蘋果試管苗生根培養(yǎng)時IAA表現(xiàn)優(yōu)于IBA和NAA；而吳玉霞等［19 ］在‘粉紅佳人試管苗生根培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)，IBA比IAA明顯提高生根率。本研究發(fā)現(xiàn)，在1/3MS基本培養(yǎng)基中加入0.1 mg/LIBA時，試管苗生根效果最好，與前人的研究基本一致。

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