張麗華，馮路瑤，唐培鑫，李昌文，趙光遠(yuǎn)，縱 偉

（鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450002）

0 引言

杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）是中國(guó)特有的名貴藥用樹種。現(xiàn)代藥理研究表明，杜仲葉與杜仲皮化學(xué)成分相似，都含有環(huán)烯醚萜類、多糖類和杜仲膠等物質(zhì)，具有降血壓、抗炎和神經(jīng)保護(hù)等生物活性［1］。在比較杜仲皮提取物（Eucommia ulmoides bark extract，EBE）和杜仲葉提取物（Eucommia ulmoides leaf extract，ELE）的降脂研究中發(fā)現(xiàn)，EBE和ELE能夠顯著改善脂質(zhì)代謝紊亂和血糖水平，且ELE和EBE的抗高脂血癥效果沒(méi)有差異，可能是通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物群的結(jié)構(gòu)來(lái)控制高脂血癥［2］。WANG等［3］研究發(fā)現(xiàn)，ELE的降壓效果優(yōu)于EBE。綜合評(píng)價(jià)ELE的安全性的研究表明，經(jīng)ELE處理后，大鼠生長(zhǎng)性能增強(qiáng)，沒(méi)有檢測(cè)到氧化損傷、炎癥反應(yīng)和組織病理學(xué)損傷。因此，ELE作為中國(guó)傳統(tǒng)保健食品食用是安全的［4］。

杜仲葉量大易獲取，對(duì)其進(jìn)行研究有利于杜仲種植業(yè)和食品加工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。近年來(lái)關(guān)于杜仲葉在食品加工方面的研究逐漸增多。然而，關(guān)于杜仲葉水提取物（Eucommia ulmoides leaf water extract，ELWE）在益生菌領(lǐng)域的研究鮮有報(bào)道。劉夢(mèng)培等［5］研究表明，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的杜仲葉提取液產(chǎn)生了獨(dú)特花香的二氫-α-紫羅蘭酮。ZHAO等［6］報(bào)道了ELWE可以促進(jìn)保加利亞乳桿菌的生長(zhǎng)，增加衰老小鼠腸道中的細(xì)菌多樣性和厚壁菌門/擬桿菌門的比例。益生菌在生產(chǎn)、加工和消化等過(guò)程中，會(huì)面臨環(huán)境或人類消化的各種壓力。因此，提高益生菌應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的能力，對(duì)其益生功能的發(fā)揮和工業(yè)應(yīng)用具有重要意義。通過(guò)研究ELWE對(duì)植物乳桿菌產(chǎn)酸和不同脅迫環(huán)境下活性的影響，可為杜仲葉作為新型食品資源在益生菌產(chǎn)品開發(fā)方面提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

杜仲葉，品種為華仲1號(hào)，2021年6月采自國(guó)家林業(yè)局泡桐研究開發(fā)中心的杜仲種植基地；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum CICC 20022），中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；MRS肉湯、MRS瓊脂培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乙醚，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；乳酸（分析標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC≥98%）、胃蛋白酶（30 000 U/g）、胰蛋白酶（250 U/mg）、膽酸鈉（豬），上海源葉生物科技有限公司；甲酸、乙酸、2-羥基丁酸（分析標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC≥98%）、偏磷酸（分析純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2.5%戊二醛，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-50A型高壓蒸汽滅菌鍋（上海博順醫(yī)用生物儀器有限公司）；PSH-3C型pH計(jì)（上海易電科學(xué)儀器有限公司）；Agilent 7820A型氣相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；Regulus 8100型高分辨場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（日本日立公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞龍生化儀器廠）；ST-LS01型水分測(cè)定儀（山東三體儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 ELWE的制備和成分測(cè)定

杜仲葉經(jīng)50 ℃烘干，粉碎后過(guò)60目篩得到杜仲葉粉。稱取杜仲葉粉5 g和去離子水100 mL，在錐形瓶中混勻后，280 W超聲提取30 min，5 000 r/min離心作用20 min，上清液在50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥，得到ELWE。密封后在-20 ℃的冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

灰分含量參照GB 5009.4-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》；蛋白質(zhì)含量參照GB 5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；脂肪含量參照GB 5009.6-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》；水分含量采用水分測(cè)定儀測(cè)定；多糖含量采用苯酚硫酸法測(cè)定［7］；總酚含量采用福林酚法測(cè)定［8］；黃酮含量采用NaNO2-Al（NO3）3法測(cè)定［9］。

1.3.2 植物乳桿菌培養(yǎng)

將保存在甘油中的植物乳桿菌轉(zhuǎn)移到100 mL新鮮MRS肉湯培養(yǎng)基中，并在（37±1） ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。之后取1 mL該培養(yǎng)基再次轉(zhuǎn)移到新的100 mL MRS肉湯中。同樣方法，獲得2次活化的植物乳桿菌懸浮液備用。將培養(yǎng)基離心作用（4 ℃，7 000 r/min，10 min），用無(wú)菌水洗滌2次，收獲細(xì)菌細(xì)胞；然后向細(xì)菌細(xì)胞加入無(wú)菌水，制成質(zhì)量體積比1：10的細(xì)菌懸浮液備用，細(xì)菌計(jì)數(shù)為6.00 lg CFU/mL。

1.3.3 活菌數(shù)、pH值和乳酸測(cè)定

將制備的ELWE直接添加到MRS肉湯培養(yǎng)基中，以制備20，80，320 mg/mL改良培養(yǎng)基。改良后的培養(yǎng)基在高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌（121 ℃，15 min）；然后將植物乳桿菌細(xì)胞懸浮液按照1%接種量依次接種到不同濃度提取物的改良液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)0，12，24，36，48，60，72 h后分別取樣，進(jìn)行活菌數(shù)、pH值和乳酸含量測(cè)定。

菌落計(jì)數(shù)參考GB 4789.35-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》；pH值采用pH計(jì)直接測(cè)定；乳酸含量參考RVIZ等［10］的方法，采用氣相色譜測(cè)定。

1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察

參照WANG等［11］的描述。將植物乳桿菌在改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，經(jīng)離心作用（9 000 r/min，4 min）和重懸2次獲得細(xì)胞，將細(xì)胞于4 ℃在體積比為2.5%的戊二醛中固定4 h。隨后用磷酸緩沖鹽溶液（pH=7.2）洗滌細(xì)胞3次，依次用30%，50%，70%，80%，90%乙醇脫水1次，再用無(wú)水乙醇脫水3次。最后用乙酸異戊酯置換2次。將菌液滴在硅片上經(jīng)烘箱（40 ℃，12 h）烘干固定，噴金上樣觀察。

1.3.5 模擬胃腸環(huán)境中的存活率

參考ZOU等［12］描述的方法。將添加胃蛋白酶的改良MRS肉湯培養(yǎng)基的pH值用0.1 mol/L HCl調(diào)節(jié)至2；然后通過(guò)0.22 μm膜對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行過(guò)濾除菌，得到模擬胃液。向改良的MRS肉湯培養(yǎng)基中添加胰蛋白酶和膽鹽，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至8后，通過(guò)0.22 μm膜制備成模擬腸液。將50 μL細(xì)菌懸浮液添加到模擬胃液（5 mL）和腸液（5 mL）中，并在培養(yǎng)箱（37 ℃，3 h）中培養(yǎng)。存活率（N）通過(guò)下式計(jì)算：

式中 N1——培養(yǎng)3 h后的細(xì)胞計(jì)數(shù)，CFU/mL；

N0——開始培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞計(jì)數(shù)，CFU/mL。

1.3.6 不同脅迫環(huán)境下的耐受性

根據(jù)MA等［13］的方法，分別測(cè)定添加ELWE對(duì)植物乳桿菌在熱脅迫環(huán)境（0，1，2，3 h，50 ℃）、NaCl脅迫環(huán)境（100 g/L，0，12，24 h，37 ℃）、膽鹽脅迫環(huán)境（9 g/L）和冷凍干燥脅迫環(huán)境（60 Pa，-50 ℃，22 h）耐受性的影響，以活菌數(shù)表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié)果表示為3次重復(fù)測(cè)定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行方差分析（ANOVA），P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELWE的基本成分

成分測(cè)定表明，ELWE的粗灰分含量最高，為（36.22±0.29） g/（100 g），蛋白質(zhì)和脂肪含量分別為（2.58±0.36），（2.72±0.21） g/（100 g），與王翔等［14］采用相同方法測(cè)得的結(jié)果相比，蛋白質(zhì)和脂肪含量較低。這可能是由于杜仲葉經(jīng)水提取后，其含有的水不溶性蛋白質(zhì)和脂肪成分發(fā)生損失。粗多糖、總多酚和總黃酮的含量顯著高于王翔等［14］報(bào)道的結(jié)果，主要是由于經(jīng)水提取后，水溶性的粗多糖、總多酚和總黃酮類物質(zhì)得到富集，分別達(dá)到（11.27±0.80），（12.06±2.26），（4.87±0.91） g/（100 g）。ELWE既保留了杜仲葉原有的營(yíng)養(yǎng)成分，也使得粗多糖、總多酚和總黃酮含量顯著增加，因此其有作為食品功能因子補(bǔ)充劑的潛力。

2.2 對(duì)植物乳桿菌活菌數(shù)、pH值和乳酸含量的影響

添加20，80，320 mg/mL ELWE的培養(yǎng)基中植物乳桿菌的生長(zhǎng)曲線如圖1（a）所示。對(duì)照組在24 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，36 h后進(jìn)入衰亡期，60 h后活菌數(shù)迅速下降。ELWE中含有多糖類、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，可以為菌體提供必要的生長(zhǎng)因子［15］。在發(fā)酵前36 h，與其他組相比，320 mg/mL組的活菌數(shù)沒(méi)有顯著增加，這可能是由于ELWE中含有的大量酚酸類物質(zhì)（如綠原酸等）［16］，抑制了植物乳桿菌的生長(zhǎng)。在發(fā)酵36 h后，酚酸類物質(zhì)有可能被植物乳桿菌水解利用，或植物乳桿菌適應(yīng)了酚酸脅迫環(huán)境，因此活菌數(shù)高于其他組。SANTOS等［17］報(bào)道了綠原酸可被乳酸菌水解，以產(chǎn)生肉桂酰酯酶，且當(dāng)綠原酸的濃度下降到足夠低時(shí)，植物乳桿菌能夠迅速增殖。因此在發(fā)酵36 h后，320 mg/mL組的活菌數(shù)顯著高于對(duì)照組。

圖1 不同濃度ELWE對(duì)植物乳桿菌活菌數(shù)、pH值和乳酸含量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of ELWE on viable count, pH and lactic acid content of Lactobacillus plantarum

改良培養(yǎng)基的pH值的變化如圖1（b）所示。在0～24 h內(nèi)，對(duì)照組的pH值迅速下降，表明伴隨植物乳桿菌的增殖產(chǎn)生大量有機(jī)酸。在36 h時(shí)，由于植物乳桿菌生長(zhǎng)環(huán)境中的酸度增加，可能抑制了植物乳桿菌的生長(zhǎng)和代謝，導(dǎo)致發(fā)酵后期pH值緩慢下降。與對(duì)照組相比，20 mg/mL ELWE對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)過(guò)程中pH值的變化沒(méi)有顯著影響。然而，在培養(yǎng)過(guò)程中，改良培養(yǎng)基（320 mg/mL）的pH值較其他組下降更緩慢，且pH值隨著添加提取物濃度的增加而升高，這可能是由于ELWE中含有的一些緩沖鹽物質(zhì)（如鈣鹽和鉀鹽）所致［18］。

不同濃度ELWE對(duì)植物乳桿菌產(chǎn)乳酸的影響如圖1（c）所示。在發(fā)酵前12 h，植物乳桿菌不產(chǎn)生乳酸，之后乳酸含量顯著升高。在36 h時(shí)，改良培養(yǎng)基中乳酸含量達(dá)到最高，20，80，320 mg/mL組分別較對(duì)照組（10.41 mmol/L）提高（42.06±0.05）%，（76.01±0.03）%，（111.64±0.07）%。在發(fā)酵中期，植物乳桿菌通過(guò)同型乳酸發(fā)酵，經(jīng)糖酵解途徑產(chǎn)生乳酸，導(dǎo)致培養(yǎng)基中積累大量的乳酸。對(duì)照組和試驗(yàn)組的乳酸含量均在36 h達(dá)到最大值，隨后呈下降趨勢(shì)，這和田亞冉［19］的研究結(jié)果一致，且其產(chǎn)乳酸的能力和ELWE濃度呈正相關(guān)。

2.3 對(duì)植物乳桿菌形態(tài)影響

添加不同濃度ELWE對(duì)植物乳桿菌形態(tài)的影響如圖2所示。對(duì)照組中，植物乳桿菌菌體呈桿狀，普遍偏短，其細(xì)胞表面部分產(chǎn)生輕微褶皺。添加20 mg/mL ELWE對(duì)植物乳桿菌的形態(tài)沒(méi)有影響。添加80 mg/mL ELWE后，植物乳桿菌菌體更加飽滿，表面褶皺消失，菌體略微變長(zhǎng)。添加320 mg/mL ELWE后，植物乳桿菌的菌體仍呈桿狀，但菌體發(fā)生聚集，這可能是由于水提取物濃度過(guò)高，導(dǎo)致菌體形態(tài)發(fā)生改變。馬佳歌等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在吐溫80脅迫下，植物乳桿菌菌體呈現(xiàn)出細(xì)長(zhǎng)的棒狀，而在葡萄糖脅迫下得到的菌體呈短棒狀或卵圓形。這是因?yàn)樵诓煌臓I(yíng)養(yǎng)脅迫環(huán)境中，植物乳桿菌菌體可以通過(guò)改變菌體形態(tài)來(lái)保證其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝入。添加不同濃度ELWE后，植物乳桿菌的形態(tài)變化并不顯著，但添加高濃度ELWE會(huì)促使菌體發(fā)生聚集，因此可進(jìn)一步推測(cè)，菌體聚集對(duì)植物乳桿菌在不同脅迫環(huán)境下的活性可能會(huì)有一定的影響。

圖2 不同濃度ELWE對(duì)植物乳桿菌形態(tài)影響的掃描電鏡圖Fig.2 Effects of different concentrations of ELWE on SEM image of Lactobacillus plantarum

2.4 對(duì)植物乳桿菌在模擬胃腸道耐受性的影響

如表1所示，在模擬胃液環(huán)境中發(fā)酵3 h后，對(duì)照組和20 mg/mL ELWE組均未檢測(cè)到植物乳桿菌活菌數(shù)，表明該菌對(duì)胃液中胃蛋白酶消化和酸性條件的抵抗力較差，添加低濃度ELWE不能對(duì)處于胃液環(huán)境中的植物乳桿菌起到保護(hù)作用。當(dāng)ELWE濃度達(dá)到80，320 mg/mL時(shí)，植物乳桿菌存活率分別達(dá)到87.77%和82.93%，表明提高ELWE濃度能夠改善植物乳桿菌的胃液耐受性。通過(guò)觀察在模擬腸液環(huán)境下發(fā)酵3 h的活菌數(shù)變化，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌在腸液中的存活率較高。當(dāng)ELWE濃度為20 mg/mL時(shí)，活菌數(shù)增長(zhǎng)到6.09 lg CFU/mL，與對(duì)照組相比提高7.06%。且隨著ELWE濃度的增加，活菌數(shù)沒(méi)有顯著差異。

表1 ELWE對(duì)植物乳桿菌胃腸道模擬耐受性的影響Tab.1 Effect of ELWE on gastrointestinal analog tolerance of Lactobacillus plantarum in vitro

相關(guān)研究表明，ELWE通過(guò)影響腸道菌群結(jié)構(gòu)和膽汁酸組成，來(lái)保護(hù)結(jié)腸上皮細(xì)胞的完整性，這種治療作用可能涉及到益生菌在胃腸道中的定植和存活［21］。植物乳桿菌已經(jīng)被證明需要利用不同的糖（如葡萄糖、乳糖、蔗糖和半乳糖）合成胞外多糖［22］。杜仲葉多糖是由高濃度的葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成［23］，這可能刺激植物乳桿菌產(chǎn)生胞外多糖，從而解釋ELWE對(duì)植物乳桿菌的保護(hù)作用，即植物乳桿菌在胃腸道中的存活率可能與細(xì)胞外有類似胞外多糖作用的多糖濃度有關(guān)，這些多糖可以充當(dāng)“盾牌”，減少細(xì)胞與胃腸液環(huán)境的接觸，促進(jìn)植物乳桿菌在不利環(huán)境中的存活。由圖2（d）可以看出，高濃度ELWE培養(yǎng)時(shí)，植物乳桿菌發(fā)生了菌體聚集，且聚集后的菌體周圍附著一層類似多糖的黏液，和以上分析結(jié)果一致。

2.5 對(duì)植物乳桿菌在不同環(huán)境脅迫下耐受性的影響

如圖3（a）所示，隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，植物乳桿菌的存活率下降，但在熱脅迫1～2 h時(shí)，各組植物乳桿菌的活菌數(shù)下降幅度較小，這可能是因?yàn)槠浒l(fā)生了熱應(yīng)激反應(yīng)，菌體通過(guò)產(chǎn)生熱休克蛋白和調(diào)節(jié)細(xì)胞膜組成成分，短時(shí)間內(nèi)提高了植物乳桿菌的耐熱性［24］。在50 ℃熱脅迫3 h后，各組的活菌數(shù)顯著下降，其中80 mg/mL組的活菌數(shù)顯著高于其他組（P＜0.05）。

圖3 ELWE對(duì)植物乳桿菌耐熱性、耐滲透、耐膽鹽和耐冷凍干燥的影響Fig.3 Effects of different concentrations of ELWE on heat，salt，bile salt and freeze-drying resistance of Lactobacillus plantarum

植物乳桿菌的耐滲透性通常以NaCl脅迫表示，植物乳桿菌在10% NaCl脅迫12，24 h環(huán)境中的活菌數(shù)如圖3（b）所示。添加ELWE的各組的活菌數(shù)均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），表明ELWE對(duì)植物乳桿菌耐受NaCl脅迫環(huán)境具有保護(hù)效果。然而，隨著ELWE濃度的增加，活菌數(shù)沒(méi)有呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢(shì)，反而在高濃度（320 mg/mL）時(shí)略微下降。研究表明，在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中添加NaCl能使植物乳桿菌產(chǎn)生滯后生長(zhǎng)，而添加ELWE能夠抵消這種滯后效應(yīng)，具體原因可能是植物乳桿菌從ELWE中攝取了某些氨基酸，用以維持系統(tǒng)的滲透壓平衡［25-27］。

益生菌在通過(guò)腸道時(shí)主要面臨的是釋放到十二指腸中的膽鹽，采用9 g/L膽酸鈉脅迫12，24 h后的植物乳桿菌活菌數(shù)如圖3（c）所示。在改良培養(yǎng)基（20 mg/mL）中培養(yǎng)12，24 h后，其存活率均能達(dá)到90%以上。這可能是因?yàn)槎胖偃~中含有鐵、鈣等微量元素，從而降低膽鹽螯合金屬離子對(duì)細(xì)胞造成的傷害；同時(shí)水提取物中還含有豐富的氨基酸，被植物乳桿菌代謝后能夠調(diào)節(jié)其細(xì)胞膜脂肪酸組成，從而提高植物乳桿菌的膽鹽耐受性。

不同濃度ELWE對(duì)植物乳桿菌耐受真空冷凍干燥（60 Pa，-50 ℃，22 h）結(jié)果如圖3（d）所示。添加80 mg/mL ELWE時(shí)，植物乳桿菌的活菌數(shù)最高，與20，320 mg/mL組沒(méi)有顯著差異，但顯著高于對(duì)照組。相關(guān)研究指出，天冬氨酸可顯著提高某些植物乳桿菌真空冷凍干燥后的存活率，主要是由于天冬氨酸能夠增加肽聚糖、長(zhǎng)鏈脂肪酸、不飽和脂肪酸和環(huán)丙烷脂肪酸等含量，減少冷凍干燥過(guò)程對(duì)植物乳桿菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的損傷［28-29］。由于天冬氨酸是杜仲葉中含量最多的游離氨基酸，因此也使得其成為ELWE中可能提高植物乳桿菌凍干存活率的原因之一。

3 結(jié)語(yǔ)

ELWE對(duì)植物乳桿菌的活菌數(shù)和產(chǎn)酸性能有積極影響。在改良培養(yǎng)基（20，80，320 mg/mL）中培養(yǎng)48 h時(shí)，植物乳桿菌的活菌數(shù)分別為（8.92±0.08），（8.84±0.11），（9.11±0.03） lg CFU/mL，顯著高于對(duì)照組［（8.00±0.04） lg CFU/mL］；在改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h時(shí)，乳酸含量分別提高（42.11±0.05）%，（76.05±0.03）%，（111.64±0.07）%。在改良培養(yǎng)基（80，320 mg/mL）中，植物乳桿菌的菌體更加飽滿，且高濃度ELWE能夠使菌體發(fā)生聚集，導(dǎo)致菌體形態(tài)發(fā)生改變。

不同濃度的ELWE對(duì)植物乳桿菌在脅迫環(huán)境中的保護(hù)作用存在一定差異。在胃液環(huán)境的脅迫下，80 mg/mL處理組的對(duì)數(shù)存活率能夠達(dá)到87.77%（3 h）。在熱脅迫（3 h，50 ℃）、NaCl脅迫（10%，24 h）、膽鹽脅迫（0.9%，24 h）和真空冷凍干燥脅迫（60 Pa，-50 ℃，22 h）環(huán)境中，80 mg/mL ELWE對(duì)植物乳桿菌的保護(hù)效果最優(yōu)，其活菌數(shù)可分別保持在（5.67±0.01），（8.16±0.01），（7.65±0.12），（7.78±0.03）lg CFU/mL。因此，不同脅迫環(huán)境中，植物乳桿菌益生特性的改善與ELWE的濃度有關(guān)。ELWE在不同脅迫環(huán)境中對(duì)菌體保護(hù)的最適濃度需要進(jìn)一步研究。此外，目前杜仲葉功能成分分離和純化仍有局限性，而其水提取物更易獲得，這將有利于其在益生菌等保健食品領(lǐng)域中的應(yīng)用。