劉守磊,陳善苗,李耀軍,羅 曉,盧紅蓀,王詩建,沃奇軍,祁小龍

(1.桐鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院 泌尿外科,浙江 桐鄉(xiāng) 314500;2.浙江省人民醫(yī)院 泌尿外科,浙江 杭州 310014)

前列腺癌是一類嚴重危害男性健康的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤,近年來在我國的發(fā)病率呈持續(xù)增長趨勢[1]。盡管得益于診斷水平的提高及手術治療、抗雄激素治療和免疫治療等手段的綜合運用,患者的整體生存狀況已經(jīng)有了一定的改善,但部分患者仍因發(fā)生轉(zhuǎn)移導致死亡[2]。CT45家族是癌睪抗原(cancer/testis antigens,TAs)中的成員之一,由六個高度保守的基因組成,命名為CT45A1到CT45A6[3-4]。CT45A1在多種類型的惡性腫瘤中呈現(xiàn)異常高表達,并通過多種作用機制發(fā)揮著促腫瘤效應[5-7],但CT45A1在前列腺癌細胞中的表達情況及其發(fā)揮的作用尚不明確。本研究分析CT45A1在前列腺癌細胞中的表達情況及對細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響,并從上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化角度探索分子作用機制,希望為靶向CT45A1控制前列腺癌提供實驗性支持。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 高侵襲力人前列腺癌PC-3細胞、低侵襲力人前列腺癌LNCap細胞以及小鼠肺成纖維NIH-3T3細胞,均購自中科院上海生命科學研究院細胞資源中心。LNCap和PC-3細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)基,NIH-3T3細胞置于10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng);所有細胞均放置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑來自Promega公司,熒光定量PCR試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Thermofisher公司,定量PCR引物和shRNA寡核苷酸委托上海生工公司合成。慢病毒包裝載體以及shRNA慢病毒表達載體pLKO.1-puro購自Addgene公司。用于遷移實驗的Transwell小室購自Corning公司,用于侵襲實驗的包被基質(zhì)膠的BD BioCoatTMBD MatrigelTMInvasion Chamber購自BD Biosciences公司。兔抗人CT45A1抗體購自ORIGENE公司,兔抗人β-actin、E-cadherin、Vimentin、Twist、Zeb-1抗體以及辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(二抗)購自Proteintech公司。

1.3 重組shRNA慢病毒表達載體構(gòu)建 按照Addgene網(wǎng)站上提供的方法設計基因特異性shRNA序列。CT45A1 shRNA#1的寡核苷酸的序列為5’-CCGGCCAGCCAATTGGATTCTCAGACTCGAGTCTGA GAATCCAATTGGCTGGTTTTTG-3’和5’-AATTCAA AAACCAGCCAATTGGATTCTCAGACTCGAGTCTGAG AATCCAATTGGCTGG-3’;

CT45A1 shRNA#2的寡核苷酸的序列為5’-CCGGCAGCAGTTTCTCTGGAGATGACTCGAGTCATC TCCAGAGAAACTGCTGTTTT TG-3’和5’-AATTCAA AAACAGCAGTTTCTCTGGAGATGACTCGAGTCATCT CCAGAGAAACTGCTG-3’;

作為陰性對照的Scramble shRNA 的寡核苷酸序列為5’-CCGGCCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCT CGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGGCTCGAGTTTTT G- 3 ’ 和5’-AATTCA AAAACCTAAGGTTAAGTCGC CCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGGCTCG AG-3’。

將合成的shRNA片段進行退火形成寡核苷酸對,同時使用AgeⅠ和EcoRⅠ酶切pLKO.1-puro載體并純化回收,再利用T4DNA連接酶將寡核苷酸對與回收得到的載體進行連接,然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞中。挑選單一克隆進行測序鑒定,鑒定正確的shRNA表達質(zhì)粒分別命名為pLKO.1-puro-shCT45A1#1,pLKO.1-puro-shCT45A1#2和pLKO.1-puro-shScram。

1.4 慢病毒包裝及感染 參照文獻報道[8],使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑將shRNA表達載體與psPax2和pMD2.G病毒包裝載體按 5∶4∶1 的質(zhì)量比轉(zhuǎn)染至293T細胞中;轉(zhuǎn)染8 h后,換成新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h;收集新鮮含病毒上清液過濾后用于PC-3細胞的感染。將感染后的細胞置于含嘌呤霉素的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)72 h,得到的細胞分別標記為shCT45A1#1,shCT45A1#2和shScram。

1.5 實時熒光定量PCR 采用TRIzol試劑提取細胞總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。使用SYBR-Gree方法在Bio-Rad CFX 96 實時定量 PCR 系統(tǒng)上檢測 CT45A1 的表達水平。CT45A1 的上游引物序列為 5’-AGGAAGCAGCAAGATGTATGAG-3’,下游引物序列為5’-CTGGAAGGCTATTTGATTCGG-3’;β-actin(看家基因)的上游引物序列為5’-AAGATCAAGATCATTGCTCCTCC-3’,下游引物序列為5’-GTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3’。PCR 反應條件:94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s,共40個循環(huán)。以2-ΔΔCt值計算 CT45A1 的相對表達水平。

1.6 蛋白免疫印跡(Western blot,WB) 收集細胞提取總蛋白,BCA法對蛋白定量后依次進行SDS PAGE、轉(zhuǎn)膜和脫脂奶粉封閉,分別加入不同的兔抗人多克隆抗體作為一抗,包括抗CT45A1、β-actin、E-cadherin、Zbe-1、Vimentin以及Twist,4 ℃條件下孵育過夜;再用TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG作為二抗,室溫孵育2 h后洗膜以及顯影,使用Quantity One 軟件對各種蛋白的表達豐度進行半定量分析,以β-actin作為內(nèi)參。

1.7 細胞增殖實驗 將細胞懸液以每孔 5×103個細胞/100 μL 的條件接種于96 孔板中,每組細胞設置3個復孔。于不同時間點(4 ～ 96 h)將10 μL 的MTT試劑加入每個孔中,在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后小心吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)液,每孔加入150 μL DMSO后振蕩混勻15 min,至結(jié)晶物充分溶解;使用酶聯(lián)免疫檢測儀測量490 nm處的吸光度。

1.8 Transwell 小室法檢測細胞遷移和侵襲能力

1.8.1 遷移實驗 參照文獻報道[8],收集細胞重懸于含0.1%BSA的無血清培養(yǎng)基中,按照3×104個細胞/150 μL/室加至Transwell小室的上室中,下室加入600 μL無血清條件培養(yǎng)的NIH-3T3細胞上清液作為趨化因子繼續(xù)培養(yǎng)細胞12 h。用棉簽抹凈上層小室內(nèi)的細胞,以甲醇固定后加入結(jié)晶紫溶液染色15 min,洗去多余的染料后晾干。在顯微鏡下觀察并拍照,再切下完整的濾膜置于30%乙酸溶液內(nèi)洗脫,用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測OD570 nm讀數(shù)反映細胞遷移能力。

1.8.2 侵襲實驗 參照文獻報道[8],收集細胞重懸于含0.1% BSA的無血清培養(yǎng)基中,按照6×104個細胞/150 μL/室加至BD BioCoatTMBD MatrigelTMInvasion Chamber的上室,下室同樣加入600 μL NIH-3T3細胞條件培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)細胞18 h,后續(xù)步驟與遷移實驗相同。

1.9 劃痕愈合實驗 將對數(shù)期生長的細胞接種于6孔板中,過夜后細胞均勻鋪成單層。用200 μL移液管尖頭輕輕劃擦穿過孔中心的單層,然后用PBS沖洗3遍以除去漂浮的細胞,加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),于0 h和24 h拍照記錄。用Image J軟件分析并計算劃痕面積(S),細胞劃痕的愈合率(%)=(S0h-S24h)/S0h×100。

2 結(jié)果

2.1 CT45A1在具有不同侵襲力的前列腺癌細胞中的表達情況 熒光定量PCR和WB實驗結(jié)果顯示,PC-3細胞中CT45A1 mRNA的相對表達量(4.37±0.34)、CT45A1的蛋白表達水平(2.49±0.12)明顯高于LNCap細胞,差異均有統(tǒng)計學意義(t=17.23、21.78;均P<0.0001)。見圖1。因此,后續(xù)選用PC-3細胞進行CT45A1基因沉默的實驗學研究。

注:*與LNCap細胞比較,P<0.05。

2.2 shRNA重組慢病毒感染對細胞中CT45A1表達水平的影響 將兩種靶向CT45A1的重組慢病毒包括pLKO.1-puro-shCT45A1#1和pLKO.1-puro-shCT45A1#2,以及陰性對照慢病毒pLKO.1-puro-shScram分別感染PC-3細胞。熒光定量PCR和WB實驗結(jié)果表明,與shScram細胞相比,shCT45A1#1和shCT45A1#2細胞中的CT45A1 mRNA表達水平(圖2A)和蛋白表達水平(圖2B)均明顯下調(diào),差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注:*與shScram細胞比較,P<0.05。

2.3 沉默CT45A1基因?qū)毎鲋衬芰Φ挠绊?采用MTT法檢測shCT45A1#1,shCT45A1#2和shScram細胞的增殖情況。結(jié)果如封三圖1A所示,三種細胞在培養(yǎng)4、24、48、72 和96 h時OD值間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),表明沉默CT45A1基因不影響PC-3細胞的體外增殖能力。

2.4 沉默CT45A1基因?qū)毎w移和侵襲能力的影響 基于Transwell小室的遷移實驗結(jié)果(封三圖1B)顯示,shCT45A1#1組、shCT45A1#2組的穿膜細胞數(shù)(OD值=0.24±0.07、0.31±0.07)低于shScram組(0.74±0.09);劃痕愈合實驗結(jié)果(封三圖1C)顯示,shCT45A1#1和shCT45A1#2組的細胞劃痕愈合率為(57.99±1.43)%、(58.33±3.60)%,均低于shScram細胞組;侵襲小室法分別測試這三種細胞的侵襲能力,結(jié)果如封三圖1D顯示,shCT45A1#1組、shCT45A1#2組的穿膜細胞數(shù)(OD值=0.32±0.04、0.15±0.02)低于shScram組(0.11±0.03);差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5 沉默CT45A1基因?qū)毎掀?間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)表型的影響 WB技術檢測EMT相關的上皮細胞標志物E-cadherin和間質(zhì)細胞標志物Vimentin的表達水平,結(jié)果如圖3所示:與shScram組相比,shCT45A1組中E-cadherin的蛋白表達水平升高,而Vimentin的蛋白表達水平降低,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注:*與shScram組比較,P<0.05。

2.6 沉默CT45A1基因?qū)wist和Zeb-1蛋白表達水平的影響 WB技術檢測shCT45A1#1組,shCT45A1#2組和shScram組細胞中Twist和Zeb-1蛋白的表達水平,結(jié)果如圖3所示:Zeb-1蛋白在shCT45A1#1和shCT45A1#2組細胞中的表達水平明顯低于其在shScram組中的表達水平,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而Twist蛋白在這些組別細胞中的表達水平并無顯著差異(P>0.05)。

3 討論

癌睪抗原CT45A1在多種惡性腫瘤中高度表達且發(fā)揮著提升腫瘤細胞的增殖水平、耐藥性、遷移力和侵襲力的作用,表明其具有原癌基因的特性,然而其在人前列腺癌細胞中的表達情況及其功能尚無人報道。我們在兩種被廣泛使用的人前列腺癌細胞株LNCap和PC-3中測試了CT45A1的mRNA和蛋白的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PC-3細胞表達較高水平的CT45A1 mRNA和蛋白;鑒于PC-3細胞比LNCap細胞具有更強的侵襲能力,筆者推斷CT45A1可能參與調(diào)控了PC-3細胞的侵襲能力。為了進一步明確CT45A1在PC-3細胞中所發(fā)揮的作用,本研究在利用shRNA技術抑制CT45A1基因表達后,系統(tǒng)性分析了PC-3細胞在增殖、遷移和侵襲能力方面的變化情況。本研究采用了2條不同的shRNA干擾片段去沉默CT45A1基因,據(jù)此獲得的攜帶2種不同shRNA干擾片段的PC-3細胞在遷移和侵襲能力以及EMT相關基因表達水平上的變化基本一致,因而所觀察到的研究結(jié)果不太可能是shRNA導致的脫靶效應。

MTT法檢測結(jié)果顯示,PC-3細胞的體外增殖能力在CT45A1基因被沉默后未發(fā)生明顯改變,表明CT45A1蛋白的表達與PC-3 細胞的增殖能力并無直接聯(lián)系。有文獻報道,CT45A1在一些腫瘤細胞如肺癌細胞中具有促進增殖的效應[6],而在另一些腫瘤細胞如纖維肉瘤細胞中敲低其表達水平對細胞增殖水平并無明顯影響[9],因而CT45A1對腫瘤細胞增殖的影響具有細胞背景依賴性。借助于體外遷移實驗和侵襲實驗,我們發(fā)現(xiàn)沉默CT45A1基因?qū)е翽C-3細胞的遷移和侵襲能力受損,表明CT45A1基因發(fā)揮了促進PC-3細胞遷移和侵襲的效應。腫瘤細胞可以通過一種名為EMT的表型轉(zhuǎn)換來提升惡性轉(zhuǎn)化能力進而發(fā)揮促進腫瘤組織局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移的作用,發(fā)生EMT的細胞的典型特征性表現(xiàn)是上皮細胞標志物(如:E-cadherin)表達水平發(fā)生下調(diào)而間質(zhì)細胞標志物(如:Vimentin)表達水平上升;與此同時腫瘤細胞的遷移和侵襲能力,以及體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力明顯增強[10-11]。蛋白印跡法結(jié)果顯示,沉默CT45A1基因?qū)е翽C-3細胞中E-cadherin蛋白表達發(fā)生上調(diào),同時Vimentin 蛋白表達受到抑制,提示沉默CT45A1基因可以通過削弱PC-3細胞的EMT表型來減弱PC-3細胞的遷移和侵襲能力。

Zeb-1和Twist是在生理和病理條件下調(diào)控EMT表型的關鍵轉(zhuǎn)錄因子,二者均在前列腺癌中高度表達,同時它們的高度表達與患者不良預后密切相關[12-17];沉默Zeb-1或者Twist基因均能顯著抑制前列腺癌細胞的EMT表型并降低遷移和侵襲能力[15,17],提示這兩種基因均可以通過誘導EMT來促進前列腺癌細胞的惡性轉(zhuǎn)化。Shang等[5]報道在乳腺癌細胞中過表達CT45A1可以通過提升Twist基因的表達水平來促進EMT的發(fā)生,但本研究發(fā)現(xiàn),敲低CT45A1在抑制前列腺癌細胞EMT的同時并不影響Twist的表達水平,提示我們CT45A1對Twist的調(diào)控具有細胞背景依賴性。有意思的是,本研究發(fā)現(xiàn)敲低CT45A1能顯著降低PC-3細胞中Zeb-1蛋白的表達水平,提示CT45A1可能通過上調(diào)Zeb-1的蛋白表達來誘導EMT進而發(fā)揮促進PC-3細胞遷移和侵襲的作用。值得指出的是,CT45A1對于Zeb-1的這種調(diào)控關系目前尚未有報道,它是否特異性存在于前列腺癌細胞中,抑或也適用于其他腫瘤細胞仍需進一步的探討。另一方面,CT45A1調(diào)控Zeb-1的具體機制也有待闡明,近期Wen等[7]報道CT45A1可以與β-catenin發(fā)生蛋白間互作而促進后者的蛋白表達,需要進一步的研究確認CT45A1是否可能通過類似的機制來調(diào)控Zeb-1蛋白的表達。

綜上所述,CT45A1基因在高侵襲性前列腺癌細胞PC-3中高度表達;盡管沉默CT45A1基因不影響PC-3細胞的增殖能力,卻可以顯著抑制后者的遷移和侵襲,這可能是通過逆轉(zhuǎn)Zeb-1介導的EMT來實現(xiàn)的。鑒于CT45A1能通過驅(qū)動EMT來促進前列腺癌的遷移和侵襲,靶向該分子的治療方法有望用于治療前列腺癌轉(zhuǎn)移。我們的研究還存在一些不足之處,尤其是沒有在荷瘤小鼠模型中探索Zeb-1是否介導了CT45A1對前列腺癌細胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響。