王 艷,蘇林沖,冉瑞金,高圳昱,黃 俠

(1.錦州醫(yī)科大學(xué),遼寧 錦州 121001;2.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院臨床心理科,湖北 恩施 445000;3.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院風(fēng)濕免疫科,湖北 恩施 445000;4.風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 恩施 445000;5.湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院眼科,湖北 恩施 445000)

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以滑膜炎癥為主的自身免疫系統(tǒng)疾病,好發(fā)于手、腕、足等小關(guān)節(jié),其主要特點(diǎn)包括炎癥性、慢性、對(duì)稱(chēng)性,可遷延至全身軟骨、韌帶、關(guān)節(jié)肌腱等,疾病進(jìn)展至晚期可出現(xiàn)不同程度的僵硬畸形,導(dǎo)致患者喪失勞動(dòng)力,嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量,難治性RA較常規(guī)RA患者病情控制難度更大[1]。甲氨蝶呤是一種二氫葉酸還原酶抑制劑,可抑制四氫葉酸活化和脫氧核酸復(fù)制,阻礙T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞增殖同時(shí)誘導(dǎo)其凋亡,進(jìn)而抑制疾病進(jìn)展,但其單一藥物難以控制患者病情[2]。艾拉莫德是一種抗風(fēng)濕藥物,可通過(guò)抑制炎癥因子釋放、免疫球蛋白合成、T淋巴細(xì)胞增殖等作用達(dá)到治療RA的效果,有助于難治性RA患者病情控制[3-4]。目前臨床關(guān)于艾拉莫德聯(lián)合甲氨蝶呤治療難治性RA的機(jī)制尚未明確?；诖?本研究采用艾拉莫德聯(lián)合甲氨蝶呤對(duì)難治性RA患者進(jìn)行治療,分析其對(duì)患者免疫功能及微小RNA-141(microRNA-141,miR-141)和miR-335-5p表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2022年6月至2023年3月收治的難治性RA患者80例隨機(jī)分為甲氨蝶呤組(40例)和聯(lián)合艾拉莫德組(40例)。病例納入標(biāo)準(zhǔn):符合難治性RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[5];能配合完成相關(guān)治療和檢查;近半年無(wú)關(guān)節(jié)骨折等外傷史;對(duì)本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):長(zhǎng)期服用大量非甾體類(lèi)、阿片類(lèi)藥物;具有其他骨科疾病病史;有嚴(yán)重免疫功能缺陷。脫落與剔除標(biāo)準(zhǔn):中途退出本研究者。甲氨蝶呤組男性17例,女性23例;年齡56～75歲,平均(67.36±3.44)歲;病程7個(gè)月至12年,平均(5.38±2.78)年;單側(cè)病變23例,雙側(cè)病變17例。聯(lián)合艾拉莫德組男性15例,女性25例;年齡55～74歲,平均(66.98±4.29)歲;病程6個(gè)月至12年,平均(5.21±2.72)年;單側(cè)病變26例,雙側(cè)病變14例。兩組性別、年齡、病程、單側(cè)或雙側(cè)病變等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。本研究獲湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 治療方法

1.2.1 對(duì)照組:采用甲氨蝶呤片(國(guó)藥準(zhǔn)字H22022674,2.5 mg/片)治療,每次10 mg,每周1次。治療3個(gè)月。

1.2.2 觀察組:采用艾拉莫德片(國(guó)藥準(zhǔn)字H20110084,25 mg/片)聯(lián)合甲氨蝶呤治療。甲氨蝶呤用法、用量同對(duì)照組。艾拉莫德每次25 mg,每日2次。治療3個(gè)月。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 臨床療效:治療3個(gè)月后,根據(jù)《類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷及治療指南》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行療效評(píng)估。相關(guān)指標(biāo)恢復(fù)正常,關(guān)節(jié)疼痛和麻木消失為顯效;相關(guān)指標(biāo)好轉(zhuǎn),關(guān)節(jié)疼痛和麻木緩解為有效;未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)為無(wú)效?？傆行?顯效率+有效率。

1.3.2 免疫功能指標(biāo):采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)患者血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)水平。

1.3.3 血清miR-335-5p、miR-141:使用德國(guó)Qiagen公司提供的試劑盒提取血清總RNA,反轉(zhuǎn)錄后采用PCR反應(yīng)合成miR-335-5p、miR-141。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定miR-335-5p、miR-141表達(dá)量。miR-335-5p正向引物序列為5’-UGUUUUGAGCGGGGGUCAAGAGC-3’,反向引物序列為5’-CUCUCAUUUGCUAUAUUCA-3’。miR-141正向引物序列為5’-GCCTGTAGCTTTTCCTACT-3’, 反向引物序列為5’-CACGGCGGTTCGTCGAGT-3’。內(nèi)參U6正向引物序列為5’-TCCAAACTAACCTTGTGCCATAC-3’,反向引物序列為5’-ACACCCTTGGGTACTACATCTCC-3’。

1.3.4 血清骨代謝指標(biāo):治療前和治療3個(gè)月后,采用ELISA檢測(cè)患者血清Ⅰ型膠原交聯(lián)羧基末端肽(CTX-Ⅰ)、類(lèi)風(fēng)濕因子(RF)、骨堿性磷酸酶(B-ALP)水平。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血清分泌型糖蛋白-3α(Wnt-3α)水平。

1.3.5 血清炎癥因子水平:治療前和治療3個(gè)月后,采用ELISA檢測(cè)患者血清白細(xì)胞介素-1(IL-1)、IL-6、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。

1.3.6 癥狀改善情況:治療前和治療3個(gè)月后,統(tǒng)計(jì)兩組晨僵時(shí)間和疾病活動(dòng)情況。采用28個(gè)關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)度(DSA28)評(píng)分[6]對(duì)患者疾病活動(dòng)情況進(jìn)行評(píng)估,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)收集指標(biāo)包括關(guān)節(jié)壓痛指數(shù)(檢測(cè)各受累關(guān)節(jié)壓痛級(jí)別,無(wú)壓痛為0級(jí),輕度壓痛為1級(jí),中度壓痛為2級(jí),重度壓痛為3級(jí),最后相加得總指數(shù))、關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)(檢測(cè)各受累關(guān)節(jié)腫脹級(jí)別,無(wú)腫脹為0級(jí),輕度腫脹為1級(jí),重度腫脹為2級(jí),最后相加得總指數(shù))、疼痛視覺(jué)模擬量表(VAS)評(píng)分和紅細(xì)胞沉降率(ESR)等。DSA28評(píng)分越高,表明患者疾病活動(dòng)度越嚴(yán)重。

1.3.7 不良反應(yīng):統(tǒng)計(jì)兩組治療期間惡心嘔吐、白細(xì)胞減少、肝功能異常、皮疹發(fā)生情況。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者臨床療效比較 見(jiàn)表1。治療3個(gè)月后,聯(lián)合艾拉莫德組總有效率高于甲氨蝶呤組(χ2=4.242,P=0.039)。

表1 兩組患者臨床療效比較[例(%)]

2.2 兩組患者免疫功能指標(biāo)及血清miR-141、miR-335-5p水平比較 見(jiàn)表2。治療3個(gè)月后,兩組血清IgG、IgA、IgM、miR-141水平較治療前降低,且聯(lián)合艾拉莫德組低于甲氨蝶呤組(均P<0.05);血清miR-335-5p水平較治療前升高,且聯(lián)合艾拉莫德組高于甲氨蝶呤組(均P<0.05)。

表2 兩組患者免疫功能指標(biāo)及血清miR-141、miR-335-5p水平比較

2.3 兩組患者血清骨代謝指標(biāo)水平比較 見(jiàn)表3。治療3個(gè)月后,兩組血清CTX-Ⅰ、RF、Wnt-3α水平較治療前降低,且聯(lián)合艾拉莫德組低于甲氨蝶呤組(均P<0.05);血清B-ALP水平較治療前升高,且聯(lián)合艾拉莫德組高于甲氨蝶呤組(均P<0.05)。

表3 兩組患者血清骨代謝指標(biāo)水平比較

2.4 兩組患者血清炎癥因子水平比較 見(jiàn)表4。治療3個(gè)月后,兩組血清IL-1、IL-6、CRP、TNF-α水平較治療前降低,且聯(lián)合艾拉莫德組低于甲氨蝶呤組(均P<0.05)。

表4 兩組患者血清炎癥因子水平比較

2.5 兩組患者癥狀改善情況比較 見(jiàn)表5。治療3個(gè)月后,兩組晨僵時(shí)間較治療前縮短,且聯(lián)合艾拉莫德組短于甲氨蝶呤組(均P<0.05);DAS28評(píng)分、關(guān)節(jié)壓痛指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)較治療前降低,且聯(lián)合艾拉莫德組低于甲氨蝶呤組(均P<0.05)。

表5 兩組患者癥狀改善情況比較

2.6 兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生情況比較 見(jiàn)表6。治療期間,聯(lián)合艾拉莫德組與甲氨蝶呤組總不良反應(yīng)發(fā)生率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.125,P=0.723)。

表6 兩組患者不良反應(yīng)發(fā)生情況比較[例(%)]

3 討 論

RA是臨床常見(jiàn)的自身免疫疾病,患者臨床主要表現(xiàn)為小關(guān)節(jié)腫脹、疼痛及晨僵,同時(shí)可能伴隨關(guān)節(jié)骨質(zhì)受損及慢性疼痛,且具有容易反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn),可對(duì)患者生活工作產(chǎn)生嚴(yán)重影響[7-10]。而難治性RA則是患者經(jīng)兩種及以上抗風(fēng)濕藥物治療6個(gè)月以上,患者病情仍處于活動(dòng)狀態(tài)的一類(lèi)RA疾病,若病情不能有效控制,可引起患者關(guān)節(jié)功能喪失[11-12]。甲氨蝶呤是治療RA的常用藥物,可通過(guò)抑制T淋巴細(xì)胞增殖發(fā)揮免疫抑制和抗炎效果,但對(duì)于難治性RA患者,其作用效果欠佳,不能有效改善患者臨床癥狀[13]。

免疫功能亢進(jìn)是導(dǎo)致RA發(fā)生的主要病理機(jī)制之一。免疫球蛋白是體液免疫的主要物質(zhì)成分,其水平異常升高可引起患者體液免疫功能紊亂,促進(jìn)RA患者病情發(fā)生和發(fā)展[14]。miR-141表達(dá)可能與骨組織細(xì)胞活性有關(guān)。研究[15]顯示,股骨頭壞死小鼠模型骨組織中miR-141呈高表達(dá)活性,而抑制miR-141表達(dá)則可提高成骨細(xì)胞活性,有助于抑制小鼠股骨頭壞死進(jìn)展,對(duì)于難治性RA患者,miR-141水平升高可能對(duì)患者病情進(jìn)展、關(guān)節(jié)損傷具有促進(jìn)作用;miR-335-5p降低則可能促進(jìn)難治性RA患者病情進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示,聯(lián)合艾拉莫德組治療3個(gè)月后總有效率高于甲氨蝶呤組,血清IgG、IgA、IgM、miR-141水平及DAS28評(píng)分、關(guān)節(jié)壓痛指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹指數(shù)低于甲氨蝶呤組,血清miR-335-5p水平高于甲氨蝶呤組,晨僵時(shí)間短于甲氨蝶呤組,說(shuō)明艾拉莫德聯(lián)合甲氨蝶呤可調(diào)節(jié)難治性RA患者免疫功能及血清miR-141、miR-335-5p水平,改善患者臨床癥狀,有助于患者病情控制。艾拉莫德對(duì)機(jī)體免疫功能具有重要的調(diào)節(jié)作用:一方面,可下調(diào)輔助性T淋巴細(xì)胞17關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子孤兒核受體的表達(dá),從而抑制輔助性T淋巴細(xì)胞17的增殖和活性,同時(shí)可提高調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平[16-17];另一方面,艾拉莫德對(duì)B淋巴細(xì)胞合成免疫球蛋白具有抑制作用,但不會(huì)引發(fā)阻滯效應(yīng),因此可有效調(diào)節(jié)難治性RA患者機(jī)體免疫功能,緩解患者病情進(jìn)展,進(jìn)而對(duì)miR-141、miR-335-5p的表達(dá)和合成產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用[18-19]。

骨代謝指標(biāo)對(duì)于評(píng)估難治性RA患者病情進(jìn)展情況具有重要意義。CTX-Ⅰ主要由骨吸收產(chǎn)生,因此其水平升高說(shuō)明患者機(jī)體骨吸收加劇。RF水平升高可能對(duì)患者病情進(jìn)展具有促進(jìn)作用。Wnt-3α是分泌型糖蛋白家族重要成員,其水平升高說(shuō)明骨破壞相關(guān)的信號(hào)通路被異常激活,可引起骨形成代償負(fù)荷加重,骨重建紊亂,進(jìn)而加重患者病情。B-ALP可直接反映骨形成過(guò)程,其水平升高說(shuō)明患者骨形成速度增快。此外,炎癥反應(yīng)加劇可促進(jìn)難治性RA患者骨破壞加劇,并促進(jìn)患者病情進(jìn)展[20-22]。本研究結(jié)果顯示,聯(lián)合艾拉莫德組治療3個(gè)月后血清CTX-Ⅰ、RF、Wnt-3α、IL-1、IL-6、CRP、TNF-α水平低于甲氨蝶呤組,血清B-ALP水平高于甲氨蝶呤組。艾拉莫德對(duì)抗骨吸收和促骨形成具有重要促進(jìn)作用,可保護(hù)患者骨質(zhì),抑制破骨細(xì)胞生成,促使機(jī)體骨質(zhì)重塑。此外,其對(duì)機(jī)體炎癥因子的合成也具有重要抑制作用,可促進(jìn)炎癥反應(yīng)中的緩激肽水平降低,選擇性環(huán)氧合酶抑制,因此抑制前列腺素生成,降低患者機(jī)體炎癥反應(yīng),進(jìn)一步緩解患者炎癥性骨損傷[23-26]。最后,本研究結(jié)果顯示,聯(lián)合艾拉莫德組與甲氨蝶呤組治療期間總不良反應(yīng)發(fā)生率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明在甲氨蝶呤的基礎(chǔ)上聯(lián)合艾拉莫德治療難治性RA患者,不會(huì)增加不良反應(yīng)的發(fā)生,安全性良好。

綜上所述,相較于單純甲氨蝶呤治療,艾拉莫德聯(lián)合甲氨蝶呤可進(jìn)一步改善難治性RA患者免疫功能,改善相關(guān)細(xì)胞因子水平及炎癥反應(yīng),緩解患者癥狀,同時(shí)具有良好安全性。艾拉莫德的治療作用可能與調(diào)控血清miR-141、miR-335-5p水平有關(guān)。但本研究亦存在一定不足,如樣本量少、為單中心研究、未進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪等,臨床可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行多中心研究。