李 玥,陳俊逾

(新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院神志科,新疆 烏魯木齊 830099)

抑郁癥是自殺率較高的疾病,發(fā)病率逐年上升,男女比例高達1.7∶1[1]。目前,治療抑郁癥的藥物根據(jù)不同作用機制分為選擇性5-羥色胺重攝取抑制劑(Selective serotonin reuptake inhibitor,SSRI)、5-羥色胺/去甲腎上腺素再攝取抑制劑(Serotonin-norepinephrine reuptake inhibitor,SNRI)和三環(huán)類抗抑郁藥(Tricyclic antidepressant,TCA)等,以上藥物均是基于抑郁癥單胺類遞質(zhì)紊亂假說,主要作用于抑郁患者腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)[2]。然而,多數(shù)藥物在治療過程中具有起效慢、效率低以及不良反應(yīng)大等特點[3]。因此,需進一步探究抑郁癥的病因及發(fā)病機制,為研制出起效快、特異性高且不良反應(yīng)小的藥物提供理論依據(jù)。鐵死亡是程序性細(xì)胞死亡過程,與鐵代謝紊亂密切相關(guān)[4]。已有研究[5]證實,鐵死亡可能成為研究抑郁機制和抗抑郁藥物的新靶點。在鐵死亡過程中核受體共激活因子4(Nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)起到關(guān)鍵作用,其下調(diào)可以抑制鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin誘導(dǎo)的鐵積累和脂質(zhì)過氧化,以及隨后鐵死亡的發(fā)生[6]。姜黃醇又稱莪術(shù)醇,是傳統(tǒng)中藥莪術(shù)、溫郁金的有效活性成分,是一種具有生物活性的小分子倍半萜化合物[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn),姜黃醇通過調(diào)控NCOA4抑制鐵蛋白吞噬,進而抑制非酒精性脂肪肝小鼠肝細(xì)胞衰老。研究[9]發(fā)現(xiàn),溫郁金對抑郁癥的治療起到積極作用。因此,本研究探究姜黃醇是否可以通過調(diào)控NCOA4介導(dǎo)的自噬調(diào)控鐵死亡,進而起到抗抑郁的效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠90只,7周齡,體重220～235 g,購自浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,動物許可證號:SCXK(浙)2021-0006。飼養(yǎng)條件為溫度(25±1)℃,濕度(65±5)%,光照-黑暗循環(huán)12 h。本研究經(jīng)本院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 姜黃醇(批號:HY-N0104)購自美國MCE公司;鐵死亡誘導(dǎo)劑Erastin(批號:S80804)購自上海源葉生物有限公司;NCOA4、微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅰ(LC3-Ⅰ)、LC3-Ⅱ、谷胱甘肽過氧化物酶4(GPX4)、環(huán)氧合酶2(COX2)、長鏈脂酰輔酶A合成酶4(ACSL4)、環(huán)加氧酶2(PTGS2)抗體(批號:ab86707、ab245089、ab192890、ab125066、ab179800、ab155282、ab283574)購自Abcam公司;鐵含量測定試劑盒(批號:K390-100)購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型構(gòu)建:采用Erastin誘導(dǎo)大鼠急性抑郁模型。用99.9%異氟醚麻醉大鼠后,將頭部放置在立體定位裝置中,顱骨暴露在外。在左、右半球分別鉆出小孔,以便給藥。插入一根26規(guī)格不銹鋼針(坐標(biāo):顱骨下3.5 mm,前囟后4.8 mm,中縫左、右2.5 mm)并連接Hamilton注射器。注射2.5 μl濃度為200 ng/μl的Erastin,將針頭放置5 min,使藥物擴散。另一半球重復(fù)上述操作。

1.3.2 分組及處理:根據(jù)隨機數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、Erastin組、姜黃醇組、姜黃醇+pcDNA-NC組、姜黃醇+pcDNA-NCOA4組,每組18只。假手術(shù)組在模型構(gòu)建時只放置針頭,不注射藥物。姜黃醇組腹腔注射姜黃醇10 mg/kg,每天1次,連續(xù)2周[10]。姜黃醇+pcDNA-NC組在腹腔注射10 mg/kg姜黃醇的基礎(chǔ)上通過尾靜脈注射pcDNA-NC,每周2次,注射2周,共4次。姜黃醇+pcDNA-NCOA4組在腹腔注射10 mg/kg姜黃醇的基礎(chǔ)上尾靜脈注射pcDNA-NCOA4,每周2次,注射2周,共4次。假手術(shù)組和Erastin組分別給予等量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射(每天1次,連續(xù)2周)和尾靜脈注射(每周2次,注射2周,共4次)。

1.3.3 動物行為學(xué)評價

1.3.3.1 糖水偏好實驗(SPT):實驗前剝奪大鼠食物和水24 h。將每只大鼠單獨放在籠子里,分別放置一瓶水和一瓶1%蔗糖溶液。讓其自由飲水12 h,記錄蔗糖溶液和水的消耗量。蔗糖水偏好(%)=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。

1.3.3.2 曠場實驗(OFT):使用ANYmaze軟件中開放野外功能對大鼠進行監(jiān)測。在軟件中,立方體開箱長度和寬度均50 cm,平均分為25個正方形,中間9個為中心區(qū)域,大鼠為監(jiān)測點。將每只大鼠放入盒子后,記錄中心區(qū)域移動距離、靜止時間和5 min內(nèi)交叉次數(shù)。每只老鼠完成測試后,用75%乙醇噴灑箱子并擦拭,避免氣味干擾。

1.3.3.3 懸尾實驗(TST):固定大鼠尾部使其頭部朝下,頭部距地面50 cm,記錄大鼠4 min內(nèi)的靜止時間。

1.3.3.4 強迫游泳實驗(FST):實驗前給予5 d適應(yīng)性訓(xùn)練。訓(xùn)練結(jié)束24 h后將大鼠放入高40 cm、直徑28 cm、水深30 cm的玻璃容器中,水溫25 ℃左右。總游泳時間為6 min,記錄最后4 min大鼠的靜止時間。

1.3.4 線粒體形態(tài)觀察:每組取6只大鼠,麻醉并處死,將大鼠海馬組織(1 mm×1 mm×1 mm)用2.5%戊二醛在4 ℃下固定過夜。用磷酸緩沖液沖洗3次,經(jīng)梯度乙醇脫水,然后包埋、切片,切片厚度為60～80 nm,通過透射電子顯微鏡觀察線粒體形態(tài)。

1.3.5 鐵含量測定:每組取6只大鼠,麻醉并處死,采用微波消化法對海馬組織樣品進行預(yù)處理,然后通過鐵含量測定試劑盒測定鐵含量。采用Multiskan GO檢測系統(tǒng)在波長593 nm處檢測平均光密度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總鐵和亞鐵含量。

1.3.6 自噬以及鐵死亡相關(guān)蛋白檢測:將各組剩余6只大鼠海馬組織加入RIPA蛋白裂解液提取總蛋白,通過BCA法檢測蛋白質(zhì)濃度。各組取20 μg總蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)樣品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,用5%脫脂牛奶封閉膜2 h。加入自噬蛋白(NCOA4、LC3)、鐵死亡相關(guān)蛋白(GPX4、COX2、ACSL4、PTGS2)抗體在4 ℃孵育過夜,加入二抗室溫孵育2 h。加入ECL試劑顯色,采用Image J軟件分析目標(biāo)蛋白的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較 見表1。與假手術(shù)組比較,Erastin組大鼠蔗糖水偏好、OFT中心區(qū)移動距離、OFT交叉次數(shù)降低,FST靜止時間、TST靜止時間、OFT靜止時間升高(均P<0.05)。與Erastin組比較,姜黃醇組蔗糖水偏好、OFT中心區(qū)移動距離、OFT交叉次數(shù)升高,FST靜止時間、TST靜止時間、OFT靜止時間降低(均P<0.05)。與姜黃醇組、姜黃醇+pcDNA-NC組比較,姜黃醇+pcDNA-NCOA4組蔗糖水偏好、OFT中心區(qū)移動距離、OFT交叉次數(shù)降低,FST靜止時間、TST靜止時間、OFT靜止時間升高(均P<0.05)。

表1 各組大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較

2.2 各組大鼠海馬組織線粒體形態(tài)比較 見圖1。假手術(shù)組海馬組織線粒體結(jié)構(gòu)正常。與假手術(shù)組比較,Erastin組線粒體腫脹,線粒體嵴丟失。與Erastin組比較,姜黃醇組線粒體腫脹、線粒體嵴丟失現(xiàn)象改善,線粒體結(jié)構(gòu)與假手術(shù)組相似;姜黃醇+pcDNA-NCOA4組與Erastin組海馬組織線粒體損傷現(xiàn)象相似。

圖1 各組大鼠海馬組織透射電鏡下線粒體形態(tài)(×15000)

2.3 各組大鼠海馬組織總鐵和亞鐵含量比較 見表2。Erastin組大鼠總鐵及亞鐵含量較假手術(shù)組升高(均P<0.05)。姜黃醇組總鐵及亞鐵含量較Erastin 組降低(均P<0.05)。姜黃醇+pcDNA-NCOA4組總鐵及亞鐵含量較姜黃醇組、姜黃醇+pcDNA-NC組升高(均P<0.05)。

表2 各組大鼠海馬組織總鐵和亞鐵含量比較(μg/mg)

2.4 各組大鼠海馬組織自噬蛋白及鐵死亡相關(guān)蛋白表達水平比較 見表3。與假手術(shù)組比較,Erastin 組NCOA4、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、COX2、ACSL4、PTGS2蛋白表達水平升高,GPX4蛋白表達水平降低(均P<0.05)。與Erastin組比較,姜黃醇組GPX4蛋白表達水平升高,NCOA4、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、COX2、ACSL4、PTGS2蛋白表達水平降低(均P<0.05)。與姜黃醇組、姜黃醇+pcDNA-NC組比較,姜黃醇+pcDNA-NCOA4組NCOA4、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、COX2、ACSL4、PTGS2蛋白表達水平升高,GPX4蛋白表達水平降低(均P<0.05)。

表3 各組大鼠海馬組織自噬蛋白及鐵死亡相關(guān)蛋白表達水平比較

3 討 論

抑郁癥是一種常見的慢性精神障礙性疾病,影響著全球超過3.5億人[11-13]。2008年,世界衛(wèi)生組織將抑郁癥列為全球疾病負(fù)擔(dān)的第三大因素[1]。到目前為止,相當(dāng)多的抑郁癥患者對一線抗抑郁治療反應(yīng)不佳,或出現(xiàn)不良反應(yīng),導(dǎo)致治療中斷或復(fù)發(fā)[14-15]。因此,需要尋找新的藥物來提高療效。

姜黃醇是一種天然化合物,大量研究[16-17]發(fā)現(xiàn)姜黃醇具有抗炎、抗氧化等藥理作用,在癌癥等多種疾病中發(fā)揮積極效果。姜黃醇可通過抑制神經(jīng)元興奮性來抑制癲癇的疾病進展,抑郁癥和癲癇同屬于神經(jīng)系統(tǒng)性疾病,故姜黃醇可能成為治療抑郁癥的潛在藥物[18]。本文的創(chuàng)新點在于首次探究了姜黃醇對抑郁癥的改善作用和具體作用機制。本研究發(fā)現(xiàn),抑郁癥大鼠蔗糖水偏好、中心區(qū)移動距離、交叉次數(shù)顯著下降,FST靜止時間、TST靜止時間、OFT靜止時間顯著升高,提示Erastin誘導(dǎo)抑郁癥大鼠造模成功,而經(jīng)姜黃醇處理后,大鼠蔗糖水偏好、中心區(qū)移動距離、交叉次數(shù)顯著升高,FST靜止時間、TST靜止時間、OFT靜止時間顯著下降,提示姜黃醇對大鼠抑郁癥起到改善作用。

鐵自噬是一種新型的自噬,鐵蛋白通過自噬溶酶體途徑降解釋放鐵到細(xì)胞質(zhì)中,在調(diào)節(jié)鐵穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[19]。越來越多的證據(jù)表明,鐵自噬參與了神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制,包括阿爾茨海默病、帕金森病和抑郁癥[20]。NCOA4是一種普遍表達的細(xì)胞內(nèi)蛋白,介導(dǎo)鐵蛋白(細(xì)胞鐵儲存復(fù)合物)的自噬降解,對于維持全身鐵平衡至關(guān)重要[21]。據(jù)報道,敲低NCOA4基因降低了鐵蛋白的降解,同時導(dǎo)致了鐵代謝紊亂。本研究通過檢測自噬標(biāo)志因子發(fā)現(xiàn),姜黃醇處理后抑郁癥大鼠NCOA4、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表達水平、總鐵及亞鐵含量顯著降低,提示姜黃醇可能通過抑制NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬對大鼠抑郁癥起到改善作用。

有研究[22]報道,自噬通過鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵水平和鐵死亡。鐵死亡是一種依賴于鐵離子的非凋亡程序性細(xì)胞死亡模式。NCOA4使細(xì)胞內(nèi)的鐵蛋白轉(zhuǎn)移至自噬溶酶體中并釋放游離鐵,在多種鐵依賴的生理過程中發(fā)揮作用。當(dāng)鐵自噬過度激活時,細(xì)胞內(nèi)的鐵過量沉積,誘導(dǎo)谷胱甘肽耗盡和GPX4表達降低,進而導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破裂,最終引起細(xì)胞鐵死亡[23]。鐵死亡的發(fā)生與PTGS2的增加有關(guān)。PTGS2編碼的COX2基因在鐵死亡誘導(dǎo)劑的作用下顯著表達[24-25]。GPX4是一種硒蛋白,用于修復(fù)哺乳動物脂質(zhì)細(xì)胞的氧化損傷,可以通過抑制鐵依賴性脂質(zhì)過氧化防止鐵死亡的發(fā)展。增加GPX4蛋白水平,降低COX2、ACSL4、PTGS2蛋白水平可以抑制鐵死亡,改善暴露于氧葡萄糖剝奪/復(fù)氧的神經(jīng)元損傷[26]。JIAO等[5]發(fā)現(xiàn),抑郁癥大鼠COX2、ACSL4、PTGS2蛋白水平顯著升高,而GPX4蛋白水平顯著下降,與本研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃醇處理后線粒體腫脹,線粒體嵴丟失現(xiàn)象改善,COX2、ACSL4、PTGS2蛋白水平顯著降低,GPX4蛋白水平顯著升高,提示姜黃醇可能通過抑制NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬進而抑制鐵死亡,對大鼠抑郁癥起到改善作用。有研究[27]發(fā)現(xiàn),姜黃醇通過促進NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬誘導(dǎo)鐵死亡,進而起到抗纖維化的作用,與本文的結(jié)果相反,這可能是由于疾病類型不同導(dǎo)致的。為進一步證實,本研究過表達NCOA4后結(jié)果顯示,NCOA4消除了姜黃醇對抑郁癥大鼠的有利影響。

綜上所述,姜黃醇可能通過抑制NCOA4介導(dǎo)的鐵自噬抑制鐵死亡,對抑郁癥起到治療效果。