呂凱波，巢誠，張星雨，夏卿，徐文廣，陳靜，張芳芳

（1.天津科技大學 生物工程學院，天津 300457；2.武漢工商學院 環(huán)境與生物工程學院，湖北 武漢 430065）

雙蛋白食品是以優(yōu)質動植物蛋白為主要營養(yǎng)基料配制研發(fā)的新型營養(yǎng)食品[1]，《國民營養(yǎng)計劃（2017-2030 年）》指出要著力發(fā)展雙蛋白食品，實施“中國特色雙蛋白工程”[2-3]。雙蛋白食品具有促進肌肉蛋白的合成、增強免疫力、調節(jié)骨脂代謝等功效[4-5]，而蛋白質分子經過發(fā)酵更易被人們消化和吸收，具有改善腸道健康、緩解乳糖不耐癥等功能[6-8]。雞蛋中含有豐富的蛋白質，生物價可達94%，營養(yǎng)學家稱之為標準蛋白質[9-10]。雞蛋煮熟并酶解后具有較強抗氧化能力并能有效減少過敏反應[11-12]，是蛋白質食品的優(yōu)質原料。

近幾年國內對雙蛋白食品的研究逐漸增多，如大豆玉米雙蛋白[13]、刺梨雙蛋白奶制品[14]、花生雙蛋白發(fā)酵乳[15]等，多是在豆乳和牛乳的基礎上添加其他植物蛋白或適量風味物質調配而成，產品原料和加工方式比較單一，以雞蛋或其酶解液作為原料制備雙蛋白食品工藝鮮有報道。

牛奶中鈣含量高，能有效彌補雞蛋液中鈣含量較低的問題；雞蛋通過酶解后與豆?jié){混合發(fā)酵可有效掩蓋蛋腥味，解決豆?jié){中蛋氨酸不足的問題。雞蛋酶解液、豆?jié){、牛奶共同作為原料，其發(fā)酵產品既能具有高鈣高蛋白的營養(yǎng)性又能具有較好的口感。本試驗以雞蛋酶解液、豆?jié){和牛奶為原料，通過單因素和正交試驗得出最佳發(fā)酵條件，以期為豐富新產品研發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆（十月稻田黃豆）、雞蛋、全脂滅菌純牛奶：市售；中性蛋白酶（5 萬U/g）：圣斯德有限公司；佰生優(yōu)酸奶發(fā)酵菌（嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、瑞士乳桿菌質量比為10∶3∶4）：善恩康生物科技（蘇州）有限公司；石油醚（分析純）：天津市永大化學有限公司；D-異抗血酸鈉、β-環(huán)糊精、羧甲基纖維素鈉、卡拉膠（均為食品級）：富康生物有限公司；硼酸、氨水、氫氧化鈉、硫酸、鹽酸、酚酞（均為分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；甲基紅、亞甲基藍、七水硫酸鈷（均為分析純）：天津市百世化工有限公司；硫酸銅（分析純）：天津市河北區(qū)海晶精細化工廠；硫酸鉀（分析純）：北京亞太龍興化工有限公司；甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸（glycine-glycine-tyrosine-arginine，Gly-Gly-Tyr-Arg）標準品（純度≥95%）：Sigma 公司；胰蛋白酶（2 000 U/g）：杭州三葉生物化工廠；Protamex 復合蛋白酶（150 000 U/g）：Novozyme 公司。

1.2 儀器與設備

DJ12B-A605SG 豆?jié){機：九陽股份有限公司；JM2002電子分析天平：上海軒澄儀器有限公司；HN25S 恒溫培養(yǎng)箱：北京市恒諾利興科技有限公司；UV-9100 紫外可見分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；BO220 恒溫水浴鍋：上海試驗儀器廠有限公司；GZX-9420MBE 電熱恒溫鼓風干燥箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；LD5-2A 低速離心機：北京醫(yī)用離心機廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶解液的制備

雞蛋洗凈煮熟后冷卻剝殼碾碎，與水按質量比3∶7（即雞蛋質量分數(shù)為30%）混合攪拌均勻過50 目篩，按0.3 g/100 mL 比例加入中性蛋白酶，50 ℃下酶解2 h，95 ℃滅活30 min 后得到雞蛋酶解液備用[16]。

1.3.2 豆?jié){的制備

將黃豆干豆浸泡24 h 后，干豆與水按質量比1∶8放入豆?jié){機煮沸研磨，冷卻過濾得到豆?jié){備用[16]。

1.3.3 發(fā)酵乳制備工藝

將雞蛋酶解液、豆?jié){和牛奶按一定比例混合制備雙蛋白發(fā)酵原料液，發(fā)酵制得雙蛋白發(fā)酵乳，加入添加劑調配得到成品[16]。具體工藝見圖1。

圖1 發(fā)酵乳制備工藝Fig.1 Preparation process of fermented milk

1.3.4 雙蛋白發(fā)酵乳發(fā)酵工藝研究

1.3.4.1 雞蛋酶解液、豆?jié){、牛奶比例篩選

在蔗糖添加量為8%（質量分數(shù)）、發(fā)酵菌接種量為12%、發(fā)酵溫度為40 ℃、發(fā)酵時間為4 h 條件下發(fā)酵，考察雞蛋酶解液、豆?jié){、牛奶不同占比對感官評分的影響。

1.3.4.2 發(fā)酵單因素試驗

在雞蛋酶解液、豆?jié){、牛奶體積比為1∶3∶1 時，考察蔗糖添加量、發(fā)酵菌接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間4個因素對雙蛋白發(fā)酵乳感官評分的影響。

蔗糖添加量的影響：在發(fā)酵菌接種量為12%、發(fā)酵溫度為40 ℃、發(fā)酵時間為4 h 條件下，考察蔗糖添加量（6%、7%、8%、9%、10%）（質量分數(shù)）對感官評分的影響。

發(fā)酵菌接種量的影響：在蔗糖添加量為8%（質量分數(shù)）、發(fā)酵溫度為40 ℃、發(fā)酵時間為4 h 條件下，考察發(fā)酵菌接種量（6%、8%、10%、12%、14%）對感官評分的影響。

發(fā)酵溫度的影響：在蔗糖添加量為8%（質量分數(shù)）、發(fā)酵菌接種量為12%、發(fā)酵時間為4 h 條件下，考察發(fā)酵溫度（39、41、43、45、47 ℃）對感官評分的影響。

發(fā)酵時間的影響：在蔗糖添加量為8%（質量分數(shù)）、發(fā)酵菌接種量為12%、發(fā)酵溫度為40 ℃條件下，考察發(fā)酵時間（2、3、4、5、6 h）對感官評分的影響。

1.3.4.3 發(fā)酵正交試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，選擇蔗糖添加量、發(fā)酵菌接種量和發(fā)酵時間3 個因素，以感官評分作為考察指標，按表1 設計L9（33）的正交試驗，確定最佳發(fā)酵工藝。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.5 雙蛋白發(fā)酵乳的調配

經反復篩選，加入D-異抗壞血酸鈉0.10%、β-環(huán)糊精0.15%、羧甲基纖維素鈉0.20%、卡拉膠0.10%，將其中一個因素添加量設置為0.10%、0.15%、0.20%，其他因素不變，考察其持水率、感官評分、酸度，以感官評分為指標確定添加劑的用量。

1.3.6 感官評價

每次組織品評人10 名，男女各半，參照文獻[17]并稍作修改制定評分標準，見表2，從色澤、氣味與滋味、組織狀態(tài)、雜質四方面對產品品質進行評價，采用百分制計算評價結果[18]。

表2 發(fā)酵乳的感官評價標準Table 2 Sensory evaluation criteria of fermented milk

1.3.7 產品品質分析指標

持水率的測定參照文獻[18]的方法并稍作修改，取10 mL 樣品放入離心管，離心管質量記w1（g），加入樣品后的質量記為w2（g），離心速度為6 000 r/min，離心10 min，靜置10 min，吸去上清液，此時質量記為w3（g）。持水率（M，%）計算公式如下。

酸度參照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準食品酸度的測定》[19]中的方法進行測定。

脂肪含量參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》[20]中索氏抽提法進行測定。

非脂乳固體含量參照GB 5413.39—2010《食品安全國家標準乳和乳制品中非脂乳固體的測定》[21]進行測定。

蛋白質含量參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[22]中凱氏定氮法進行測定。

多肽含量的測定：參照文獻[23]的方法測定，用三氯乙酸法沉淀大分子蛋白質離心過濾后，在上清液中加入雙縮脲試劑，540 nm 下測定其OD 值，測得Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標準曲線為y=0.368 1x+0.001 2（R2=0.999 7），根據(jù)標準曲線計算多肽含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗重復3 次，結果以平均值和標準差表示，采用Excel 2016 計算作圖，SPSS 27 統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 雙蛋白發(fā)酵液制備及發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1.1 雞蛋酶解液、豆?jié){、牛奶體積比篩選

在蔗糖添加量為8%（質量分數(shù)）、發(fā)酵菌接種量為12%、發(fā)酵溫度為40 ℃、發(fā)酵時間為4 h 條件下，根據(jù)1.3.3 制備雙蛋白發(fā)酵乳，其感官評分見表3。

表3 雙蛋白發(fā)酵液組成比例及感官評分結果Table 3 Composition ratio and sensory evaluation of the double protein fermented milk

由表3 可知，當雞蛋酶解液添加量占比40% 以上時，改變另外兩個原料比例，評分均在75.00 分以下，表現(xiàn)為氣味與滋味較差，可能是因為酶解液過多使發(fā)酵乳具有明顯蛋腥味。

當雞蛋酶解液添加量占比40% 以下且豆?jié){占比40% 以下時，其氣味與滋味得分變化不明顯，但組織狀態(tài)得分較高?？赡苁请u蛋中低密度脂蛋白、卵黃球蛋白等會在加熱變性過程中增強分子間疏水作用，形成凝膠，因此發(fā)酵乳狀態(tài)均一，組織狀態(tài)得分較高[24]。當雞蛋酶解液添加量占總比40% 以下且豆?jié){占比40%以上時，其牛奶與雞蛋酶解液加入量相等，發(fā)酵乳氣味與滋味、雜質得分較優(yōu)，而組織狀態(tài)得分較低。推測可能是牛奶與雞蛋等量混合，雞蛋酶解液中干物質含量高，體系不能很好地其起到稀釋作用，致使組織狀態(tài)不均一。

當雞蛋酶解液添加量占比40% 時，豆?jié){與牛奶在不同比例下得分變化較大，當三者體積比為2∶1∶2 時，雜質得分較高，因為此比例下雞蛋酶解液與牛奶等量混合，稀釋了雞蛋酶解液中的干物質，故雜質減少；當三者體積比為2∶2∶1 時氣味與滋味分值較低，此比例下雖然酸甜不協(xié)調但具有特殊風味，推測是因為雞蛋酶解液與豆?jié){發(fā)酵后形成了特殊風味，但牛奶含量較少，總體系不能滿足發(fā)酵菌所需營養(yǎng)，使得發(fā)酵后所得發(fā)酵乳酸味過大；當三者體積比為2∶1∶2 時，得到感官較好的發(fā)酵乳。

綜合上述情況，第5、6、8 組總分相對較高，但考慮到原料制作成本問題，豆?jié){成本價格相比另外兩種原料價格更低廉，且發(fā)酵乳的組織狀態(tài)可以通過后期調配得到改善，故選取第8 組，即雞蛋酶解液∶豆?jié){∶牛奶體積比為1∶3∶1 進行后續(xù)試驗。

2.1.2 雙蛋白發(fā)酵液的發(fā)酵工藝

按1.3.4 的方法制備發(fā)酵乳，考察蔗糖添加量、發(fā)酵菌接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對感官評分的影響，結果如圖2~圖5 所示。

圖2 蔗糖添加量對感官評分的影響Fig.2 Effect of sucrose supplementation on sensory evaluation

圖3 發(fā)酵菌接種量對感官評分的影響Fig.3 Effect of fermentative bacteria inoculation amount on sensory evaluation

圖4 發(fā)酵溫度對感官評分的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on sensory evaluation

圖5 發(fā)酵時間對感官評分的影響Fig.5 Effect of fermentation time on sensory evaluation

由圖2 可知，隨蔗糖添加量的增加感官評分先上升后下降，當蔗糖添加量在8%（質量分數(shù)）時感官評分最高為80.53。發(fā)酵過程中菌種保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌將碳源適量水解成有機酸，發(fā)酵乳酸甜得當，口感更好[25]。當加入蔗糖過高時，體系產生較高滲透壓，抑制發(fā)酵菌種的生長繁殖，發(fā)酵能力下降，產品滋味和組織形態(tài)變差，使感官評分下降。故選取蔗糖添加量7%、8%、9%（質量分數(shù)）進行后續(xù)試驗。

由圖3 可知，在發(fā)酵菌接種量為10% 時感官評分最高為81.63，隨后迅速下降。發(fā)酵菌接種量較少時，發(fā)酵產酸量較低，影響整體口感層次；而發(fā)酵菌接種量過多，體系酸度過大，造成發(fā)酵乳口感較差的同時產品組織狀態(tài)有分層現(xiàn)象，感官評分較低[26]。故發(fā)酵菌接種量在10% 左右較為適宜。

由圖4 可知，發(fā)酵溫度在43 ℃時感官評分最高為82.86，隨后快速下降，一般發(fā)酵乳的最適溫度為42 ℃左右[25-26]，但Hu 等[27]研究發(fā)現(xiàn)加有大豆蛋白的發(fā)酵乳最佳發(fā)酵溫度高于普通牛奶發(fā)酵乳，雙歧桿菌與嗜熱鏈球菌加入豆?jié){后菌群改變，導致發(fā)酵最適溫度增加。由于雞蛋液在高溫下其表面疏水性和乳化穩(wěn)定性增強[28]，因此發(fā)酵乳感官評分上升。故發(fā)酵溫度為43 ℃時呈現(xiàn)出來產品的口感和氣味更佳。

由圖5 可知，發(fā)酵時間為5 h 時，發(fā)酵乳的感官評分達到最高值為81.33，之后逐漸減小。這是因為發(fā)酵時間較短，雞蛋中仍有少量的具有刺激性氣味的三甲胺；而在長時間發(fā)酵后雞蛋液蛋白質溶解度下降[28]，有少數(shù)顆粒懸浮被視為雜質，感官評分降低。故選取發(fā)酵時間4~6 h 較為適宜。

2.1.3 發(fā)酵正交試驗

研究發(fā)現(xiàn)雙蛋白乳制品發(fā)酵溫度一般高于42 ℃[27]，在溫度更高的條件下雞蛋液發(fā)酵后的乳化穩(wěn)定性增強而感官評價更好[28]，同時考慮到所選菌種中嗜熱鏈球菌占比較大，故固定發(fā)酵溫度為43 ℃，其他3 個因素進行正交試驗，結果見表4、表5。

表4 發(fā)酵正交試驗設計的結果分析Table 4 Fermentation results of the orthogonal design

表5 正交試驗方差分析Table 5 Analysis of variance of orthogonal test

由表4 和表5 可知，發(fā)酵時間對感官評分影響最大，影響因素主次為C>A>B，即發(fā)酵時間>蔗糖添加量>發(fā)酵菌接種量，發(fā)酵時間影響顯著，蔗糖添加量和接種量影響不顯著。最優(yōu)發(fā)酵組合為A1B1C2，即蔗糖添加量為7%（質量分數(shù)）、發(fā)酵菌接種量為10%、發(fā)酵時間為5 h。此工藝條件下制備的發(fā)酵乳色澤均勻，具有雙蛋白發(fā)酵乳特有的滋味與氣味，酸甜度適中，組織均勻細膩，純凈一致，感官評分為90.54，持水率為43.22%，酸度為83.00 °T，感官評分優(yōu)于正交試驗第5 組。根據(jù)正交試驗結果，以k 值最優(yōu)條件重復3 次驗證試驗，得到感官評分為90.68±0.11，持水率為（43.52±0.43）%，酸度為（83.50±0.50）°T。

2.2 雙蛋白發(fā)酵乳的調配

按照1.3.5 的方法確定添加劑的用量，試驗結果見表6。

表6 調配試驗結果與分析Table 6 Blending test results

由表6 可知，添加量為D-異抗壞血酸鈉0.10%、β-環(huán)糊精0.20%、羧甲基纖維素鈉0.10%、卡拉膠0.10%時持水率最優(yōu)；添加量為D-異抗壞血酸鈉0.10%、β-環(huán)糊精0.20%、羧甲基纖維素鈉0.15%、卡拉膠0.10% 時感官評分最優(yōu)；添加量為D-異抗壞血酸鈉0.10%、β-環(huán)糊精0.15%、羧甲基纖維素鈉0.20%、卡拉膠0.10% 時酸度最優(yōu)。以感官評分為最終指標，最優(yōu)添加組合為D-異抗壞血酸鈉0.10%、β - 環(huán)糊精0.20%、羧甲基纖維素鈉0.15%、卡拉膠0.10%，此時產品酸甜適中，口感優(yōu)良。最優(yōu)條件重復3 次做驗證試驗，感官評分為95.42±0.45，持水率為（57.45±0.06）%，酸度為（83.67±0.57）°T。

2.3 產品品質分析

按最優(yōu)條件制得最終成品，并對其進行品質分析，結果見表7。

表7 產品品質分析Table 7 Product quality

由表7 可知，加入添加劑后產品感官評分為95.42±0.45，持水率為（57.45±0.06）%，酸度為（83.67±0.57）°T，脂肪含量為（2.66±0.04）g/100 g，非脂乳固體含量為（9.22±0.06）g/100 g，蛋白質含量為（2.60±0.01）g/100 g，多肽含量為（0.45±0.01）mg/g，符合GB 19302—2010《食品安全國家標準發(fā)酵乳》[29]中對風味發(fā)酵乳的規(guī)定（脂肪含量≥2.5 g/100 g，蛋白質含量≥2.3 g/100 g，酸度≥70.0 °T）。成品色澤均勻一致，乳黃色，奶味濃郁，酸甜度適中，組織均勻細膩，無乳清析出，無明顯異物。

3 結論

采用單因素試驗和正交試驗研制雙蛋白發(fā)酵乳。結果表明：雞蛋酶解液、豆?jié){、牛奶體積比為1∶3∶1 時效果較好；蔗糖添加量為7%（質量分數(shù)）、發(fā)酵菌接種量為10%、發(fā)酵溫度為43 ℃、發(fā)酵時間5 h 時制備發(fā)酵乳感官評分最佳，為90.68±0.11，持水率為（43.52±0.43）%，酸度為（83.50±0.50）°T，發(fā)酵時間對感官評分影響最大。向雙蛋白發(fā)酵乳中添加D-異抗壞血酸鈉0.10%、β-環(huán)糊精0.20%、羧甲基纖維素鈉0.15%、卡拉膠0.10% 時制得成品，其感官評分最佳為95.42±0.45。

本試驗研制雙蛋白發(fā)酵乳成品色澤均一，顏色為乳黃色，酸度適中，組織均勻細膩，具有發(fā)酵乳特有的滋味、氣味。產品經過品質分析，其酸度、脂肪含量及蛋白質含量符合GB 19302—2010《食品安全國家標準發(fā)酵乳》中對風味發(fā)酵乳的規(guī)定，是一款新型全蛋雙蛋白營養(yǎng)健康食品。