謝艾迪，趙怡，唐遠萍，高娟娟，黃蓉，韓海霞 ，謝丹露

（1.新疆農業(yè)大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆果品采后科學與技術重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052）

若羌灰棗又稱若羌香棗、樓蘭棗，是紅棗（Ziziphus jujubaMill.）的一種，為鼠李科棗屬植物果實[1]，其果實呈長倒卵形，核小，且果肉厚，相較于其他品種的紅棗，味更甜?；覘椇刑恰⒗w維素、人體必需氨基酸及鈣、磷、鐵等多種微量元素[2]，被人們美贊為“礦物質元素庫”和“維生素丸”，同時具有多酚、三萜酸、黃酮和環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）等多種生理活性物質[3]，具有良好的抗氧化、抗炎、降血糖、增強免疫力等作用[4]。

新疆是我國紅棗主要產區(qū)之一，主要種植灰棗、駿棗及哈密大棗等品種[5]。劉杰超等[6]通過對不同品種新疆紅棗的營養(yǎng)成分進行分析，發(fā)現灰棗的總酚、總黃酮、總糖及還原糖含量較高。同一品種的紅棗可能會由于土壤、氣候及種植條件等各種因素的影響，使其大小、顏色、糖度等品質產生一定的差異，如今紅棗大多都經過干制加工和分級后進入市場。分級是紅棗加工的重要環(huán)節(jié)，若紅棗不經過分級處理便直接上市流通，其商品價值會明顯降低[7]。

目前，國內外對紅棗的加工技術進行了大量的研究，干制棗更易于保存[8]。為提高紅棗的甜度和口感，人們日常食用紅棗時，會將其蒸制后食用[9]。郭盛等[10]探討發(fā)現蒸制后的大棗中葡萄糖和果糖及核苷類成分含量增加，三萜類化合物含量顯著增加。將紅棗經三蒸三晾后食用，不僅可促進糖類、維生素等營養(yǎng)物質的吸收，還能改善食欲不振、氣血不足、脾胃虛弱等癥狀。范愛國等[11]研究紅棗三蒸三晾加工工藝，經過三蒸三晾處理的紅棗營養(yǎng)美味，藥用價值更高。劉世軍等[12]發(fā)現經過三蒸三晾的紅棗會使紅棗中的環(huán)磷酸腺苷含量增加，因環(huán)磷酸腺苷具有良好的鎮(zhèn)靜、催眠和降壓的作用，三蒸三晾后的紅棗其改善睡眠的效果可能也會增強。因此，本試驗以特級、一級、二級若羌灰棗為研究對象，將其分別經三蒸三晾處理，測定并比較三蒸三晾處理前后總黃酮、總多酚、總三萜、總糖和還原糖含量的變化及抗氧化活性，為不同等級灰棗的加工方式及消費者科學合理的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰棗（特級、一級、二級）：新疆烏魯木齊新北園春干果市場，產地為巴音郭楞蒙古自治州若羌縣，由新疆農業(yè)大學食品科學與藥學學院韓海霞副教授鑒定；1，1二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl free radical，DPPH）（純度>97%）、2，2'-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]（純度>98%）、蘆丁標準品（純度>98.65%）、沒食子酸標準品（純度>99%）、福林酚（純度>99%）：上海麥克林生化科技股份有限公司；無水乙醇（分析純，純度≥99.7%）：天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

電子分析天平（AL204-IC 型）：梅特勒-托利多儀器有限公司；數控超聲波清洗儀（KQ-250DE 型）：昆山市超聲儀器有限公司；紫外可見分光光度計（T6 新世紀型）：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 不同等級灰棗樣品前處理

干制：取同一批次特級、一級、二級灰棗洗凈，去核，切片，干燥。

三蒸三晾：取同一批次特級、一級、二級灰棗洗凈，去核，切片。第一次蒸晾，將果肉放于鍋內100 ℃隔水蒸制30 min，取出于室溫放置2~3 h，重復兩次，干燥。

1.3.2 不同等級灰棗提取液制備

分別取三蒸三晾前后的特級、一級、二級灰棗各20.00 g，加適量蒸餾水，于研缽中研磨成泥狀，將棗泥收集，冷藏備用。

1.3.2.1 水提取液

取三蒸三晾前后的特級、一級、二級灰棗棗泥各3.00 g 與3 mol/L 鹽酸溶液按1∶40（g/mL）混合，80 ℃水浴加熱1 h 后，冷卻，3 000 r/min 離心10 min，收集上清液，用以測定總糖含量，4 ℃冷藏備用。

取三蒸三晾前后的特級、一級、二級灰棗棗泥3.00 g 與蒸餾水按1∶40（g/mL）比例混合，80 ℃水浴1 h，冷卻，3 000 r/min 離心10 min，收集上清液，用以測定可溶性糖含量，4 ℃冷藏備用。

1.3.2.2 乙醇提取液

取三蒸三晾前后的特級、一級、二級灰棗棗泥3.00 g 與加入75%（體積比）乙醇按1∶40（g/mL）比例混合于錐形瓶中，稱重記錄W1，浸泡1 h，60 ℃下超聲輔助提取40 min，擦干瓶底水分，再稱重，加75%（體積比）乙醇補齊至W1，過濾，濾液4 000 r/min 離心10 min，收集上清液，用以測定總黃酮、總多酚和總三萜含量及抗氧化活性，4 ℃冷藏備用。

1.3.3 不同等級灰棗總黃酮含量測定

1.3.3.1 蘆丁對照品工作曲線

蘆丁對照品工作曲線參照文獻[13]的方法制作。

1.3.3.2 供試品中總黃酮含量測定

準確移取2.00 mL 供試品溶液，平行3 份，同1.3.3.1 方法顯色，于510 nm 處測得吸光度，帶入回歸方程，并計算含量。總黃酮含量按公式（1）計算。

式中：ω1為總黃酮含量，mg/g；C1為樣品中總黃酮的濃度，μg/mL；M為樣品質量，g；V為提取液體積，mL；D1為稀釋倍數。

1.3.4 不同等級灰棗總多酚含量測定

1.3.4.1 沒食子酸對照品工作曲線

沒食子酸對照品工作曲線參照文獻[13]的方法制作。

1.3.4.2 供試品中總多酚含量測定

準確移取2.00 mL 供試品溶液，平行3 份，同1.3.4.1 方法顯色，于765 nm 處測得吸光度，帶入回歸方程，并計算含量。總多酚含量按公式（2）計算。

式中：ω2為總多酚含量，mg/g；C2為樣品中總多酚的濃度，μg/mL；M為樣品質量，g；V為提取液體積，mL；D2為稀釋倍數。

1.3.5 不同等級灰棗總三萜含量測定

1.3.5.1 齊墩果酸對照品工作曲線

齊墩果酸對照品工作曲線參照文獻[9]的方法制作。

1.3.5.2 供試品中總三萜含量測定

準確移取2.00 mL 供試品溶液，平行3 份，同1.3.5.1 方法顯色，于560 nm 處測得吸光度，帶入回歸方程，并計算含量。總三萜含量按公式（3）計算。

式中：ω3為總三萜含量，mg/g；C3為樣品中總三萜的濃度，μg/mL；M為樣品質量，g；V為提取液體積，mL；D3為稀釋倍數。

1.3.6 不同等級灰棗總糖及還原糖含量測定

1.3.6.1 葡萄糖對照品工作曲線

葡萄糖對照品工作曲線參照文獻[14]的方法制作。

1.3.6.2 供試品中總糖及還原糖含量測定

準確移取2.00 mL 供試品溶液，平行3 份，同1.3.6.1 方法顯色，于620 nm 處測得吸光度，帶入回歸方程，并計算含量。總糖、可溶性糖含量按公式（4）、（5）計算，還原糖含量為總糖和可溶性糖含量的差值。

式中：ω4為總糖含量，mg/g；C4為樣品中總糖的濃度，μg/mL；M為樣品質量，g；V為提取液體積，mL；D4為稀釋倍數。

式中：ω5為可溶性糖含量，mg/g；C5為樣品中可溶性糖的濃度，μg/mL；M為樣品質量，g；V為提取液體積，mL；D5為稀釋倍數。

1.3.7 不同等級灰棗抗氧化活性的測定

1.3.7.1 DPPH 自由基清除能力的測定

將三蒸三晾前后的特級、一級、二級灰棗供試品溶液制成質量濃度為5、10、15、20、25、30 mg/mL 的待測樣品溶液，以VC為陽性對照，參照文獻[15]的方法于517 nm 處測定吸光度，按公式（6）計算DPPH 自由基清除率。

式中：W1為DPPH 自由基清除率，%；A1為2.00 mL待測液+2.00 mL DPPH 乙醇溶液的吸光度；A2為2.00 mL待測液+2.00 mL 無水乙醇的吸光度；A0為2.00 mL DPPH+2.00 mL75% 乙醇溶液的吸光度。

1.3.7.2 ABTS+自由基清除能力測定

將三蒸三晾前后的特級、一級、二級灰棗供試品溶液制成質量濃度5、10、15、20、25、30 mg/mL 的待測樣品溶液，以VC為陽性對照，參照文獻[15]的方法于734 nm處測定吸光度，按公式（7）計算ABTS+自由基清率。

式中：W2為ABTS+自由基清除率，%；A1為0.80 mL 樣品液+3.20 mL ABTS 溶液混合液的吸光度；A2為0.80 mL樣品液+3.20 mL 蒸餾水的吸光度；A0為0.80 mL 蒸餾水+3.20 mL ABTS 溶液混合液的吸光度。

1.3.7.3 總還原能力的測定

將三蒸三晾前后的特級、一級、二級灰棗供試品溶液制成質量濃度為5、10、15、20、25、30 mg/mL 的待測樣品溶液，以VC作為陽性對照，參照文獻[16]的方法于700 nm 處測定吸光度。

1.4 數據處理

運用SPSS 19.0 對試驗數據進行單因素方差分析（One-way analysis of variance，One-way ANOVA），圖表采用GraphPad Prism5.0 繪制，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與討論

2.1 總黃酮含量的測定

圖1 為不同等級灰棗經三蒸三晾處理前后總黃酮含量測定結果。

圖1 總黃酮含量比較Fig.1 Comparison of total flavonoid content

由圖1 可知，三蒸三晾處理前，特級、一級、二級灰棗總黃酮含量分別為（2.48±0.60）、（2.33±0.16）、（2.95±0.08）mg/g，經三蒸三晾后總黃酮含量分別為（2.69±0.09）、（3.09±0.09）、（3.72±0.12）mg/g，表明特級、一級、二級灰棗三蒸三晾后總黃酮含量均升高，分別增加了8.47%、32.62%、26.10%，尤其一級、二級灰棗總黃酮顯著升高（P<0.05）。本試驗中特級、一級、二級灰棗經三蒸三晾處理后總黃酮含量增加，可能是因為高溫破壞細胞壁，使總黃酮更多地溶解出來，從而使測得的總黃酮含量增加；馬敏敏等[17]試驗結果表明，蒸制后的三七總黃酮含量高于生三七，其總黃酮含量會隨著蒸制時間的延長先升高后降低，在蒸制90 min 后達到最高值，與本試驗結果一致。然而當某些黃酮隨蒸汽冷凝時溶解出來，或者高溫使黃酮結構降解，也會造成總黃酮量的損失[18]。

2.2 總多酚含量的測定

圖2 為不同等級灰棗經三蒸三晾處理后總多酚含量測定結果。

圖2 總多酚含量比較Fig.2 Comparison of total polyphenol content

由圖2 可知，三蒸三晾處理前，特級、一級、二級灰棗總多酚含量分別為（23.10±0.29）、（23.51±2.40）、（25.64±0.97）mg/g，經三蒸三晾后總多酚含量分別（19.03±2.64）、（21.87±2.65）、（22.22±1.79）mg/g，表明特級、一級、二級灰棗三蒸三晾后總多酚含量均降低，分別降低了19.62%、7.0%、13.34%。本試驗中特級、一級、二級灰棗經三蒸三晾處理后總多酚含量有不同程度的下降，分析其原因可能是多酚結構中酚羥基在蒸制高溫下不穩(wěn)定所致，馬占倩[19]試驗結果表明，稻花香和燦米經過蒸制后其所含的游離酚、結合酚及總酚均會顯著降低，與本試驗結果一致。張玲艷等[20]研究得出蒸、煮兩種加工方式會顯著影響小米中的總酚含量，而由于水分活度及溶氧濃度因素影響，煮小米的總酚含量降低幅度比蒸小米低，因此后期試驗也可考慮使用煮制方式以更好地保留總多酚含量。

2.3 總三萜含量的測定

圖3 為不同等級灰棗經三蒸三晾處理后總三萜含量測定結果。

圖3 總三萜含量比較Fig.3 Comparison of total triterpenoid content

由圖3 可知，三蒸三晾處理前，特級、一級、二級灰棗總三萜含量分別為（35.83±1.41）、（37.07±1.35）、（38.73±1.61）mg/g，經三蒸三晾后總三萜含量分別為（40.01±2.30）、（42.54±1.82）、（43.57±2.27）mg/g，表明特級、一級、二級灰棗三蒸三晾后總三萜含量均升高，分別增加了11.67%、14.76%、12.50%，尤其一級灰棗總三萜顯著升高（P<0.05）。付亞玲[21]通過研究紅棗在黑化的0~180 h 中，其三萜酸含量隨著黑化時間的延長而增加，在72 h 時含量達到最高值。邱小燕等[22]發(fā)現總三萜含量隨茯苓蒸制時間的延長呈先增加后減少的趨勢，在180 min 時達到最高值。張娜等[9]研究發(fā)現紅棗經蒸制一段時間后總三萜含量上升，這可能是因為不同植物中所含三萜酸的前體物質的量不一樣，在高溫加工過程中前體物質轉化得到的三萜酸量也不一樣，但是可能因為高溫蒸制時間過久又使三萜酸繼續(xù)降解，繼而導致三萜酸含量降低。蔡天嬌[23]研究發(fā)現當提取溫度從30 ℃升至40 ℃時，紅棗三萜酸含量最高，當溫度繼續(xù)上升時，紅棗三萜酸含量持續(xù)下降。本試驗中將特級、一級、二級灰棗經三蒸三晾方法處理后總三萜含量增加，表明三蒸三晾既增加了紅棗三萜酸的含量，又使其在合理的蒸制時間里得到有效保護。

2.4 總糖及還原糖含量的測定

圖4 及圖5 為不同等級灰棗經三蒸三晾處理后總糖和還原糖含量測定結果。

圖4 總糖含量比較Fig.4 Comparison of total sugar content

圖5 還原糖含量比較Fig.5 Comparison of reducing sugar content

由圖4 可知，三蒸三晾處理前，特級、一級、二級灰棗總糖含量分別為（475.46±18.76）、（462.29±26.38）、（419.82±11.44）mg/g，經三蒸三晾后總糖含量分別為（403.85±26.17）、（337.84±17.75）、（333.72±67.65）mg/g，表明特級、一級、二級灰棗三蒸三晾后總糖含量均降低，分別降低了15.06%、26.92%、20.51%，尤其一級灰棗總糖含量顯著降低。由圖5 可知，三蒸三晾處理前，特級、一級二級灰棗還原糖含量分別為（158.68±32.75）、（58.93±11.41）、（48.72±8.12）mg/g，經三蒸三晾后還原糖含量分別（188.15±14.32）、（108.64±19.57）、（53.83±5.43）mg/g，表明特級、一級、二級灰棗經三蒸三晾后還原糖含量均升高，分別增加了18.57%、84.35%、10.48%，尤其一級灰棗還原糖含量極顯著升高（P<0.01）。Sun 等[24]通過控制溫度和濕度將紅棗高溫熟化后，與原紅棗相比，其還原糖含量升高了29.79%。

研究發(fā)現中藥材經蒸制處理以后，其中總糖含量有減有增，但多數情況下會隨著蒸制時間、溫度和次數驟減，這可能是因為高溫條件使得多糖降解為小分子單糖、寡糖或者非糖類物質5-羥甲基糠醛，從而使其含量降低[25-26]。有研究表明，黃精多糖會隨蒸制次數和時間的延長而降低[27]。

2.5 不同等級灰棗抗氧化活性比較

2.5.1 對DPPH 自由基的清除能力

DPPH 自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，其結構中心有一個含孤對電子的氮原子，當這個單電子中心被樣品中孤對電子所配對時，使溶液紫色變淺，樣品物質的抗氧化能力越高其顏色褪色越明顯[28]。三蒸三晾處理前后不同等級的灰棗對DPPH 自由基清除能力的影響如圖6 所示。

圖6 三蒸三晾處理前后不同等級的灰棗對DPPH 自由基的清除能力Fig.6 Scavenging ability of different grades of Ruoqiang grey jujube on DPPH free radicals before and after three times of steaming and cooling

由圖6 可知，特級、一級、二級灰棗經三蒸三晾處理以后，對DPPH 自由基的清除能力在質量濃度為5~30 mg/mL 時均隨濃度的增加而增加，尤其質量濃度范圍為5~15 mg/mL 時，一級、二級灰棗對DPPH 自由基的清除速率呈線性增加；三者在30 mg/mL 時清除率達到最大，分別為87.08%、94.86%、95.47%，而三蒸三晾處理前，其最大清除率分別為84.05%、79.96%、93.57%，由此可見，三蒸三晾處理前后對一級灰棗的DPPH 自由基最大清除率有明顯影響。然而特級、一級、二級灰棗在質量濃度范圍為5~30 mg/mL 時對DPPH 自由基清除能力IC50分別為12.63、14.48、5.15 mg/mL，經三蒸三晾處理后的IC50分別為9.84、4.17、3.86 mg/mL，可見三蒸三晾處理后特級、一級、二級灰棗對DPPH 自由基清除能力均增強，尤其是一級灰棗的清除能力增強最強，其次是特級和二級灰棗。研究表明很多天然成分具有清除DPPH 自由基的能力，其含量的多少也會影響DPPH 自由基清除能力[29]，本試驗中測得灰棗經三蒸三晾處理后，二級灰棗中總黃酮及一級灰棗總三萜含量顯著增加，余佳浩等[30]試驗結果表明，山藥蒸制15 min 后其總黃酮含量增加，DPPH 自由基清除能力也增加，而且鑒于有研究表明總三萜具有較強的抗氧化活性[31]，推測灰棗中與清除DPPH 自由基能力相關的成分可能是總黃酮和總三萜，但其原因有待進一步研究。

2.5.2 對ABTS+自由基的清除能力

ABTS+自由基由于氧化劑存在，被氧化會生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基，而受抗氧化劑的影響，ABTS+自由基工作液會使樣品溶液褪色，其原理可以比較清除ABTS+自由基的能力強弱[28]。三蒸三晾處理前后不同等級的灰棗對ABTS+自由基的清除能力如圖7 所示。

圖7 三蒸三晾處理前后不同等級的灰棗對ABTS+自由基的清除能力Fig.7 Scavenging ability of different grades of Ruoqiang grey jujube on ABTS+ free radicals before and after three times of steaming and cooling

由圖7 可知，特級、一級、二級灰棗經三蒸三晾處理以后，對ABTS+自由基的清除能力在質量濃度為5~30 mg/mL 時均隨濃度的增加而增加，尤其在5~20 mg/mL時，三者對ABTS+自由基的清除速率呈線性增加；在濃度范圍為20~30 mg/mL 時，清除率基本趨于穩(wěn)定，在30 mg/mL 時清除率達到最大，分別為96.84%、98.06%、98.92%，而三蒸三晾處理前，特級、一級、二級灰棗對ABTS+自由基清除率分別為93.03%、92.89%、96.04%，由此可見，三蒸三晾處理前后不同等級灰棗對ABTS+自由基最大清除率沒有影響，然而特級、一級、二級灰棗在濃度范圍為5~30 mg/mL 時對ABTS+自由基清除能力IC50分別為9.26、10.59、6.06 mg/mL，經三蒸三晾處理后的IC50值分別為9.01、6.54、6.88 mg/mL，經比較可知一級灰棗經三蒸三晾處理后對ABTS+自由基清除能力增強最多，特級和二級灰棗不顯著，而在本試驗中測得當灰棗經三蒸三晾處理后，一級灰棗總三萜含量明顯增加，鑒于有研究表明總三萜具有較強的抗氧化活性[31]，推測灰棗中與清除ABTS+自由基能力相關的成分可能是總三萜，但其原因有待進一步研究。

2.5.3 總還原能力

三蒸三晾處理前后不同等級的灰棗總還原能力如圖8 所示。

圖8 總還原能力Fig.8 Total reducing power

由圖8 可知，特級、一級、二級灰棗經三蒸三晾處理以后，總還原能力在質量濃度為5~30 mg/mL 時均隨濃度的增加而增加，尤其一級、二級灰棗總還原能力比處理前強。宋亞茹[32]通過研究發(fā)現黑化后的紅棗其總還原能力比原紅棗的高出3.58 倍。天然產物總還原能力與總黃酮、總多酚和總三萜呈正相關[29，33]，本試驗中不同等級灰棗經三蒸三晾處理以后，一級灰棗中總三萜含量和二級灰棗中總黃酮含量明顯增多，推測其中總三萜、總黃酮對其總還原能力具有較大貢獻，其原因有待進一步研究。

2.6 相關性分析

不同等級灰棗中總黃酮、總多酚、總三萜、總糖及還原糖含量與抗氧化活性相關性分析如表1 所示。

表1 不同等級灰棗中總黃酮、總多酚、總三萜、總糖及還原糖含量與抗氧化活性相關性分析Table 1 Correlations of antioxidant activity and content of total flavonoids，total polyphenols，total triterpenoids，total sugars，and reducing sugars in different grades of grey Jujube

由表1 可知，不同等級灰棗對DPPH 自由基清除能力的強弱與總黃酮含量和總三萜含量相關性極顯著（P<0.01），與總多酚含量相關性較?。粚BTS+自由基清除能力的強弱與總黃酮含量和總三萜含量相關性極顯著（P<0.01）。不同等級灰棗中總糖含量與各抗氧化活性之間均呈負相關，且相關性極顯著（P<0.01）；還原糖含量與總還原能力之間呈負相關，相關性顯著（P<0.05）。這表明總黃酮及總三萜在不同等級灰棗的抗氧化能力發(fā)揮這重要的作用。本試驗與劉野婷等[34]研究結果一致。

3 結論

特級、一級、二級灰棗經三蒸三晾處理后，其總黃酮、總三萜和還原糖含量均增加，總多酚、總糖含量下降，特級、一級、二級灰棗對DPPH 自由基清除能力均增強，尤其是一級灰棗的清除能力明顯增強，一級灰棗對ABTS+自由基清除能力最強，一級、二級灰棗的總還原能力較強。由此可見，不同等級灰棗經三蒸三晾處理后其主要功能成分和抗氧化活性受到不同影響。