唐宏偉，劉銘洋，史曉丹，李柏良

（東北農(nóng)業(yè)大學 乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150000）

益生菌作為一種活的微生物具有諸多益生特性，當宿主攝入足夠數(shù)量的益生菌時，益生菌能夠產(chǎn)生諸多正向的益處[1]。乳酸菌（lactobacillus，LAB）是可發(fā)酵碳水化合物中產(chǎn)生大量乳酸的一種細菌的統(tǒng)稱，在自然界中極為普遍。乳酸菌是一種安全的革蘭氏陽性微生物，廣泛應用于各類發(fā)酵食品中[2]。除此以外，乳酸菌也是人體腸道菌群的重要組成部分，具有多種生理功能，包括免疫細胞平衡、代謝產(chǎn)物調節(jié)和腸道菌群；乳桿菌屬作為乳酸菌的一大類，大多數(shù)菌株都具有益生作用[3-4]，其中最具有代表性的乳桿菌為植物乳植桿菌（Lactobacillusplantarum）。

植物乳植桿菌作為優(yōu)勢乳酸菌之一，具有提高機體抗氧化活性、抑制有害菌群生長等多種優(yōu)良特性，植物乳植桿菌在自然界中分布廣泛，常存在于動物腸道內調節(jié)微生態(tài)平衡，具有增強非特異性免疫功能、預防腸道疾病的作用，同時還可以提供營養(yǎng)因子、促進營養(yǎng)物在腸道內的消化吸收、促進動物的生長發(fā)育和提高飼料轉化率。植物乳植桿菌CCFM8661 具有緩解腸細胞鉛中毒、有助于排出農(nóng)藥殘留等功效[5-6]，在前期的動物實驗和臨床實驗中已經(jīng)被證實具有良好的益生作用，例如調節(jié)腸道微生物群、抗氧化特性、緩解重金屬毒性、清除幽門螺旋桿菌等[4，7]。

本實驗以新型益生菌菌株植物乳植桿菌CCFM8661為研究對象，研究其對機體的腸道調節(jié)作用以及可能的機制，實驗過程全程記錄并監(jiān)測小鼠的體質量變化，通過組織病理學分析實驗、腸道通透性實驗及腸道菌群增殖實驗對植物乳植桿菌CCFM8661 菌株的腸道健康調節(jié)效果進行探究，以期為后續(xù)的深入研究與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

選取48 只BALB/c 小鼠（體質量均為22 g 左右）飼養(yǎng)于動物房中，溫度設置為22 ℃，濕度10%~60%，12 h 明暗交替照明，由小鼠標準飼料喂養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)1 周，自由飲水。喂養(yǎng)1 周后，將小鼠隨機分成4 組，每組12 只，進入正式實驗。

植物乳植桿菌CCFM8661 菌粉：微康益生菌（蘇州）股份有限公司；DEPC 水（diethyl pyrocarbonate 水）、蘇木素伊紅染液：生工生物工程（上海）股份有限公司；伊紅美藍瓊脂、雙歧桿菌（bifidobacterium，BBL）瓊脂、乳酸桿菌選擇性（lactobacillus selective，LBS）瓊脂、產(chǎn)氣莢膜梭菌（tryptose sulfite cycloserine，TSC）瓊脂：青島海博生物技術有限公司；D-乳酸檢測試劑盒：美國MP 公司；反轉錄試劑盒、實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測試劑盒：南京諾唯贊生物科技股份有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒：南京碧云天生物技術有限公司；乙酸標準品、丙酸標準品、丁酸標準品（均≥99%）：美國Sigma-Aldrich公司；乙酸乙酯（≥99.5%）：美國merck 公司；巴豆酸偏磷酸：美國Aladdin 公司。

1.1.2 儀器與設備

MLS-3751L-PC 高壓蒸汽滅菌器、MDF-382E-80 ℃冰箱：日本Panasonic 公司；Cubis?II 實驗室天平：德國Sartorius 公司；SORVALL ST8/8R 低溫離心機：美國TOMOS 公司；Orbitrap?Exactive?氣相色譜質譜聯(lián)用儀：賽默飛世爾科技公司；SMATBCD Synergy MX 全自動酶標儀：美國Bio Tek 公司；Tnano-800 核酸蛋白分析儀：上海測博生物科技發(fā)展中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥

小鼠被隨機分為4 組：陰性對照（normal control，NC）組、植物乳植桿菌CCFM8661 低劑量組（LP，1.6×106CFU/只）、植物乳植桿菌CCFM8661 中劑量組（MP，1.6×107CFU/只）、植物乳植桿菌CCFM8661 高劑量組（HP，1.6×108CFU/只）。其中陰性對照組小鼠灌胃等體積的生理鹽水，受試樣品給予時間為14 d。對于植物乳植桿菌CCFM8661 實驗處理組，灌胃藥品需要提前配制，分別取一定量的菌粉按照一定濃度溶解在生理鹽水中。分組及給藥見表1。

表1 動物分組及給藥Table 1 Animal grouping and administration

1.2.2 靶標菌培養(yǎng)

收集各組小鼠給藥前新鮮糞便于滅菌的塑料離心管中，稱取并記錄糞便質量，加生理鹽水稀釋，糞便與生理鹽水配比為0.05 g/mL。稀釋后將1.5 mL 離心管管封口，渦旋混勻7 min。將糞便混懸液按照10 倍梯度稀釋10~104倍，接種于培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)，培養(yǎng)基種類及其培養(yǎng)條件見表2。

表2 細菌培養(yǎng)基種類及其培養(yǎng)條件Table 2 Types of bacterial medium and their culture conditions

1.2.3 樣品收集

實驗結束后使用電子天平記錄各組小鼠體質量，將小鼠進行脫頸處理并于眼球處取血，收集血清。收集小鼠小腸組織存放于4% 多聚甲醛溶液中固定，等待染色；收集小鼠結腸組織并液氮速凍，用于基因表達量檢測；收集小鼠盲腸內容物用于短鏈脂肪酸含量的檢測；收集小鼠血清用于評估腸道通透性。

1.3 指標的測定

1.3.1 小鼠體質量測定

測量并記錄動物初始體質量以及實驗結束時的空腹體質量。

1.3.2 腸道靶標菌菌落計數(shù)

按照1.2.2 培養(yǎng)后，以菌落形態(tài)、革蘭氏染色鏡檢、生化反應等生理生化指標鑒定計數(shù)菌落，計算出每克濕便中的菌落數(shù)，取對數(shù)后進行統(tǒng)計處理。最后一次給予受試樣品后24 h，與實驗前同樣方式取直腸糞便，以同樣的方法檢測腸道菌群。觀察雙歧桿菌、乳桿菌、腸球菌、腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌含量的變化。

1.3.3 組織病理學觀察

將結腸組織固定在10% 福爾馬林鹽水中24 h，然后包埋在石蠟中。切片（厚5 μm）后用蘇木素伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察腸道病理結構。

1.3.4 腸道屏障mRNA 表達的測定

取小鼠結腸組織，從腸道樣品中提取RNA，利用核酸蛋白分析儀測定腸道屏障mRNA 的表達。樣品中加入氯仿后培養(yǎng)5 min，4 ℃下8 000 r/min 離心20 min取沉淀。以無酶水為對照測定總RNA 濃度，樣品的吸光值A260/A280控制在1.9~2.1 之間。以2 μg cDNA 為模板，按照qRT-PCR 檢測試劑盒配制反應液，用實時熒光定量PCR 系統(tǒng)（ABI 7500）進行兩步法PCR 擴增。根據(jù)目的基因的Ct 值和內參基因β-actin的Ct 值，按照2-ΔΔCt法計算樣本中目的基因mRNA 的相對表達水平，通過檢測腸道黏蛋白（MUC1 和MUC2）和緊密連接蛋白（ZO - 1、Occludin 和Claudin - 1）相關基因的mRNA 表達水平來評定腸道屏障。實時熒光定量PCR引物見表3。

表3 qRT-PCR 的引物Table 3 Primers of qRT-PCR

1.3.5 腸道通透性的測定

采集的血液在4 ℃、3 500 r/min 下離心10 min，取上清液用于小鼠D-乳酸和LPS 含量的檢測，具體操作參照LPS 和D-乳酸檢測試劑盒的說明書進行操作。

1.3.6 短鏈脂肪酸含量的測定

稱量乙酸、丙酸、丁酸標準品，用乙酸乙酯配制成0.1、0.5、1.5、10.0、20.0、50.0 μg/mL 濃度梯度的標準溶液。

準確稱?。?.80±0.01）g 盲腸內容物，加入乙酸乙酯配制成10% 懸濁液，取500 μL 懸濁液于1.5 mL 離心管中，并加入100 μL 巴豆酸偏磷酸溶液，-30 ℃凍結24 h，解凍后8 500 r/min 離心3 min（4 ℃）去除蛋白質、脂肪等雜質，加入等體積的乙酸乙酯進行提取并振蕩混勻2 min，經(jīng)11 000r/min 離心10 min 后，吸取上層有機相并加入終濃度為500 μmol/L 的4-甲基戊酸作為內標，混勻后移入進樣瓶，用于氣相色譜質譜聯(lián)用（gas chromatography - mass spectrometry，GC - MS）儀檢測。氣相色譜條件：利用HP-FFAP 毛細管柱進行分離，檢測器溫度設定為250 ℃，進樣量為1 μL。升溫程序：起始溫度60 ℃保持3 min，以10 ℃/min 升至200 ℃，再以30 ℃/min 升至225 ℃，保持3 min；載氣為氮氣，載氣流速為1.0 mL/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結果以平均值±標準差表示，用SPSS 軟件進行方差分析、單因素方差分析，P<0.05 即判定為差異顯著。采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，統(tǒng)計多組間比較數(shù)據(jù)并作圖。

2 結果與分析

2.1 植物乳植桿菌CCFM8661 對小鼠體質量的影響

植物乳植桿菌CCFM8661 對小鼠體質量的影響見表4。

表4 植物乳植桿菌CCFM8661 對小鼠體質量的影響Table 4 Effects of Lactobacillus plantarum CCFM8661 on body weight of mice

由表4 可知，在正常菌群狀態(tài)下，與陰性對照組相比，小鼠體質量隨灌胃植物乳植桿菌CCFM8661 劑量的提升呈現(xiàn)顯著增加的趨勢（P<0.05），說明在健康狀態(tài)下，隨著時間的延長及益生菌的攝入，宿主的脾胃功能得到改善，進而出現(xiàn)進食量提高、體質量增加的情況[2]。

2.2 植物乳植桿菌CCFM8661 對小鼠腸道菌群的影響

通過為期14 d 的植物乳植桿菌CCFM8661 干預，小鼠腸道中雙歧桿菌、乳桿菌、腸桿菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌的變化情況如圖1 所示。

由圖1 可知，糞便中雙歧桿菌和乳桿菌的含量在3 種不同劑量的植物乳植桿菌CCFM8661 干預后均顯著增加（P<0.05），而腸桿菌、腸球菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌的含量在干預前后無顯著變化。結合《保健食品功能檢驗與評價方法（2022 版）》中“有助于調節(jié)腸道菌群檢驗方法”中陽性結果判定標準，證明植物乳植桿菌CCFM8661 具有調節(jié)小鼠腸道菌群的作用。劉偉賢等[3]的研究結果顯示，干酪乳桿菌K56 具有調節(jié)腸道菌群的功能，能夠顯著提高小鼠腸道內益生菌含量，并降低條件致病菌含量，與本研究結果一致。綜上，補充適當益生菌，可以通過促進腸道內有益菌（雙歧桿菌和乳桿菌）的增加，抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌的增長，以達到調節(jié)腸道菌群的目的[1]。

2.3 組織病理學分析

對小鼠結腸組織進行HE 染色，并進行組織病理學切片觀察，各組組織學改變見圖2。

圖2 小腸黏膜組織蘇木素伊紅（HE）染色結果Fig.2 Hematoxylin eosin（HE）staining results of small intestinal mucosal tissue

由圖2 可知，NC 組結腸組織形態(tài)結構完整，結腸黏膜上皮完整，無炎癥浸潤。各喂養(yǎng)植物乳植桿菌CCFM8661（低、中、高）組小鼠腸組織HE 染色結果無明顯改變，絨毛排列整齊緊密，粗細均勻，無明顯差異。表明植物乳植桿菌CCFM8661 維持了正常腸道組織結構，并未對小鼠的結腸黏膜組織造成破壞。

2.4 腸道屏障結果分析

植物乳植桿菌CCFM8661 處理對小鼠結腸中ZO-1、Occludin、Claudin-1、MUC1、MUC2 mRNA 表達量的影響如表5 所示。

表5 植物乳植桿菌CCFM8661 處理對小鼠結腸中ZO-1、Occludin、Claudin-1、MUC1、MUC2 mRNA 表達量的影響Table 5 Effect of treatment with Lactobacillus plantarum CCFM8661 on mRNA expression of ZO-1，Occludin，Occludin-1，MUC1，and MUC2 in mouse colon

由表5 可知，與陰性對照組相比，植物乳植桿菌CCFM8661 灌胃組小鼠結腸Occludin、ZO-1、MUC1、MUC2 與Claudin-1 mRNA 的表達量均明顯增加。隨著植物乳植桿菌CCFM8661 灌胃劑量的增加，mRNA的表達量也隨之增加。表明植物乳植桿菌CCFM8661能夠通過上調腸上皮細胞間緊密連接蛋白和腸道黏蛋白相關mRNA 的表達量，達到保護腸道的作用[8]。

2.5 腸道通透性結果分析

在分子水平上，LPS 和D-乳酸是檢測腸屏障損傷的敏感指標[9]，本研究采用ELISA 試劑盒檢測小鼠血清中LPS 和D-乳酸的含量，研究植物乳植桿菌CCFM8661 對小鼠腸道屏障通透性的影響，結果如圖3所示。

圖3 腸道通透性指標LPS 和D-乳酸的測定Fig.3 Determination of intestinal permeability indexes of LPS and D-lactic acid

由圖3 可知，與陰性對照組相比，植物乳植桿菌CCFM8661 各處理組LPS 和D-乳酸的含量均極顯著降低（P<0.01），這表明植物乳植桿菌CCFM8661 會導致腸道屏障通透性的降低[10]。但低、中、高劑量組的LPS 和D-乳酸含量均無明顯差異。以上結果表明，植物乳植桿菌CCFM8661 具有良好的降低腸道通透性的效果。

2.6 植物乳植桿菌CCFM8661 對小鼠結腸內短鏈脂肪酸含量的影響

由于腸道菌群在調節(jié)代謝、機體免疫反應及維持腸道屏障等方面的作用，服用益生菌調節(jié)腸道菌群目前被認為是炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）治療及延緩惡化方面的新方法。短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）除具有調節(jié)機體電解質平衡[11]、刺激胃腸激素分泌、調節(jié)腸道動力等功能外，還可以參與宿主免疫反應過程。SCFAs 是腸道中最豐富的菌群代謝物，具有1~6 個碳原子的脂肪族尾部的羧酸，包括甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸和己酸，其中乙酸、丙酸和丁酸最豐富[12]。因此，本研究測定乙酸、丙酸和丁酸含量，探究植物乳植桿菌CCFM8661 對小鼠結腸內短鏈脂肪酸含量的影響，結果如圖4 所示。

圖4 植物乳植桿菌CCFM8661 對小鼠結腸內短鏈脂肪酸含量的影響Fig.4 Effect of Lactobacillus plantarum CCFM8661 on content of short-chain fatty acids in mouse colon

由圖4 可知，與陰性對照組相比，植物乳植桿菌CCFM8661 的干預可以明顯增加乙酸、丙酸和丁酸的含量。結果表明，植物乳植桿菌CCFM8661 能夠調控腸道菌群代謝物，這與其對腸道菌群的調控密不可分。

3 討論與結論

本研究欲證實植物乳植桿菌CCFM8661 是否具有調節(jié)腸道菌群、改善腸道環(huán)境的功效，使用BALB/c 小鼠來評價植物乳植桿菌CCFM8661 對腸道菌群和腸屏障的影響。大量研究表明，植物乳植桿菌能夠通過調節(jié)腸道菌群來緩解便秘[13-14]，人體腸道菌群中雙歧桿菌、乳桿菌是有益菌的代表，通過降低腸道內環(huán)境的pH 值、抑制有害菌增殖而發(fā)揮作用[15]。產(chǎn)氣莢膜梭菌是致病菌，能分解肌肉和結締組織中的糖，產(chǎn)生大量氣體，導致組織嚴重氣腫，進而影響血液供應，引起氣性壞疽[16]。腸桿菌在相當長的一段時間內被認為是非致病菌，直到20 世紀中葉，研究人員才發(fā)現(xiàn)一些特殊的腸桿菌對人和動物有致病性，會引起嚴重腹瀉和敗血癥[17]。因此欲調節(jié)腸道菌群并避免其失衡，本實驗選用這5 種代表菌作為評價腸道菌群變化的指標。

結果顯示，植物乳植桿菌CCFM8661 的攝入能顯著改變宿主的腸道菌群，主要是能顯著提高宿主腸道內雙歧桿菌和乳桿菌的含量（P<0.01），而對于腸桿菌、腸球菌含量的影響較小，對于產(chǎn)氣莢膜梭菌則會降低其含量。陰性對照組干預前后，益生菌（雙歧桿菌、乳桿菌）及產(chǎn)氣莢膜梭菌含量均增加，但是變化幅度遠不及低、中、高劑量組，這可能與動物周齡的增加、腸道容量的提高有關[18]。結合《保健食品功能檢驗與評價方法（2022 版）》中的陽性結果判定標準，判定樣品調節(jié)腸道菌群功能動物實驗的結果呈陽性，認為植物乳植桿菌CCFM8661 具有調節(jié)腸道菌群功能。

腸道屏障已成為治療和預防疾病的重要關注靶標[19]。大量基于動物模型的研究結果表明，植物乳植桿菌可以顯著增強腸道屏障[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)植物乳植桿菌CCFM8661 可以明顯提高小鼠結腸內Claudin-1、Occludin、ZO-1、MUC1 和MUC2 的mRNA 表達水平，結果表明植物乳植桿菌CCFM8661 可以通過改變緊密連接蛋白和腸道黏蛋白的基因表達量間接改善腸道黏膜屏障的強度。 這與之前的研究，植物乳植桿菌KLDS1.0386 可以上調小鼠腸道上皮中Claudin-1、ZO-1、MUC1 和MUC2 的表達，降低結腸通透性的結果一致[22]，證明了植物乳植桿菌CCFM8661 的添加能夠改變小鼠腸道通透性，提高腸道屏障的強度，與陰性對照組相比，低、中、高劑量組腸道中LPS 和D-乳酸含量分別下降了7.70%、13.44%、14.94% 和22.89%、27.36%、30.24%（P<0.01）；而在本實驗中以高劑量干預小鼠為例，腸道菌群雖發(fā)生變化，組織切片觀察實驗卻未見明顯效果，因此需進一步驗證。

短鏈脂肪酸（SCFAs）參與人體代謝，在肝臟、骨骼肌、脂肪組織和胰島等不同器官中具有重要功能，對人體健康起著重要的作用[23]，濃度過低或過高都會對健康產(chǎn)生不利影響。SCFAs 含量受多種因素影響，其中最重要的原因是內源發(fā)酵[24]。細菌生長過程中將難以消化的碳水化合物（膳食纖維）通過一系列代謝反應分解，以滿足自身生長的能量需要，產(chǎn)生的SCFAs 是主要的最終產(chǎn)物[25]，因此維持腸道菌群平衡是調節(jié)SCFAs 含量的重要因素之一。本研究結果證明，植物乳植桿菌CCFM8661 可以增加腸道內短鏈脂肪酸的含量，其中低、中、高劑量組腸道中的乙酸、丙酸和丁酸含量分別升高了18.25%、24.87%、30.61%，3.73%、6.75%、8.34% 和2.11%、4.01%、7.86%。這與張晨玥等[26]的結果一致。

綜上，植物乳桿菌CCFM8661 促進了腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌生長，抑制了產(chǎn)氣莢膜梭菌的增殖。喂食植物乳桿菌CCFM8661 能顯著改變小鼠腸道的通透性，降低腸道中LPS 和D-乳酸的含量，增強腸道屏障，增加腸道中短鏈脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸）的含量?？傊笃趯⑨槍χ参锶橹矖U菌CCFM8661 的功效及安全性進行系統(tǒng)研究，為其在食品中更廣泛的應用提供參考。