萬 炯

貴州省銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)教研室,貴州省銅仁市 554300

在正常的生理與外在環(huán)境影響下,人體與高等動物的動脈血壓是相對恒定的,是通過神經(jīng)因素和體液因素的共同調(diào)節(jié)而實現(xiàn)的,而體液調(diào)節(jié)與神經(jīng)調(diào)節(jié)之間存在聯(lián)系性與區(qū)別性[1]。在當(dāng)前動脈血壓波動的影響分析中,動物模型分析是當(dāng)前一個重要的研究途徑。特別是家兔具有價廉易得、心臟解剖生理與人類類似、耐受性好、容易飼養(yǎng)管理等特點,已廣泛應(yīng)用于多種心血管疾病的研究。并且家兔的主動脈神經(jīng)在生理學(xué)上容易分離,且在解剖學(xué)上易于分離,也獨成一支,也便于觀察。異丙腎上腺素(isoproterenol,ISO)是非選擇性β腎上腺素受體(β adrenergic receptor,β-AR)激動劑,激活腺苷酸環(huán)化酶,可偶聯(lián)G蛋白,影響心房的機械性活動,使ATP轉(zhuǎn)變成cAMP[2]。異丙腎上腺素還可參與調(diào)節(jié)體內(nèi)的擴(kuò)張血管過程與抑制腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)活性,也可參與調(diào)節(jié)機體的血壓與酸堿平衡[3]。本文具體探討與分析了不同劑量異丙腎上腺素對家兔動脈血壓及心臟的影響,以明確異丙腎上腺素應(yīng)用于家兔造模的效果與機制?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象:研究時間為2022年4月—2023年2月,選擇健康成年雄性家兔18只納入本次課題研究,體重2.5～3.0kg,兔齡為3個月左右。健康成年雄性家兔購自北京維通利華實驗動物有限公司,飼養(yǎng)于某某醫(yī)院實驗動物中心,飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(25±3)℃,濕度為(70±5)%。所有家兔分籠飼養(yǎng),每籠2只,家兔飼養(yǎng)于安靜、有良好通風(fēng)和空氣過濾系統(tǒng)的環(huán)境中,飼養(yǎng)過程中使用無菌飲用水及標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料,每3d更換籠具、墊料,水與飼料由家兔隨意攝取。本次實驗已取得動物實驗倫理委員會的允許,并嚴(yán)格按照國際動物保護(hù)協(xié)會規(guī)定進(jìn)行操作。

1.1.2 試劑及儀器:異丙腎上腺素購自美國sigma公司,用無菌生理鹽水配置成0.1ml/kg與0.4ml/kg的使用濃度。BL-420型生物信號采集系統(tǒng)購自成都泰盟公司,心電圖設(shè)備為shimmersensing7814型,戊巴比妥鈉購自上海化學(xué)試劑公司,血清肌酸激酶(Creatine kinase,CK)、乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase,LDH)測定試劑盒均購自南京建成生物制品研究所,抗Caspase-3多克隆抗體(1∶500)、Bcl-2多克隆抗體(1∶1 000)抗體購自上海生工公司。

1.2 家兔分組與處理 將18只家兔隨機平分為低劑量異丙腎上腺素組(低劑量組)、高劑量異丙腎上腺素組(高劑量組)與對照組,每組6只。在適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后進(jìn)行處理。處理過程:低劑量組、高劑量組家兔每日背部皮下分別注射0.1ml/kg與0.4ml/kg的異丙腎上腺素100μl,1次/d;對照組在同樣位置注射無菌生理鹽水100μl,1次/d,持續(xù)應(yīng)用14d。

1.3 觀察指標(biāo) (1)在處理第7天、第14天采用生物信號采集系統(tǒng)測定與記錄家兔的平均動脈壓。(2)在處理第7天、第14天測定采用心電圖測定與記錄家兔的維持竇性節(jié)律時間。(3)在處理第7天、第14天抽取家兔的尾靜脈血1ml左右,低溫分離上層血清后,采用酶聯(lián)免疫法測定與記錄血清肌酸激酶、乳酸脫氫酶含量。(4)在處理第14天處死所有家兔,解剖分離快速取出心臟組織,將全部心臟組織進(jìn)行研磨,提取總蛋白,進(jìn)行SDS-PAGE電泳后,根據(jù)抗原抗體原理,采用Western blot方法測定與記錄抗Caspase-3抗體、抗Bcl-2抗體的相對表達(dá)水平,以β-actin作為內(nèi)標(biāo)。

2 結(jié)果

2.1 三組平均動脈壓變化對比 低劑量組、高劑量組處理第7天、第14天的平均動脈壓均高于對照組(P<0.05),且高劑量組高于低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 不同劑量異丙腎上腺素對家兔平均動脈壓的影響

2.2 三組維持竇性節(jié)律時間變化對比 低劑量組、高劑量組處理第7天、第14天的維持竇性節(jié)律時間均短于對照組(P<0.05),且高劑量組短于低劑量組(P<0.05)。見表2。

表2 不同劑量異丙腎上腺素對家兔維持竇性節(jié)律時間的影響

2.3 三組血清肌酸激酶、乳酸脫氫酶含量變化對比 低劑量組、高劑量組處理第7天、第14天的血清肌酸激酶、乳酸脫氫酶含量均高于對照組(P<0.05),且高劑量組高于低劑量組(P<0.05)。見表3。

表3 不同劑量異丙腎上腺素對家兔血清肌酸激酶、乳酸脫氫酶含量的影響

2.4 三組Caspase-3、Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平對比 低劑量組、高劑量組處理第14天的心臟組織Caspase-3、Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平高于對照組(P<0.05),且高劑量組高于低劑量組(P<0.05)。見表4。

表4 不同劑量異丙腎上腺素對家兔心臟組織Caspase-3、Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平的影響

3 討論

血壓異常作為心血管系統(tǒng)的常見疾病之一,也是引起冠心病、心力衰竭、心肌梗死等疾病的危險因素之一,尤其是其導(dǎo)致心力衰竭的發(fā)病率比較高。心力衰竭為各種心臟疾病的終末階段,伴隨有血流動力學(xué)負(fù)荷過重、大量炎性因子釋放、心臟細(xì)胞受損、心室泵血和充盈功能受損等[4]。心力衰竭在臨床上多表現(xiàn)為乏力、水腫等癥狀,可反復(fù)發(fā)作,且病情頑固。當(dāng)前對心力衰竭的治療水平顯著提高,但心力衰竭的死亡率一直居高不下,5年存活率甚至低于一些惡性腫瘤,為此加強其早期診斷具有重要價值[5]。高血壓需要終身治療,且很多藥物的治療效果不佳。有研究顯示,目前對于高血壓疾病的治療效果并不十分樂觀。從某種程度上講,血壓控制不良的原因可能是由于對血壓調(diào)節(jié)的相關(guān)生理基礎(chǔ)研究不夠清楚。異丙腎上腺素可增加心輸出量,改善周圍組織的血流灌注,使心室發(fā)生重構(gòu),導(dǎo)致心肌損傷[6]。本研究結(jié)果顯示,低劑量組、高劑量組處理第7天、第14天的平均動脈壓均高于對照組(P<0.05),且高劑量組高于低劑量組(P<0.05);低劑量組、高劑量組處理第7天、第14天的維持竇性節(jié)律時間均短于對照組(P<0.05),且高劑量組短于低劑量組(P<0.05),表明異丙腎上腺素在家兔的應(yīng)用能提高平均動脈壓,降低維持竇性節(jié)律時間,且存在量效關(guān)系。從機制上分析,自主神經(jīng)系統(tǒng)的活性狀態(tài)在高血壓的發(fā)生與發(fā)展過程中起著非常重要的作用,神經(jīng)源性高血壓約占高血壓患者的一半,其中腎臟交感神經(jīng)活性狀態(tài)占重要部分[7]。異丙腎上腺素能激動心肌β受體的表達(dá),升高血壓,增加心輸出量。當(dāng)前也有研究表明,采用0.05ml/kg的異丙腎上腺素可使家兔平均動脈壓顯著升高,隨著藥物劑量的逐漸增加,平均動脈壓升高的幅度也逐漸增加,并且藥物作用時間也呈逐漸延長趨勢[8]。但是隨著藥物濃度的逐漸升高,升高平均動脈壓的效果也會出現(xiàn)平臺期。特別是藥物濃度過大,會存在一定的不良反應(yīng),可增加實驗動物的死亡率。

當(dāng)前影響機體動脈血壓的影響因素比較多,包括大動脈管壁彈性、血容量、搏出量、外周阻力和心率等,主要受神經(jīng)和體液共同調(diào)節(jié)[9]。特別是切斷迷走神經(jīng)也會引起血壓的下降,刺激迷走神經(jīng)及其外周端都會引起血壓的下降。當(dāng)心臟活動受到抑制時,可降低心輸出量,導(dǎo)致血壓降低。有研究表明異丙腎上腺素誘導(dǎo)的心損傷大鼠是一個穩(wěn)定、可靠的大鼠心力衰竭模型,可反映大鼠的心功能變化情況[10-11]。本研究顯示,低劑量組、高劑量組處理第7天、第14天的血清肌酸激酶、乳酸脫氫酶含量均高于對照組(P<0.05),且高劑量組高于低劑量組(P<0.05),表明異丙腎上腺素在家兔的應(yīng)用能提高血清肌酸激酶、乳酸脫氫酶含量,且存在量效關(guān)系。從機制上分析,異丙腎上腺素可作用于外周血管平滑肌上的β受體,提高外周阻力與收縮血管。當(dāng)前有研究顯示蛋白激酶非選擇性抑制劑的應(yīng)用可減緩異丙腎上腺素對尿鈉肽分泌的抑制效應(yīng),但是隨著異丙腎上腺素劑量的增加,舒張血管的降壓效應(yīng)小于激動心臟的升壓效應(yīng),甚或可導(dǎo)致機體出現(xiàn)血壓升高[12-13]。

心肌細(xì)胞對缺血、缺氧耐受力差,心肌細(xì)胞如果持續(xù)發(fā)生缺血與缺氧等,可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡過程中,Bcl-2家族發(fā)揮重要作用,Caspase-3、Bcl-2的高表達(dá)都可促進(jìn)細(xì)胞凋亡,尤其是Caspase-3是Caspase級聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶,特別是當(dāng)機體血壓持續(xù)升高時,Caspase-3、Bcl-2的表達(dá)水平也會升高[14]。本研究顯示,低劑量組、高劑量組處理第14天的心臟組織Caspase-3、Bcl-2蛋白相對表達(dá)水平高于對照組(P<0.05),且高劑量組高于低劑量組(P<0.05),表明異丙腎上腺素在家兔的應(yīng)用能提高心臟組織Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平。從機制上分析,異丙腎上腺素為非選擇性的β受體激動劑,可通過鳥苷酸結(jié)合蛋白偶聯(lián)激活腺苷酸環(huán)化酶,激活蛋白激酶A,細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高,使細(xì)胞膜上的鈣離子通道蛋白磷酸化,增多鈣離子內(nèi)流,使得血清中鈣離子水平增加,從而可提高心臟組織Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)水平[15]。當(dāng)前也有研究顯示,異丙腎上腺素能夠提供能量基質(zhì),促進(jìn)腺苷的合成,促進(jìn)能量代謝,激活磷酸肌醇途徑,產(chǎn)生大量的三磷酸肌醇,導(dǎo)致機體出現(xiàn)缺血缺氧,從而使得心功能異常[16]。異丙腎上腺素誘導(dǎo)心肌損傷模型多在大鼠中進(jìn)行,本研究為異丙腎上腺素誘導(dǎo)家兔心肌損傷模型的構(gòu)建提供機制及理論依據(jù)指導(dǎo),為相關(guān)疾病的研究提供基礎(chǔ)。由于經(jīng)費下?lián)鼙容^少,本次課題研究涉及的組別比較少,也沒有納入其他藥物進(jìn)行對比分析,調(diào)查分析的資料比較少,將在后續(xù)研究中探討。

總之,異丙腎上腺素應(yīng)用于家兔心肌損傷模型的構(gòu)建中,能提高平均動脈壓,降低維持竇性節(jié)律時間,還可提高血清肌酸激酶、乳酸脫氫酶含量,促進(jìn)心臟組織Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá),且存在量效關(guān)系,為異丙腎上腺素誘導(dǎo)家兔心肌損傷模型的構(gòu)建提供機制及理論依據(jù)指導(dǎo)。