唐秋媛 張榮臻 胡振斌 王挺帥 牙程玉 呂 超 陳月橋

廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,廣西南寧市 530023

急性肝衰竭(Acute liver failure)是一種在短時間內(nèi)肝臟細(xì)胞出現(xiàn)大量變性壞死及凋亡,肝臟合成、解毒、排泄等功能受損,甚至引起機(jī)體代謝功能紊亂而出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床綜合征,屬臨床上危重肝臟疾病之一[1-2]。該病發(fā)病急驟,進(jìn)展迅速,預(yù)后多與患者肝臟儲備功能、凝血功能、肝病嚴(yán)重程度等多種因素相關(guān),但至今發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,不少學(xué)者傾向于認(rèn)同“二次打擊學(xué)說”,該學(xué)說以免疫炎癥損傷為核心,指出“內(nèi)毒素→巨噬細(xì)胞→細(xì)胞因子風(fēng)暴”為主要發(fā)病機(jī)制,認(rèn)為HBV等因素通過直接損傷肝臟細(xì)胞,機(jī)體內(nèi)毒素的增加從而誘導(dǎo)IL-6等多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生,免疫炎癥系統(tǒng)異常出現(xiàn)過度免疫炎癥反應(yīng)而對肝臟進(jìn)行“二次打擊”,最終引發(fā)肝衰竭[3-4]。改善肝臟炎癥損傷是肝衰竭研究的熱點和難點,近年來研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥體及其上下游因子在固有免疫中發(fā)揮著重要作用,可通過激活Caspase-1,促使白介素等炎癥因子進(jìn)行加工、釋放,引起炎癥反應(yīng),促使肝細(xì)胞壞死[5-7]。本研究通過觀察解毒化瘀顆粒對肝衰竭大鼠模型NLRP3炎癥體及其上下游相關(guān)因子的表達(dá),探索其治療肝衰竭的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級SD大鼠36只,雄性,7周齡,體重為(250±30)g,購于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,許可證號SCXK(京)2019-0010。飼養(yǎng)條件:溫度20～26℃,通風(fēng)且濕度為40%～70%。進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)(自由進(jìn)食、飲水)1周。

1.2 藥物 解毒化瘀顆粒由茵陳30g,大黃15g,白花蛇舌草30g,赤芍50g,郁金15g,石菖蒲15g組成。采用配方顆粒(江陰天江藥業(yè)有限公司),由我院提供。一服藥使用雙蒸水27ml充分溶解藥物,藥物濃度設(shè)定為5.75g/ml,按照體重及給藥濃度稀釋到適宜濃度進(jìn)行灌胃。D-半乳糖、脂多糖分別購于上海麥克林生化科技有限公司、北京索萊寶科技有限公司。

1.3 主要試劑和儀器 RIPA細(xì)胞裂解液(C1053,北京普利萊基因技術(shù)有限公司);BCA蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)(E-BC-K318-M,Elabscience);超純RNA提取試劑盒(CW0581M,CWBIO);Gsafe Red plus核酸染料(GK20002,GLPBIO);大鼠白細(xì)胞介素18(IL-18)ELISA試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β)ELISA試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司);Marker(#26617,Thermo);Mouse Anti-GAPDH(HC301,TransGen Biotech,1/2 000);HRP conjugated Goat Anti-Mouse IgG (H+L) 、HRP conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) (Servicebio,1/2 000);Rabbit Anti Caspase-1(Servicebio,1/1 000);Rabbit Anti NLRP3(Abcam,1/1 000);Rabbit Anti ASC(Bioss,1/1 000);ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Q711-02,Vazyme);紫外分光光度儀(NP80,NanoPhotometer);熒光PCR儀[CFX ConnectTM實時,伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司];全自動酶標(biāo)儀(WD-2012B,北京六一儀器廠);蛋白垂直電泳儀(DYY-6C,北京市六一儀器廠);全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(Tanon-5200,上海天能科技有限公司)。

1.4 造模與給藥 采用隨機(jī)法將36只SPF級SD大鼠分為模型組、空白對照組和解毒化瘀顆粒組,每組12只,記錄各組大鼠體重。

采用腹腔聯(lián)合注射D-GalN+LPS致急性肝衰竭小鼠模型,使用前用生理鹽水將D-GalN 350mg稀釋成5ml,配制成的70mg/ml的溶液,LPS用無菌生理鹽水稀釋成7ml,配成5mg/ml的溶液,過濾除菌。腹腔注射D-GalN+LPS溶液(D-GalN溶液600mg/kg,LPS溶液20μg/kg)一次成膜。造模前1周按分組給藥:空白對照組:0.9%氯化鈉注射液(灌胃)+0.9%氯化鈉注射液(注射);模型組:0.9%氯化鈉注射液(灌胃)+造模藥物(注射);解毒化瘀顆粒組:解毒化瘀顆粒藥液(灌胃)+造模藥物(注射)。每只大鼠每次灌胃體積為10ml/kg,每天灌胃2次(8:00、22:00),給藥濃度57.55g/kg。

造模后48h進(jìn)行取樣,用1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,腹主動脈采血,收集血清進(jìn)行ELISA檢測,剖取肝臟,用PBS洗凈,濾紙吸干,稱重后分別予10%甲醛液固定及液氮保存,用于病理檢測、Western Blot及熒光定量PCR檢測。

1.5 病理檢測 取大鼠肝組織,包埋,切片,烤片,脫蠟,水化。蘇木精水溶液染色3min,鹽酸乙醇分化15s,返藍(lán)15s,流水沖洗,伊紅染色3min,沖洗,脫水,封片,鏡檢。

1.6 qPCR檢測大鼠肝組織中NLRP3、Caspase-1、ASC mRNA表達(dá) 提取各組大鼠肝組織總RNA,測定總RNA濃度,OD260×40=RNA ng/μl(濃度),1.8≤OD260/OD280≤2.2(純度),反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,在RNase-free的PCR管中配制如下混合液20μl:Total RNA 1pg～1μg,4×gDNA wiper Mix 4μl,RNase-free ddH2O To 16μl,加入5×HiScript Ⅱ qRT SuperMix Ⅱ 4μl。上、下游引物各0.4μl,合成cDNA 1μl。引物序列見表1。95℃預(yù)變性10 min,95℃變性10s,58℃退火30s,72℃延伸30s(40個循環(huán))。擴(kuò)增反應(yīng)在Roche Light Cycler 480 熒光定量PCR儀上進(jìn)行,采用2-ΔΔCt法計算目的基因表達(dá)量。

表1 引物序列

1.7 Western Blot檢測肝組織中NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表達(dá) 提取各組大鼠肝組織總蛋白,測定蛋白濃度,配置SDS-PAGE膠,加入制膠板中,緩慢加入至板的2/3的位置,加入無水乙醇壓膠,待分離膠凝固后,加入濃縮膠,進(jìn)行電泳,60V壓縮蛋白,80V分離蛋白。將樣本蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF膜。用1×轉(zhuǎn)膜液300mA恒流轉(zhuǎn)膜,用1×TBST配置3%的脫脂牛奶封閉液,封閉1h。洗膜,用1×TBST浸泡15min后棄掉,重復(fù)3次。分別加入一抗:Anti NLRP3(1/1 000),Anti Caspase-1(1/1 000),Anti ASC (1/1 000),4℃孵育過夜。加入相應(yīng)的過氧化物酶標(biāo)記的二抗,孵育2h,洗膜3次。配置發(fā)光液,成像,凝膠成像系統(tǒng)拍照分析。Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.8 ELISA檢測 按照試劑盒說明設(shè)置樣本孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔,分別加入待測樣本及標(biāo)準(zhǔn)品各50μl,空白孔不加。除空白孔外,樣本孔和標(biāo)準(zhǔn)品孔每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100μl,封板膜封閉反應(yīng)孔,37℃水浴或恒溫箱溫育60min。棄去液體,吸水紙拍干,每孔加入洗滌液300μl,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙拍干,重復(fù)洗板5次。每孔加入底物A、B各50μl,37℃避光孵育15min。每孔加入終止液50μl,15min 內(nèi),在450nm波長處測定各孔的OD值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均用IBM SPSS Statistics 19統(tǒng)計分析,兩組之間定量數(shù)值比較采用獨立樣本t檢驗,多組之間定量數(shù)值比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。以P<0.05作為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 HE染色 如圖1所示,空白對照組:肝臟細(xì)胞圍繞中央靜脈排列呈放射狀,肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)清晰致密,未見明顯變性壞死、纖維組織增生及炎性細(xì)胞浸潤。模型組:肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,肝索排列紊亂,肝細(xì)胞變性壞死嚴(yán)重,可見出血灶。解毒化瘀顆粒組:肝小葉、肝索結(jié)構(gòu)稍紊亂,細(xì)胞壞死程度較輕。

空白對照組

2.2 qPCR檢測 如圖2所示,模型組大鼠肝組織中的ASC、NLRP3、Caspase-1 mRNA均較空白對照組升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);解毒化瘀顆粒組大鼠肝組織中的ASC、NLRP3、Caspase-1 mRNA的表達(dá)明顯低于模型組,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);結(jié)果顯示解毒化瘀顆?？山档透嗡ソ叽笫蟾谓M織中NLRP3、Caspase-1 mRNA表達(dá)水平。

圖2 NLRP3、Caspase-1、ASC基因在各組的相對表達(dá)情況

2.3 WB檢測 如圖3所示,模型組、解毒化瘀顆粒組大鼠肝組織中的ASC、NLRP3、Caspase-1 蛋白表達(dá)均較空白對照組升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);解毒化瘀顆粒組大鼠肝組織中的ASC、NLRP3、Caspase-1 蛋白表達(dá)較模型組下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);結(jié)果顯示解毒化瘀顆?？上抡{(diào)肝衰竭大鼠肝組織中NLRP3、Caspase-1 蛋白表達(dá)水平。

圖3 ASC、NLRP3、Caspase-1在各組的蛋白相對表達(dá)情況

2.4 ELISA檢測 如圖4所示,模型組大鼠血清中IL-1β、IL-18的表達(dá)均高于空白對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);且解毒化瘀顆粒組大鼠血清中IL-1β、IL-18的表達(dá)較模型組下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);結(jié)果顯示解毒化瘀顆?？上抡{(diào)肝衰竭大鼠血清中的IL-1β、IL-18表達(dá)水平。

圖4 ELISA檢測IL-1β、IL-18的含量

3 討論

肝衰竭是臨床病死率極高的嚴(yán)重肝病,具有起病急、進(jìn)展迅速、并發(fā)癥多等特點,可導(dǎo)致多器官功能障礙,愈后極差。急性肝衰竭的病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制尚未明確,結(jié)合現(xiàn)有的研究認(rèn)為免疫炎癥損傷、腸道微生態(tài)失衡和肝臟微循環(huán)障礙在內(nèi)的直接損傷和間接損傷多種因素等為其主要的發(fā)病機(jī)制[8-9]。近年來的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)NLR家族成員(如NLRP1、NLRP3、IPAF和AIM-24等)能通過炎癥體多蛋白復(fù)合體激活Caspase-1,釋放多種炎癥因子和細(xì)胞因子,參與不同類型的炎癥反應(yīng)[10]。

炎癥體是一種蛋白復(fù)合體,NLRP3參與形成的NLRP3炎癥體介導(dǎo)促炎因子IL-1β、IL-18的產(chǎn)生。

NLRP3炎癥體具有識別機(jī)體受損或危險信號,被證實參與痛風(fēng)、重癥肌無力、急性腎損傷等多種自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制。此外,NLRP3炎癥體還參與急慢性肝病的發(fā)病機(jī)制[11-13]。該炎癥體涵蓋有Caspase-1、IL-1β、IL-22、TNF-α和MCP-1等,被激活后,Caspase-1被活化,進(jìn)一步促進(jìn)IL-1β等促炎細(xì)胞因子等分泌,釋放至細(xì)胞外而發(fā)揮炎癥效應(yīng)[14-16],進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞壞死。隨著研究的深入,人們逐漸意識到炎癥體在炎癥反應(yīng)中扮演著重要角色,是炎癥反應(yīng)的核心,在炎癥的啟動及維持上起關(guān)鍵性作用,作為一種極具應(yīng)用潛力的治療新靶點,炎癥體正迅速成為國際研究的熱點。并且,隨著研究不斷深入,越來越多的研究表明,NLRP3炎癥體參與了急性肝衰竭的發(fā)病過程。因此,深入探索炎癥體參與的免疫應(yīng)答分子機(jī)制,對闡明及豐富肝衰竭“免疫炎癥二次打擊學(xué)說”具有重要意義。

毛德文教授打破了因“濕熱發(fā)黃、瘀熱成毒” 形成肝衰竭的傳統(tǒng)中醫(yī)理念,首次提出以“毒邪致病”的新理念,形成了“毒邪病因”學(xué)說[17-18]。該學(xué)說認(rèn)為 “熱毒內(nèi)蘊、瘀血內(nèi)阻”為核心病機(jī), “毒”“瘀”“痰(濁)”膠結(jié)[19]為其主要的病理因素。由于毒邪多在各種急性傳染病后期治病,加之其發(fā)病急、病程短,往往不能及時控制病情發(fā)展,因此對于HBV所致的急性肝衰竭的早期診斷應(yīng)從毒邪出發(fā),為此,毛德文教授結(jié)合其多年臨床經(jīng)驗,創(chuàng)制了解毒化瘀顆粒[組成:茵陳30g、大黃15g(后下)、白花蛇舌草30g、赤芍50g、郁金15g、石菖蒲15g],具有解毒化瘀、開竅醒神、生新見長之功效[20]。

本研究證實了解毒化瘀顆粒對急性肝衰竭大鼠NLRP3炎癥體NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18因子具有調(diào)控作用,能夠下調(diào)NLRP3炎癥體NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β和IL-18等相關(guān)因子的表達(dá),極大豐富及支撐肝衰竭“免疫炎癥二次打擊學(xué)說”的科學(xué)內(nèi)涵,為肝衰竭的治療提供新的靶標(biāo),深刻揭示中藥解毒化瘀顆粒緩解肝臟炎癥損傷,拮抗肝衰竭的分子機(jī)制,對促進(jìn)中醫(yī)藥發(fā)展具有重要意義。