楊宇航 陳嘉明 王世坤 張乃金 李遠(yuǎn)棟 劉愛峰 王平*

1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,天津 300193

2.國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心,天津 300193

3.天津中醫(yī)藥大學(xué),天津 301617

4.University of Manchester,Manchester M13 9PL

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種全身性的骨骼疾病,其病理特征是骨密度降低、骨小梁微結(jié)構(gòu)受損和骨質(zhì)脆性增高,早期多無癥狀,后期臨床表現(xiàn)為疼痛、脊柱變形和脆性骨折發(fā)生等,多發(fā)于絕經(jīng)后女性和老年人群[1]。OP分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類,臨床上以原發(fā)性O(shè)P中的絕經(jīng)后OP和老年性O(shè)P最為常見,一項納入20 416名受試者的橫斷面研究表明40歲或以上人群骨質(zhì)疏松癥的患病率在男性中為5.0%(95%CI:4.2%～5.8%),在女性中為20.6%(95%CI:19.3%～22.0%)[2]。隨著我國社會老齡化的加劇,該病引發(fā)的一系列公共健康問題逐漸受到國家的重視。由于中藥多方向、多途徑、多靶點的整體論治特點,在治療骨質(zhì)疏松癥等衰老相關(guān)全身性疾病中取得了豐厚的成果。

黃櫨是漆樹科植物黃道櫨Cotinus coggyria Scop.var.cinerea Engl或毛黃櫨Cotinus coggyria Scop.var.pubescens Engl的木材?！侗静菔斑z》中有載:“黃櫨性寒、味苦,除煩熱、解酒疽、目黃、水煮服之……”,《中華本草》中說明黃櫨歸肝腎經(jīng),功用活血散瘀,主治跌打損傷、骨折、虛腫等。漆黃素(Fisetin)是中藥黃櫨的有效成分,在防治骨質(zhì)疏松癥方面有著積極的作用[3]。OP的發(fā)生與衰老細(xì)胞及其表型的積累、氧化應(yīng)激、炎癥引發(fā)的骨代謝紊亂等多種因素密切相關(guān),針對多方面的致病因素,漆黃素可以通過多種途徑達(dá)到延緩骨質(zhì)疏松癥進(jìn)展的目的。因此,本文對黃櫨有效成分漆黃素治療OP的作用機制進(jìn)行綜述,為深入研究漆黃素治療OP的基礎(chǔ)研究以及新型藥物開發(fā)提供研究依據(jù)。

1 漆黃素的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和藥理作用

漆黃素化學(xué)名稱為2-(3,4-二羥基苯基)-3,7-二羥基-4 h-苯并呋喃-4-酮,又稱為3,3',4',7-四羥基黃酮,屬于黃酮醇類化合物,其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1,外觀呈淡黃色粉末,易溶于乙醇、丙酮和醋酸,幾乎不溶于水。不同黃酮醇類化合物之間藥理作用的異同主要取決于其B環(huán)上取代基的極性、位置和數(shù)量[4],漆黃素B環(huán)上取代基由兩個相鄰的羥基構(gòu)成了反應(yīng)性兒茶酚部分,研究證明這種結(jié)構(gòu)可以與DPPH快速反應(yīng)形成二聚體從而提供了更優(yōu)秀的抗氧化活性。除此之外,漆黃素的B環(huán)結(jié)構(gòu)更有利于通過與多肽鏈上的氨基酸殘基形成氫鍵和π偶聯(lián)效應(yīng)從而實現(xiàn)對蛋白質(zhì)的調(diào)控,研究證明漆黃素可以通過抑制靶基因啟動子中κB結(jié)合、抑制ERK1/2磷酸化、抑制JAK/STAT-1激活或直接中斷LPS與toll樣受體的結(jié)合等方式達(dá)到抗炎、抗腫瘤、抗衰老等目的[5],在OP、骨關(guān)節(jié)炎、骨肉瘤等骨科疾病中起到重要作用[6]。

圖1 漆黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖(分子式:C15H10O6)

2 漆黃素通過靶向消除衰老細(xì)胞治療OP

衰老細(xì)胞(senescent cells,SnCs)及其分泌表型(SASP)是影響衰老及其相關(guān)疾病的主要因素[7]。Farr等[8]觀察到老年小鼠(24個月)較年輕小鼠(6個月)骨/骨髓中的衰老骨髓細(xì)胞、衰老成骨細(xì)胞祖細(xì)胞、衰老成骨細(xì)胞和衰老骨細(xì)胞顯著增高,也觀察到老年小鼠骨細(xì)胞中多個SASP標(biāo)志物表達(dá)顯著增多?；谝陨辖Y(jié)果,Farr等[9]通過構(gòu)建OP模型小鼠,靶向誘導(dǎo)半胱天冬酶8表達(dá)促進(jìn)SnCs凋亡后,觀察到骨小梁厚度與骨皮質(zhì)厚度顯著增加,證明了SnCs與OP的因果關(guān)系。Chandra等[10]也證明放療后OP小鼠的骨組織中衰老成骨細(xì)胞和衰老骨細(xì)胞增加,通過比較放療后骨組織與衰老骨細(xì)胞中p21 and p16Ink4a的變化趨勢,明確了SnCs與OP的密切聯(lián)系,靶向清除這些SnCs后,可以觀察到小鼠每骨表面骨形成率(BFR/BS)增加4.5倍,進(jìn)一步證明了SnCs積累是OP的發(fā)病機制之一。既往研究證明,漆黃素可以通過抑制BCL-2/BCL-XL家族蛋白表達(dá)、激活MDM2/p53通路等多種途徑靶向清除SnCs[11],相對于達(dá)沙替尼等人工合成靶向清除SnCs藥物具有更好的安全性和劑量耐受。Hambright等[12]利用Zmpste24缺陷小鼠構(gòu)建OP模型,每周4次喂食漆黃素,連續(xù)給藥一個月后應(yīng)用CT測量發(fā)現(xiàn)CT值、骨密度(BMD)和骨表面積與骨體積比值(BS/BV)顯著增高,除此之外,他們應(yīng)用達(dá)沙替尼和槲皮素(DQ)聯(lián)合用藥治療Zmpste24缺陷小鼠后,骨小梁數(shù)(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)和骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)都無改善,通過比較漆黃素與DQ所調(diào)節(jié)信號通路異同,發(fā)現(xiàn)SIRT1和AKT可能是漆黃素治療OP的關(guān)鍵靶點?？傊?漆黃素可以通過靶向清除OP骨組織中由衰老成骨細(xì)胞、衰老骨細(xì)胞等組成的SnCs群改善骨密度與骨微結(jié)構(gòu),達(dá)到延緩OP進(jìn)展的目的,其關(guān)鍵靶點可能是SIRT1和AKT。

3 漆黃素通過促進(jìn)成骨細(xì)胞分化治療OP

成骨細(xì)胞是骨骼形成、發(fā)育的主要功能細(xì)胞,通過分泌Ⅰ型膠原蛋白、骨鈣素、骨連蛋白、骨橋蛋白等類骨質(zhì),羥磷灰石和膠體磷酸鈣等無機質(zhì)沉積并結(jié)合于類骨質(zhì)最終形成骨骼[13]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨分化是成骨細(xì)胞的主要來源,BMSCs的增殖與成骨分化在骨形成過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用,是目前治療OP的關(guān)鍵靶點之一[14]。多項研究證明,漆黃素改善成骨細(xì)胞分泌類骨質(zhì)功能的同時可以促進(jìn)類骨質(zhì)的礦化,還可以促進(jìn)BMSCs 的成骨分化從而促進(jìn)骨骼生長發(fā)育。Léotoing等[15]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)漆黃素可以通過上調(diào)Runx2 mRNA的轉(zhuǎn)錄活性促進(jìn)Runx2與骨鈣素基因啟動子的相互作用,從而促進(jìn)骨鈣素和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá),促進(jìn)了成骨細(xì)胞的礦化過程,之后該團隊?wèi)?yīng)用漆黃素干預(yù)OP小鼠,發(fā)現(xiàn)缺乏的骨鈣素和I型膠原蛋白被部分改善,證明漆黃素可以通過調(diào)節(jié)Runx2轉(zhuǎn)錄活性增加成骨細(xì)胞分泌類骨質(zhì)能力。Molagoda等[16]也證明了以上研究成果,除此之外,他們還發(fā)現(xiàn)漆黃素可以抑制活化T細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)1(NFATc1),酒石酸鹽抗性酸性磷酸酶-6(ACP6)和組織蛋白酶K(CTSK)等抗成骨細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄活性,證明了漆黃素可以促進(jìn)糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)Ser9位點的磷酸化,導(dǎo)致GSK-3β失活進(jìn)而促進(jìn)β-catenin的穩(wěn)定與核易位,下調(diào)OP小鼠的BMSCs成骨分化被抑制程度,促進(jìn)成骨。Liang等[17]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合體外實驗的方式也證明了漆黃素可以通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路促進(jìn)BMSCs的成骨分化,同時,他們還驗證了漆黃素對BMSCs的細(xì)胞毒性作用,發(fā)現(xiàn)只有在高濃度(20 μmol/L)、長時間(72 h)干預(yù)下才會產(chǎn)生細(xì)胞毒性。漆黃素除了可以調(diào)節(jié)β-catenin信號改善OP成骨,Xu等[18]通過連通圖(CMap)方法和細(xì)胞實驗證明漆黃素也可通過激活PI3K-AKT通路促進(jìn)前成骨細(xì)胞增殖、分化為成骨細(xì)胞。總而言之,漆黃素可以通過調(diào)節(jié)多種信號通路促進(jìn)BMSCs定向成骨細(xì)胞分化,也可以提高成骨細(xì)胞分泌骨鈣素、Ⅰ型膠原蛋白等類骨質(zhì)的能力,促進(jìn)類骨質(zhì)與鈣磷酸鹽等無機質(zhì)的結(jié)合,全過程、多途徑地促進(jìn)骨骼形成、發(fā)育過程,且具有良好的安全性。

4 漆黃素通過保護(hù)成骨細(xì)胞治療OP

隨著OP中有關(guān)程序性細(xì)胞死亡(PCD)研究的深入,靶向降低成骨細(xì)胞活性失衡逐漸成為治療OP的新方向。研究表明,細(xì)胞凋亡、鐵死亡和焦亡可能是成骨細(xì)胞活性失衡的主要PCD途徑。細(xì)胞凋亡是絕大部分成骨細(xì)胞的死亡途徑,Liang等[19]認(rèn)為年齡相關(guān)性的骨質(zhì)流失伴隨著成骨細(xì)胞凋亡的增加,這些與ROS水平增高密切相關(guān),雌激素、維生素E等物質(zhì)對OP的改善是通過抗氧化作用實現(xiàn)的。Lu等[20]通過建立糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的骨質(zhì)疏松(GIOP)模型,證明糖皮質(zhì)激素通過抑制system xc-和GPX4表達(dá)導(dǎo)致GSH被耗盡,ROS過度增加,引發(fā)成骨細(xì)胞鐵死亡導(dǎo)致骨質(zhì)流失。Tao等[21]通過總結(jié)發(fā)現(xiàn),在年齡相關(guān)性O(shè)P或炎癥相關(guān)性O(shè)P中,由ROS觸發(fā)的NLRP3炎癥小體可以激活Caspase-1切割細(xì)胞焦亡關(guān)鍵因子GSDMD(Gasdermin D),釋放出活性片段GSDMD-NT錨定于成骨細(xì)胞膜上促進(jìn)質(zhì)膜孔形成,最終導(dǎo)致成骨細(xì)胞焦亡?？傊?不同PCD途徑導(dǎo)致的成骨細(xì)胞活性失衡都與ROS密切相關(guān)。目前雖然沒有直接證據(jù)證明漆黃素通過保護(hù)成骨細(xì)胞擺脫PCD而治療OP,但是既往多項研究已經(jīng)證明了漆黃素優(yōu)秀的抗氧化能力,因此,通過消耗過量ROS抑制成骨細(xì)胞不同PCD途徑可能是漆黃素治療OP的途徑之一。

5 漆黃素通過抑制破骨細(xì)胞分化治療OP

破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞功能相反,是骨骼重塑的主要功能細(xì)胞,通過營造酸性環(huán)境、分泌膠原酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等水解酶先后溶解和消化骨基質(zhì)中的無機成分和有機成分,破骨細(xì)胞過度活動時,會引起骨質(zhì)流失最終導(dǎo)致OP[22]。骨化中心的胚胎紅髓系祖細(xì)胞(erythrocyte myeloid progenitor cells,EMPs)的破骨細(xì)胞分化是破骨細(xì)胞的主要來源,EMPs首先分化為巨噬細(xì)胞,之后互相融合成破骨細(xì)胞[23]。破骨細(xì)胞分化受到多種信號通路的調(diào)控,尤其是核因子κB 配體(RANKL)相關(guān)通路可以強烈刺激破骨細(xì)胞分化,以下對漆黃素如何調(diào)控RANKL相關(guān)通路進(jìn)行詳細(xì)論述,互作機制示意圖見圖2。

圖2 漆黃素調(diào)控RANK/RANKL信號通路抑制破骨細(xì)胞分化互作機制示意圖

5.1 漆黃素通過減少MKP-1泛素化抑制RANKL/P38 MAKP信號通路

既往研究證明,漆黃素可以調(diào)節(jié)多個RANKL相關(guān)通路抑制破骨細(xì)胞分化從而減少骨質(zhì)流失治療OP。Choi等[24]證明漆黃素通過抑制由RANKL誘導(dǎo)的P38 MAPK信號通路的激活,進(jìn)而抑制了即刻早期應(yīng)答基因c-Fos基因和活化 T 細(xì)胞因子 c1(NFATc1)的激活,它們分別是破骨細(xì)胞分化過程早期階段和中晚期階段的轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)而抑制包括組織蛋白酶K等多種水解酶在破骨細(xì)胞中的表達(dá)。同時,Choi等[24]發(fā)現(xiàn)漆黃素還可能具有通過抑制樹突狀細(xì)胞-特異性跨膜蛋白(DC-STAMP)表達(dá)從而抑制破骨細(xì)胞分化的能力,除此之外,他們還證明漆黃素通過以上途徑抑制破骨細(xì)胞分化都具有劑量依賴性特點。Léotoing等[25]通過體外試驗得出了與Choi等[24]相似的結(jié)果,但是他們明確了漆黃素是通過抑制MAPK磷酸酶-1(MKP-1)與多泛素鏈的偶聯(lián)維持了MKP-1的穩(wěn)定,從而相對上調(diào)了MKP-1對P38 MAKP降解能力,進(jìn)而抑制了破骨細(xì)胞分化。同時,Léotoing等[25]也證明了漆黃素對RANKL誘導(dǎo)的JNK信號通路和NF-κB信號通路也有抑制作用,除此之外,他們通過動物實驗證明了漆黃素在由雌激素缺乏引起的OP小鼠模型和由炎癥引起的OP小鼠模型中都展現(xiàn)出抑制骨質(zhì)流失能力。綜上,漆黃素通過減少MKP-1泛素化抑制RANKL/P38 MAKP信號通路進(jìn)而抑制相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,最終抑制破骨細(xì)胞分化進(jìn)程,降低膠原酶、明膠酶等多種水解酶的分泌,延緩骨質(zhì)流失,達(dá)到治療OP的目的。

5.2 漆黃素通過減少氧化應(yīng)激抑制RANKL下游信號通路

Lee等[26]發(fā)現(xiàn)RANKL激活破骨細(xì)胞分化過程初始階段會通過腫瘤壞死因子受體6(TRAF6)/RAC1/NADPH氧化酶1(NOX1)信號級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生ROS,這些ROS充當(dāng)信號因子激活了下游JNK、ERK和MAPK信號通路,進(jìn)而導(dǎo)致破骨細(xì)胞分化,雖然這些ROS可以被成骨細(xì)胞產(chǎn)生的抗氧化物質(zhì)所消除,但當(dāng)其他途徑產(chǎn)生的ROS超過抗氧化能力導(dǎo)致氧化應(yīng)激時,就會加速破骨細(xì)胞分化[27],從而破壞破骨細(xì)胞骨吸收與成骨細(xì)胞骨形成之間的平衡狀態(tài),導(dǎo)致OP發(fā)生,因此抗氧化劑補充療法逐漸成為治療OP的研究熱點,多項研究已經(jīng)證明抗氧化劑有助于降低破骨細(xì)胞活性[28]。漆黃素具有優(yōu)秀的抗氧化能力,它一方面可以直接抑制ROS的生成降低細(xì)胞氧化應(yīng)激水平,也可以通過增加谷胱甘肽(GSH)水平消耗過多的ROS[29]。另一方面,漆黃素可以促進(jìn)線粒體自噬去除功能缺失的線粒體,減少ROS的生成[30]。Feng等[31]應(yīng)用漆黃素治療由卵巢切除術(shù)(OVX)誘導(dǎo)的OP小鼠,觀察到谷胱甘肽(GSH)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)水平都顯著升高,小鼠骨骼中骨礦物質(zhì)含量(BMC)、BMD、最大負(fù)荷和骨骼剛度等生化參數(shù)水平都得到明顯改善,證實了漆黃素可以通過減少氧化應(yīng)激治療OP。

5.3 漆黃素通過調(diào)節(jié)炎性因子下調(diào)RANK/RANKL表達(dá)

研究發(fā)現(xiàn)OP患者的血清高敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)等炎性相關(guān)指標(biāo)相對較高[32],骨關(guān)節(jié)炎(OA)、強直性脊柱炎(AS)和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)等骨組織炎性疾病患者往往伴隨嚴(yán)重程度不同的骨質(zhì)流失[33]。除此之外,目前認(rèn)為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(PMOP)是由于雌激素下降引發(fā)的炎性因子增加誘導(dǎo)破骨細(xì)胞加速分化所導(dǎo)致[34],因此,抑制炎性因子在延緩OP發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。漆黃素可以從多個方面減少炎性因子對破骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用。一方面漆黃素可以通過與蛋白激酶Cδ(PKCδ)直接結(jié)合抑制TNF-α功能[35],既往研究表明TNF-α可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞增加RANK表達(dá)和誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞增加RANKL表達(dá)[36],漆黃素通過抑制TNF-α以上作用進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞分化。另一方面,漆黃素可以通過多個途徑抑制NLRP3炎癥小體的激活,Huang等[37]證明漆黃素可以通過抑制FGFR1/TLR4信號通路參與抑制NLRP3炎癥小體的激活,Pu等[38]證明漆黃素可以通過上調(diào)GSK3β/AMPK信號傳導(dǎo)抑制NLRP3、NLRP7炎癥小體的激活,NLRP3炎癥小體是一種蛋白質(zhì)復(fù)合體,是炎癥反應(yīng)的啟動開關(guān)之一,可以促進(jìn)半胱天冬酶-1(Caspase-1)對IL-1β的加工,IL-1β被加工后產(chǎn)生活性,結(jié)合其在T淋巴細(xì)胞,B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的受體,促進(jìn)RANKL的產(chǎn)生,并與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞上的RANK結(jié)合,從而促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和活化[39]?？傊?漆黃素通過多途徑抑制TNF-α功能和NLPR3炎癥小體的激活,進(jìn)而抑制RANK/RANKL的產(chǎn)生和表達(dá),阻斷破骨細(xì)胞分化起始信號,延緩OP進(jìn)展。

6 總結(jié)與展望

OP的主要癥狀是疼痛、脊柱變形和脆性骨折,屬于中醫(yī)“骨痹”“骨痿”范疇,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為OP為本虛標(biāo)實之證,本虛在腎,標(biāo)實在瘀[40],正如王清任在《醫(yī)林改錯》中強調(diào)的“痹癥有瘀血說”,瘀血是OP的病理基礎(chǔ),古今醫(yī)家都將活血化瘀作為OP的根本治則之一[41]。黃櫨的主要活性成分漆黃素有活血化瘀功效,與中醫(yī)辨證論治思路十分契合,除此之外,由于OP發(fā)病機制復(fù)雜,漆黃素多靶點聯(lián)合起效的特點在OP治療中擁有巨大的潛力,通過保護(hù)、促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化,抑制破骨細(xì)胞分化,清除OP相關(guān)SnCs群,恢復(fù)并維持骨吸收-骨新生平衡,延緩骨質(zhì)流失,改善骨微結(jié)構(gòu)和骨密度,對多種類型OP起到治療效果,詳見表1。

表1 漆黃素治療OP分型

漆黃素早期多被用作癌癥治療的補充療法,隨著SnCs及SASP致病機制的提出,同時由于漆黃素在癌癥治療中表現(xiàn)出優(yōu)秀的靶向誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力,因此,漆黃素被納入senolytics藥物范疇而被廣泛應(yīng)用于多種衰老相關(guān)疾病,盡管漆黃素治療OP的研究不斷深入,但是在未來還應(yīng)注意完善以下方面:①目前漆黃素治療OP研究僅局限于細(xì)胞實驗和動物實驗中,今后需要嘗試在臨床試驗中驗證其治療效果。②研究表明漆黃素清除SnCs、抑制破骨細(xì)胞分化都存在劑量依賴性特點,但是鮮有量效關(guān)系相關(guān)研究,同時,也有研究顯示高劑量漆黃素可能會產(chǎn)生細(xì)胞毒性,因此明確OP不同階段下的最優(yōu)劑量,既有助于增強漆黃素治療效果,也對臨床安全提供保證。③由于漆黃素難溶于水,傳統(tǒng)劑型存在生物利用低的特點,但是漆黃素的劑型相關(guān)研究卻鮮有報道,改進(jìn)漆黃素提取工藝以及開發(fā)新的藥物劑型提高溶解性和生物利用程度,可使藥物療效最大化。

另外,多種如銅死亡、雙硫死亡等新型細(xì)胞程序性死亡途徑被發(fā)現(xiàn),意味著可能會有更多的信號通路被證明與成骨細(xì)胞死亡有關(guān),同時,如何利用OP相關(guān)SnCs于不同細(xì)胞死亡途徑的死亡風(fēng)險從而靶向清除SnCs也是值得思考并研究的問題,這些更加證明了漆黃素多靶點、全方位治療OP的科學(xué)性。