齊雅茜 寧浩馳 潘靜 趙瑞 雷新宇 宋敏 張浩令 張忠文 王薇 宋志靖,5*

1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院,甘肅 蘭州 730000

2.馬來西亞理科大學(xué)高級醫(yī)學(xué)與牙科研究所,馬來西亞 檳城 13200

3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,甘肅 蘭州 730000

4.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院,甘肅 蘭州 730000

5.教育部敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種隱秘性強(qiáng)且主要影響骨骼的疾病,主要表現(xiàn)為骨質(zhì)和強(qiáng)度的逐漸降低[1]。在患者臨床發(fā)病之前,骨重建周期就已開始走向失衡,這種情況普遍見于老年人群,極大地增加了骨折的風(fēng)險,使得生活質(zhì)量降低[2]。雌激素的減少是誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥的主要因素[3],而遺傳、營養(yǎng)缺乏、吸煙、酗酒及長期缺乏體育運(yùn)動等都是該疾病的誘發(fā)因素。

固本增骨顆粒是由甘肅省名中醫(yī)宋敏教授在臨床治療中常用的方劑。近期研究表明,Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)信號通路在維持骨質(zhì)生成與吸收的平衡、刺激成骨細(xì)胞增殖和保持骨組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用,是治療骨質(zhì)疏松癥的潛在靶點(diǎn)。Wnt家族的成員Wnt7b參與多種生物過程,如細(xì)胞增殖、凋亡、炎癥反應(yīng)和代謝[5]。其通過激活 β-catenin調(diào)節(jié)骨病的發(fā)生和發(fā)展[6]。GSK3β是Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)的負(fù)調(diào)節(jié)因子,而TCF3是一種轉(zhuǎn)錄因子,它們與Wnt信號通路的關(guān)鍵成分 β-catenin相互作用,調(diào)節(jié)了參與成骨細(xì)胞(osteoblast,OB) 分化和活性的基因的表達(dá)[7-8]。研究顯示,Wnt/β-catenin信號通路在很大程度上可以影響骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生,前期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)[9],固本增骨方可從激素、礦物質(zhì)代謝、骨密度等方面改善骨質(zhì)量,促進(jìn)骨質(zhì)形成,而固本增骨顆粒是否能通過影響Wnt/β-catenin信號通路進(jìn)而調(diào)控骨代謝,還需要進(jìn)一步的研究去探索。

本研究旨在運(yùn)用大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn),通過應(yīng)用HE染色來展示各組的病理變化,同時采用RT-PCR來檢測各組間股骨組織中Wnt7b、TCF3、GSK3β相關(guān)指標(biāo)mRNA的相對表達(dá)水平;利用WB和IHC法來測定股骨組織中Wnt7b、TCF3、GSK3β蛋白含量的表達(dá)情況。這些方法將有助于深入了解固本增骨顆粒如何調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路,進(jìn)而揭示其治療骨質(zhì)疏松癥的潛在作用機(jī)制。期望最終找到最優(yōu)的治療方法,推動中醫(yī)藥在預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥中的廣泛應(yīng)用,為臨床治療提供堅實(shí)的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物:66只3個月齡大的 SPF級雌性SD大鼠購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心,體重(220±10) g,許可證號:SCXK(甘)2020-0001,飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。本實(shí)驗(yàn)已通過甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心倫理委員會批準(zhǔn),倫理審批號:2020-312。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物:固本增骨免煎顆粒配方(黃芪、炙淫羊藿、黨參、當(dāng)歸、肉蓯蓉、熟地黃、鹽補(bǔ)骨脂、燙狗脊、烏藥)原料購自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。補(bǔ)佳樂戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司,批號650A)。

1.1.3主要試劑和儀器:山羊抗兔二抗(Servicebio,武漢賽維爾生物科技有限公司,批號CR2102123);SDS-PAGE試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、HE染色劑試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,批號分別為20191218、20191022、20191104);GAPDH、Wnt7b、TCF3、GSK3β(ABCam,艾博抗 (上海)貿(mào)易有限公司,批號依次為GR303514-13、GR3245732-16、GR3321195-4、GR33380230-2);兔SP試劑盒、DAB 顯色試劑盒(中杉金橋,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司,批號分別為2122B1013、2132A0325);Western Blot 轉(zhuǎn)膜儀及Western Blot 電泳儀(北京六一生物科技公司);高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf);酶標(biāo)儀(美國Bio Rad公司);化學(xué)發(fā)光成像儀 (北京賽智科技有限公司);PH儀 (Alalis);高速低溫臺式離心機(jī)(德國Eppendorf);實(shí)時定量PCR儀(美國Thermo);渦旋振蕩器及小型離心機(jī)(美國賽洛捷克);包埋機(jī)(金華科迪儀器公司);切片機(jī)(德國LEICA公司);顯微鏡(Leica DM2500)。

1.2 方法

1.2.1分組、造模及干預(yù):按照雙側(cè)卵巢切除術(shù)造模方法[10],將66 只 SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(13只)和造模組(53只)進(jìn)行造模。假手術(shù)組不摘除卵巢,造模8周后隨機(jī)選取3只進(jìn)行骨密度檢測。待模型鑒定成功后,將造模組隨機(jī)分為模型組、固本增骨顆粒高、中、低劑量組和陽性藥物組,每組10只。將固本增骨免煎顆粒按照成人劑量換算為大鼠等效劑量[11],分別以相應(yīng)濃度(低劑量組6.1 g/kg,中劑量組12.2 g/kg,高劑量組24.4 g/kg)灌胃,根據(jù)大鼠灌胃容量0.1 mg/kg標(biāo)準(zhǔn)將藥物配置為 2 mL的體積進(jìn)行灌胃治療。按人鼠等效劑量,陽性藥物組給予戊酸雌二醇每日0.09 mg/kg灌胃。模型組、假手術(shù)組均用等體積的生理鹽水進(jìn)行灌胃,每周稱體重一次,據(jù)此調(diào)整灌胃劑量。上述各組大鼠給藥,均每天上午灌胃1次,持續(xù)3個月。

1.2.2標(biāo)本采集與處理:將大鼠成功麻醉后,取出大鼠兩側(cè)股骨,去除附著組織,用生理鹽水漂洗干凈,將一側(cè)股骨標(biāo)本置于事先標(biāo)好的EP凍存管中,另一側(cè)標(biāo)本放置在裝有含4%多聚甲醛固定液的EP管中備用。用含4%多聚甲醛溶液將骨組織固定24 h后,放入含10% EDTA溶液中脫鈣3周左右,將大頭針可輕松刺入股骨以確定脫鈣成功后進(jìn)行包埋。

1.2.3指標(biāo)檢測:(1)蘇木素-伊紅(HE)染色:將骨組織切片進(jìn)行脫蠟、水化,蘇木素染色 5 min,梯度乙醇脫水封片,二甲苯I和二甲苯Ⅱ溶液浸泡 25 min,將切片干燥處理后,中性樹膠滴封片,封片后于顯微鏡下觀察,拍照。(2)切片免疫組化染色(IHC):將切片脫蠟、脫水后洗片,添加修復(fù)液進(jìn)行組織抗原修復(fù)。阻斷PO,血清封閉30 min,一抗孵育過夜,加酶標(biāo)二抗:取出玻片后,在37 ℃條件下復(fù)蘇35 min,加二抗37 ℃ 30 min,加DAB 8 min,蘇木素復(fù)染1 min,梯度乙醇脫水,然后轉(zhuǎn)于二甲苯I、II 溶液中各處理25 min,最后將切片置于通風(fēng)櫥中風(fēng)干,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察結(jié)果。(3)RT-PCR檢測方法:將樣品移到裝有1 mL RNAex Pro的離心管中,混勻,以12 000 r/min轉(zhuǎn)速,4 ℃環(huán)境下,離心10 min。管中加入氯仿,混勻,室溫靜置約5 min,離心:12 000 r/min,4 ℃,14 min。加異丙醇,混勻,離心:12 000 r/min,4 ℃,10 min。加入80%乙醇,混勻,并渦旋充分洗滌沉淀。之后以7 500 r/min轉(zhuǎn)速,4 ℃環(huán)境下,離心5 min,棄廢液,留取RNA沉淀。將各組樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。定量分析結(jié)果以Ct值表示,用2-△△CT方法計算目的基因相對表達(dá)量?；蛞镄蛄幸姳?。(4)WB檢測方法:取大鼠股骨碎片組織0.1 g,用預(yù)冷的鹽水洗滌干凈,移入2 mL離心管中,加入1 mL蛋白裂解液,放入研磨儀中研磨。蛋白定量后,變性上樣,凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜后封閉2 h,加入一抗 4 ℃ 孵育過夜,更換二抗,室溫孵育2 h,最后使用ECL顯影,拍照分析。

表1 引物序列設(shè)計表

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 骨組織病理形態(tài)學(xué)

HE染色顯示假手術(shù)組骨結(jié)構(gòu)正常,小梁骨厚度均勻,結(jié)構(gòu)完整,小梁連接良好,脂肪細(xì)胞和骨細(xì)胞形態(tài)清晰;模型組骨小梁變細(xì)不規(guī)則、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)雜亂無章,部分骨小梁明顯細(xì)長或斷裂,兩者連接不完全,小梁壁厚度不等,大鼠骨髓腔內(nèi)觀察到大量脂肪形成液泡,液泡脂肪細(xì)胞增多,與骨形態(tài)損傷一致,表明模型建立成功。固本增骨顆粒干預(yù)后,固本增骨顆粒治療組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)逐漸趨向成熟,厚度有所增加,逐漸均勻化,骨細(xì)胞增多,骨小梁與周圍組織連接緊密,連續(xù)性逐漸完整,整體結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)好。見圖1。

圖1 各組大鼠HE染色結(jié)果(×200)

2.2 IHC骨組織中 Wnt7b、TCF3、GSK3β 蛋白表達(dá)

由表2、圖2可知,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠股骨組織中Wnt7b、TCF3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01),GSK3β蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01);與模型組比較,陽性藥物組、固本增骨顆粒高、中劑量組Wnt7b、TCF3表達(dá)量均升高(P<0.05),GSK3β表達(dá)量均下降(P<0.05)。

圖2 固本增骨顆粒對大鼠股骨組織中Wnt7b、TCF3、GSK3β蛋白表達(dá)的影響(×400)

表2 固本增骨顆粒對大鼠股骨組織中Wnt7b、TCF3、GSK3β蛋白表達(dá)的影響

2.3 RT-PCR檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較,模型組Wnt7b mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01),與模型組比較,陽性藥物組和固本增骨顆粒各組Wnt7b mRNA顯著增加(P<0.05),與假手術(shù)組比較,模型組TCF3 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01),與模型組比較,陽性藥物組和固本增骨顆粒高和中劑量組TCF3 mRNA顯著增加(P<0.05),與假手術(shù)組比較,模型組GSK3β mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01),與模型組比較,陽性藥物組和固本增骨顆粒高和中劑量組GSK3β mRNA顯著降低(P<0.01),見表3。

表3 固本增骨顆粒對大鼠股骨組織中Wnt7b、TCF3、GSK3β基因表達(dá)的影響

2.4 各組蛋白表達(dá)檢測結(jié)果

與假手術(shù)組比較,模型組Wnt7b表達(dá)顯著降低(P<0.01),與模型組比較,陽性藥物組和固本增骨顆粒各組Wnt7b顯著增加(P<0.01),與假手術(shù)組比較,模型組TCF3表達(dá)顯著降低(P<0.01),與模型組比較,陽性藥物組和固本增骨顆粒高和中劑量組TCF3顯著增加(P<0.05),與假手術(shù)組比較,模型組GSK3β表達(dá)顯著增加(P<0.01),與模型組比較,陽性藥物組和固本增骨顆粒各組GSK3β顯著降低(P<0.01),見圖3、圖4。

圖3 WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

圖4 固本增骨顆粒對大鼠股骨組織中Wnt7b、TCF3、GSK3β蛋白表達(dá)的影響

3 討論

骨質(zhì)疏松屬于中醫(yī)中“骨痿”的范疇,多為脾腎虛弱。中醫(yī)認(rèn)為腎臟參與骨髓的產(chǎn)生及主導(dǎo)骨骼,這意味著腎臟在骨骼的生長發(fā)育中起著重要作用。因此,臨床治療方法多依靠補(bǔ)腎健脾。

骨重建的基礎(chǔ)在于OB和破骨細(xì)胞(osteoclast,OC)之間動態(tài)平衡的耦聯(lián),以此來維持骨組織礦化平衡和結(jié)構(gòu)的完整性,保證骨組織持續(xù)更新,適應(yīng)身體負(fù)荷情況。骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)生與眾多因素相關(guān)聯(lián),其中包括年齡增長、遺傳因素、生活習(xí)慣以及藥物使用等,主要原因在于去卵巢后的大鼠體內(nèi)雌激素含量減少,成骨細(xì)胞過快消亡,破骨細(xì)胞增多,骨轉(zhuǎn)換率升高,骨吸收超過骨形成,造成骨代謝平衡失調(diào)。

本研究通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀察固本增骨顆粒對去卵巢OP大鼠的治療作用及其可能機(jī)制。HE切片分析顯示,模型組大鼠股骨組織結(jié)構(gòu)變薄、排列稀疏,連續(xù)性中斷,結(jié)構(gòu)不完整,出現(xiàn)多處骨盲端,小梁壁厚度不相等,骨周圍觀察到成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞增殖,表明大鼠去勢后骨免疫微環(huán)境過表達(dá),骨吸收活性增加。使用固本增骨顆粒及雌二醇給藥組大鼠的骨小梁明顯改善修復(fù),防止退變和增強(qiáng)了骨結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,說明固本增骨顆粒作為雌激素樣替代品在改善雌激素缺乏癥狀方面的潛在作用。本實(shí)驗(yàn)RT-PCR和WB結(jié)果顯示,與假手術(shù)組比較,模型組大鼠股骨組織中Wnt7b、TCF3 mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低,表明去卵巢大鼠(OVX大鼠)的成骨潛力降低。藥物治療后,陽性藥物組和固本增骨顆粒各組Wnt7b、TCF3 mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加,證實(shí)固本增骨顆粒促進(jìn)大鼠骨形成。接下來發(fā)現(xiàn)固本增骨顆粒高劑量組和陽性藥物組GSK3βmRNA表達(dá)明顯降低,表明固本增骨顆粒抑制了GSK3β基因的表達(dá),抑制GSK3β的活化,減少骨吸收的發(fā)生。IHC化學(xué)染色檢測大鼠骨組織中Wnt7b、TCF3、GSK3β蛋白的表達(dá),結(jié)果與蛋白質(zhì)印跡一致,這證明固本增骨顆粒促進(jìn)骨形成,因此,筆者認(rèn)為固本增骨顆粒通過上調(diào)Wnt7b、TCF3 mRNA和蛋白表達(dá),下調(diào)GSK3βmRNA和蛋白表達(dá)來發(fā)揮對骨代謝的調(diào)節(jié)作用,促進(jìn)骨形成,抑制GSK3β的活性,協(xié)調(diào)骨穩(wěn)態(tài),從而改善骨結(jié)構(gòu),增加骨量。固本增骨顆粒灌胃處理3個月后能夠明顯改善去卵巢大鼠骨結(jié)構(gòu),其機(jī)制與調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路有關(guān),這為闡明固本增骨顆粒防治骨質(zhì)疏松的原理提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ),同時也為其在臨床中的使用提供強(qiáng)有力的理論支撐。

近年來,補(bǔ)腎中藥調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路治療OP已逐漸成為此領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。通過對藥物調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路治療OP的研究進(jìn)行整理,發(fā)現(xiàn)中藥復(fù)方、活性成分和西藥對Wnt7b、TCF3、GSK3β的作用顯著,部分西藥療效優(yōu)于中藥復(fù)方、活性成分(表4)。由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計、實(shí)驗(yàn)方法、藥物劑量及實(shí)驗(yàn)造模具有差異,故而本文討論部分藥物的干預(yù)效率僅供參考。

表4 藥物對Wnt7b、TCF3、GSK3β的干預(yù)效率

綜上所述,固本增骨顆粒能夠顯著改善去卵巢后骨質(zhì)疏松癥大鼠的病理狀態(tài),提高其骨密度、骨礦物質(zhì)含量及骨生物力學(xué)性質(zhì)。其可能的機(jī)制涉及固本增骨顆粒提高雌激素水平,激活Wnt/β-catenin信號通路,提升Wnt7b和TCF3的表達(dá),抑制GSK-3β的活性,降低β-catenin的分解,使骨生成和骨吸收保持動態(tài)平衡,糾正骨代謝失調(diào),從而改善骨結(jié)構(gòu)。