艾麗皮熱·帕爾哈提 王 琳 蘇看看 張炳峰 穆 原 張世昌 張潔心

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)學(xué)部，江蘇南京 210029

陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）是一種克隆性造血干細(xì)胞疾病[1-4]。該病主要特征有溶血性貧血、骨髓衰竭，血栓形成和外周血細(xì)胞減少[5-8]。患者治療期間需監(jiān)測(cè)肝腎功能、心功能和血糖等，以便準(zhǔn)確評(píng)估臟器損傷，及時(shí)變更用藥方案[9-12]。但PNH 患者的血清標(biāo)本常發(fā)生嚴(yán)重溶血。血生化項(xiàng)目易受溶血影響[13-15]。未經(jīng)溶血校正的檢測(cè)報(bào)告很有可能誤導(dǎo)主診醫(yī)生判斷，造成嚴(yán)重后果。但是目前沒(méi)有可供實(shí)驗(yàn)室參考使用的校正方案。日常工作中部分PNH 患者同時(shí)留取的血漿標(biāo)本并無(wú)溶血現(xiàn)象。由此可知，離心操作時(shí)紅細(xì)胞受惰性分離膠擠壓而破碎引起不同程度溶血。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)首先明確受擠壓式溶血影響顯著的生化項(xiàng)目，再建立血清溶血校正方程和血漿參考區(qū)間，達(dá)到客觀解讀檢驗(yàn)報(bào)告的最終目標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

按美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)文件C28-A3《臨床實(shí)驗(yàn)室如何制定參考區(qū)間》[16]及我國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 402-2012《臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)項(xiàng)目參考區(qū)間制訂》[17]要求，對(duì)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院體檢中心2022年11 月至2023 年4 月的體檢者進(jìn)行篩選，包括年齡、生活習(xí)慣、工作條件等社會(huì)人口基本情況及手術(shù)史，用藥史，全身疾病史[9]。選取健康體檢者共275 名為研究對(duì)象。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（2022-SR-505）。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①年齡18～79 歲；②既往身體健康；③近期未曾大量失血，手術(shù)或服用藥物；④檢驗(yàn)科生化室開展的血生化28 項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果均在正常參考范圍。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①有陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿，血栓形成，骨髓衰竭、泌尿生殖道感染；②有消化系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、高血壓、冠心病、糖尿病、腫瘤等；③有腹痛、靜脈血栓、肺動(dòng)脈高壓、吞咽困難、肝脾腫大等臨床癥狀；④貧血、全血細(xì)胞計(jì)數(shù)減少或紅系伴粒系或血小板計(jì)數(shù)減少、外周血出現(xiàn)幼紅細(xì)胞及嗜多染紅細(xì)胞、尿潛血實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；⑤酸化溶血試驗(yàn)、蔗糖溶血試驗(yàn)、蛇毒因子溶血試驗(yàn)、補(bǔ)體溶血敏感試驗(yàn)和尿含鐵血黃素試驗(yàn)陽(yáng)性；⑥血管內(nèi)溶血，流式檢測(cè)提示血細(xì)胞表面糖基磷脂酰肌醇（glycosyl phosphatidyl inositol，GPI）錨連蛋白缺陷，鐵缺乏，含鐵血黃素尿；⑦有營(yíng)養(yǎng)不良，有素食、酗酒、嗜煙等習(xí)慣；⑧處于妊娠期或哺乳期的婦女；⑨檢驗(yàn)科生化室開展的血生化28 項(xiàng)中一項(xiàng)及以上檢測(cè)結(jié)果超過(guò)正常參考范圍。

1.4 血標(biāo)本采集和檢測(cè)

①納入25 名健康體檢者。各收集1 份EDTA-K2抗凝管靜脈血，3 000 r/min，離心半徑22.8 cm，離心10 min 分離紅細(xì)胞；同時(shí)收集2 份黃色促凝管靜脈血，3 000 r/min，離心半徑22.8 cm，離心10 min 分離血清。PBS 清洗紅細(xì)胞2 次。各體檢者血清重懸自身紅細(xì)胞，使用頭皮針?lè)磸?fù)吹打致紅細(xì)胞破碎，得到梯度模擬溶血液。未溶血血清和模擬溶血液分別檢測(cè)溶血指數(shù)及生化28 項(xiàng)，記錄結(jié)果。②納入250 名健康體檢者。各收集1 份肝素鋰抗凝管靜脈血和1 份黃色促凝管靜脈血。3 000 r/min，離心半徑22.8 cm，離心10 min分離肝素鋰抗凝管血漿；3 000 r/min，離心半徑22.8 cm，離心10 min 分離黃色促凝管血清。分別檢測(cè)多個(gè)血生化項(xiàng)目，記錄結(jié)果。所有血標(biāo)本均無(wú)溶血、黃疸和脂濁。

1.5 儀器與試劑

總膽紅素（total bilirubin，TBil）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBil）和肌酐（creatinine，CREA）試劑購(gòu)自上海科華生物工程股份有限公司，批號(hào)分別為TBil（20210722）、DBil（20210712）和CREA（20210812）。脂蛋白a 試劑購(gòu)自日本株式會(huì)社島研究所，批號(hào)為UJ22。視黃醇結(jié)合蛋白試劑購(gòu)自南京諾爾曼生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為21112611。腺苷脫氨酶試劑購(gòu)自浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司，批號(hào)為2021040027。其余試劑購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司，批號(hào)分別為丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（8891）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST；0264）、堿性磷酸酶（9816）、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（glutamyl transpeptidase，GGT；9725）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH；9735）、肌酸激酶（creatine kinase，CK；9861）、α-羥丁酸脫氫酶（α-hydroxybutyrate dehydrogenase，α-HBDH；9852）、總蛋白（total protein，TP；0008）、白蛋白（9771）、糖（8808）、尿素（urea，UR；0450）、尿酸（9708）、鈣（8516）、磷（phosphorus，Phos；9175）、鎂（9116）、鉀離子（potassium，K+；9043）、鈉（9043）、氯（9043）、總膽固醇（total cholesterol，TC；8562）、甘油三酯（0161）、高密度脂蛋白膽固醇（9751）和低密度脂蛋白膽固醇（0385）。使用美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（蘇州）有限公司AU5800全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)溶血指數(shù)及生化項(xiàng)目，反應(yīng)參數(shù)參照儀器配套的操作說(shuō)明書設(shè)置。

1.6 建立血清溶血校正方程

將每份模擬血溶液按溶血指數(shù)分組，即血紅蛋白濃度50～99 mg/dl時(shí)溶血指數(shù)為1+；血紅蛋白濃度100～199 mg/dl 時(shí)溶血指數(shù)為2+；血紅蛋白濃度200～299 mg/dl 時(shí)溶血指數(shù)為3+。分別計(jì)算28 項(xiàng)生化項(xiàng)目實(shí)測(cè)值與原始值間的偏倚，即溶血檢測(cè)偏倚（hemolysis bias，BH）=（實(shí)測(cè)值-原始值）/原始值。分別計(jì)算每個(gè)項(xiàng)目各組BH的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。以溶血指數(shù)為橫坐標(biāo)，BH均值為縱坐標(biāo)作圖，得到每個(gè)項(xiàng)目的血清溶血校正方程。

1.7 建立血漿參考區(qū)間

分別計(jì)算每個(gè)體檢者各生化項(xiàng)目血漿檢測(cè)值與血清檢測(cè)值的偏倚，即血清檢測(cè)偏倚（serum bias，BS）=（血漿檢測(cè)值-血清檢測(cè)值）/血清檢測(cè)值。將各生化項(xiàng)目BS均值與2019 年WESTGARD QC（https：//www.westgard.com/biodatabase1.htm）中規(guī)定偏倚相比較，確定需建立血漿參考區(qū)間的項(xiàng)目。若數(shù)據(jù)呈高斯正態(tài)分布，用（x±1.96 s）表示95%數(shù)據(jù)分布范圍；若是數(shù)據(jù)不呈高斯正態(tài)分布，則單側(cè)采用P5 的下限或P95 的上限，以此確定檢驗(yàn)項(xiàng)目的血漿參考區(qū)間。

參考區(qū)間的變異主要由個(gè)體內(nèi)生物學(xué)變異（within-subject variation，CVI）和個(gè)體間生物學(xué)變異（between-subject variation，CVG）決定，兩者共同組成了人群生物學(xué)變異。而分析偏倚（analysis bias，BA）的存在會(huì)引起人群的錯(cuò)誤劃分，適當(dāng)BA應(yīng)為，最低BA應(yīng)為[18]。將250 例體檢者的血漿、血清標(biāo)本分別檢測(cè)上述受擠壓式溶血影響較大的11 個(gè)生化項(xiàng)目，逐一比較血漿結(jié)果與血清結(jié)果間的差異，判斷是否需要建立血漿參考區(qū)間。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用四分位間距法剔除均值±1.5 倍四分位間距之外的離群數(shù)值。采用假設(shè)檢驗(yàn)方法分析數(shù)據(jù)分布情況。采用Microsoft Excel 軟件錄入數(shù)據(jù)和繪制趨勢(shì)線。

2 結(jié)果

2.1 成功建立8 個(gè)項(xiàng)目的血清溶血校正方程

按溶血指數(shù)將模擬溶血液分成三組，分別是溶血指數(shù)1+組含26 份模擬溶血液，溶血指數(shù)2+組含41份模擬溶血液和溶血指數(shù)3+組含30 份模擬溶血液。將上述各模擬溶血液進(jìn)行28 個(gè)生化項(xiàng)目檢測(cè)，計(jì)算得到每個(gè)項(xiàng)目各組BH的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。其中，AST、GGT、LDH、CK、α-HBDH、TC、TP、UR、CREA、Phos 和K+共11 個(gè)項(xiàng)目受溶血影響較大，見表1。其中8個(gè)項(xiàng)目可建立溶血校正方程，所得R2均＞0.90。見圖1。

圖1 8 個(gè)生化項(xiàng)目的血清溶血校正方程及特征參數(shù)

表1 11 個(gè)血生化項(xiàng)目的BH 均值和標(biāo)準(zhǔn)差（n=30）

2.2 成功建立5 個(gè)項(xiàng)目的血漿參考區(qū)間

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，剔除離群40例，納入210 例，其中男110 例，女100 例，男性年齡17～73 歲，女性年齡16～79 歲。AST 項(xiàng)目的BS超過(guò)規(guī)定適當(dāng)BA，LDH、TP、Phos 和K+4 個(gè)項(xiàng)目的BS超過(guò)規(guī)定最低BA，因此需建立這5 個(gè)生化項(xiàng)目的血漿參考區(qū)間。5個(gè)項(xiàng)目的血漿檢測(cè)結(jié)果均符合正態(tài)分布，根據(jù)x±1.96 s 可得對(duì)應(yīng)血漿參考區(qū)間。AST 血漿參考區(qū)間為（21.9±10.5）U/L，LDH為（166±58）U/L，TP 為（71.3±10.8）g/L，Phos 為（1.14±0.37）mmol/L，K+為（3.66±0.61）mmol/L。見表2。

表2 5 個(gè)血生化項(xiàng)目的規(guī)定BA 和BS 的比較（%）

3 討論

PNH 患者X 染色體上的磷脂酰肌醇聚糖-A 類基因發(fā)生突變，使其血細(xì)胞表面的兩種GPI 錨連蛋白CD55 和CD59 缺失，導(dǎo)致血細(xì)胞破壞溶解[19-25]。處于PNH 發(fā)病期患者的血生化項(xiàng)目如AST、LDH 和α-HBDH 的檢測(cè)結(jié)果常遠(yuǎn)高于參考區(qū)間上限。更值得注意的是，患者血清K+多為危急值（＞6 mmol/L）。但部分患者表示僅有體力欠佳和運(yùn)動(dòng)后心慌表現(xiàn)。因此，發(fā)生溶血的血清生化檢測(cè)結(jié)果與患者實(shí)際情況不符，不具有臨床參考意義。對(duì)于受擠壓式溶血影響較大血生化項(xiàng)目的檢測(cè)，本研究通過(guò)建立血清溶血校正方程和血漿參考區(qū)間，向臨床提供兩種實(shí)驗(yàn)室處理路徑：①優(yōu)先使用肝素鋰抗凝管留取患者血標(biāo)本進(jìn)行血漿生化項(xiàng)目檢測(cè)；②對(duì)于已發(fā)生溶血的血清標(biāo)本，使用血清溶血校正方程進(jìn)行處理。本研究結(jié)果填補(bǔ)了PNH血生化項(xiàng)目檢測(cè)方面的空白，為PNH 檢驗(yàn)流程進(jìn)一步優(yōu)化提供必要依據(jù)，服務(wù)臨床，造?；颊摺?/p>

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。