郭喜平 王旭昀 盧冬冬 俎亞杰 張耀圣

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院泌尿外科，北京 100700；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院男科，北京 100010；3.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，天津 300192

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是由腺體和基質(zhì)成分的細(xì)胞增生引起的前列腺非惡性腫大[1]。本病是中老年男性常見(jiàn)病、多發(fā)病，且社會(huì)年齡構(gòu)成逐漸偏向老齡化，生活、飲食、環(huán)境等的改變，其相應(yīng)的發(fā)病率和患病率也在迅速增加[2]。目前BPH 的發(fā)病機(jī)制包括生長(zhǎng)因子學(xué)說(shuō)、上皮-間質(zhì)細(xì)胞相互作用學(xué)說(shuō)、激素內(nèi)分泌學(xué)說(shuō)和最終細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)等[3]。隨著對(duì)BPH 研究的不斷深入，臨床觀察發(fā)現(xiàn)BPH 和高脂血癥（hyperlipidemia，HLP）往往相伴而生，HLP 是BPH 發(fā)病中重要一環(huán)[4-5]。臨床中發(fā)現(xiàn)HLP 組發(fā)生BPH 的風(fēng)險(xiǎn)顯著高于非高脂血癥組[6]。BPH 患者隨著HLP 病程延長(zhǎng)、病情加重，其癥狀也隨之加重。目前BPH 與HLP 二者關(guān)系多基于臨床研究推測(cè)[7-8]。本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建HLP 大鼠前列腺增生模型，檢測(cè)血清中血脂四項(xiàng)、炎癥因子指標(biāo)及前列腺組織病理情況，探討高脂血癥大鼠前列腺增生病理狀態(tài)，為二者關(guān)系研究提供實(shí)驗(yàn)方面理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼料

3 月齡健康SPF 級(jí)SD 雄性大鼠20 只（體重180～200 g），購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物合格證編號(hào)：110322230100713841。動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2019-0008。醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理批準(zhǔn)文號(hào)：MDL2023-03-10-02。普通飼料由康泰醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)服務(wù)河北有限公司提供。高脂飼料為自制（飼料組成：普通飼料63%，豬油20%，蛋黃5%，膽固醇2%）[9]。

1.2 主要儀器及試劑

儀器：離心機(jī)（品牌：恒諾儀器，貨號(hào)：2-16R）；石蠟病理切片機(jī)（品牌：Leica，型號(hào)：RM2235）；全自動(dòng)生化分析儀（品牌：新銳，型號(hào)：XR220 Plus）。試劑：血清瘦素（leptin，LEP）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6、IL-8、前列腺特異性抗原（prostate specific antigen，PSA）ELISA 試劑盒（品牌：CLOUD-CLONE CORP，貨號(hào)：SEA019Ra）。

1.3 分組及造模方法

20 只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組10 只、實(shí)驗(yàn)組10 只。對(duì)照組每日予以普通飼料喂養(yǎng)，共10周。實(shí)驗(yàn)組每日予自制高脂飼料喂養(yǎng)持續(xù)10 周。10 周后采集大鼠腹主動(dòng)脈血檢驗(yàn)HLP 造模是否成功。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組大鼠血漿中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein，LDL-C）水平升高，高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein，HDL-C）水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示大鼠HLP 模型制備成功[9-10]。

1.4 檢測(cè)標(biāo)本采集與處理

大鼠造模10 周結(jié)束后，進(jìn)行標(biāo)本采集，所有大鼠采集標(biāo)本前禁食不禁水12 h，兩組大鼠腹腔麻醉，待麻醉成功后，取仰臥位，打開(kāi)腹腔，充分暴露其腹主動(dòng)脈，用一次性采血針在腹主動(dòng)脈分叉處與血管平行插入，接入真空抗凝管采集血液標(biāo)本，靜置15 min 后，4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，離心半徑6.0 cm，取血清分裝，于-80 ℃冰箱保存。取大鼠前列腺，稱重，大鼠前列腺用預(yù)冷PBS 液在玻璃培養(yǎng)皿中清洗，然后放入4%PBS 中，用于做蘇木精-伊紅染色及病理檢測(cè)。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 體重及前列腺濕重 實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行1 周適應(yīng)性喂養(yǎng)后進(jìn)行初次體重測(cè)量，根據(jù)初次體重結(jié)果采取隨機(jī)數(shù)字表法分組，分為實(shí)驗(yàn)組10 只，對(duì)照組10只。之后每周測(cè)量大鼠體重1 次，為減少誤差，保證后續(xù)測(cè)體重時(shí)間與初次測(cè)體質(zhì)量時(shí)間均為上午8∶00 至9∶00 大鼠未進(jìn)食之前；取材前最后一次對(duì)大鼠重量進(jìn)行測(cè)量。大鼠麻醉成功后，剖腹，充分游離前列腺，取出后以吸水紙吸干水分，立即稱重并記錄。

1.5.2 血脂四項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定 TG、TC 采用氧化酶偶聯(lián)比色終點(diǎn)法檢測(cè)，HDL-C、LDL-C 采用消除法檢測(cè)。

1.5.3 炎癥因子指標(biāo)ELISA 檢測(cè) 大鼠腹主動(dòng)脈采血后于-80 ℃冰箱保存。檢測(cè)時(shí)從4℃冰箱取出試劑盒，在室溫（18～25 ℃）平衡后使用。按照對(duì)應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中LEP、PSA、IL-6、IL-8 水平。

1.5.4 前列腺組織病理檢測(cè) 大鼠前列腺組織取出后，用預(yù)冷PBS 液在玻璃培養(yǎng)皿中清洗，然后放入4%PBS 中24 h，在梯度乙醇中進(jìn)行脫水，石蠟包埋機(jī)包埋，用組織切片機(jī)切成4 μm 的薄片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況、血脂四項(xiàng)及成模率情況

實(shí)驗(yàn)組10 只大鼠造模過(guò)程中出現(xiàn)進(jìn)食減少、活動(dòng)量減少、活躍度較前降低、毛發(fā)光澤變淡等現(xiàn)象；對(duì)照組10 只大鼠造模全程進(jìn)食、活動(dòng)量、活躍度、毛發(fā)光澤程度正常。造模結(jié)束后檢測(cè)20 只大鼠血脂四項(xiàng)，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組TC、TG、LDL-C高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組HDL-C 低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組10 只大鼠高脂血癥模型造模成功，成模率為100%。見(jiàn)表1。

表1 兩組TC、TG、HDL-C、LDL-C 比較（U/L，）

表1 兩組TC、TG、HDL-C、LDL-C 比較（U/L，）

注TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇。

2.2 兩組體重、前列腺濕重、前列腺指數(shù)比較

實(shí)驗(yàn)組體重低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組前列腺濕重、前列腺指數(shù)高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組體重、前列腺濕重、前列腺指數(shù)比較（）

表2 兩組體重、前列腺濕重、前列腺指數(shù)比較（）

2.3 兩組LEP、IL-6、IL-8、PSA 比較

實(shí)驗(yàn)組LEP、IL-6、IL-8、PSA 高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 兩組LEP、IL-6、IL-8、PSA 比較（）

表3 兩組LEP、IL-6、IL-8、PSA 比較（）

注LEP：瘦素；IL：白細(xì)胞介素；PSA：前列腺特異性抗原。

2.4 前列腺病理

蘇木精-伊紅染色顯示：對(duì)照組前列腺組織腺泡形態(tài)規(guī)則，被覆單層上皮細(xì)胞，腔內(nèi)有均勻的嗜酸分泌物，無(wú)空泡形成，少量腺上皮呈乳頭狀向腺腔內(nèi)突出，間質(zhì)緊密，血管擴(kuò)張不明顯。見(jiàn)圖1。實(shí)驗(yàn)組腺泡不規(guī)則，大部分腺泡上皮顯著增生，呈復(fù)層或假?gòu)?fù)層上皮細(xì)胞，腔內(nèi)分泌物減少，大量腺上皮呈乳頭狀向腺腔內(nèi)突出，部分腺泡可見(jiàn)大量脫離上皮，間質(zhì)增多，血管擴(kuò)張，間質(zhì)局部大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖2。

圖1 大鼠前列腺組織圖片（100×）

圖2 大鼠前列腺組織蘇木精-伊紅染色結(jié)果（100×）

3 討論

到目前為止，BPH 的病因及發(fā)病機(jī)制包括多種學(xué)說(shuō)，但包括炎癥信號(hào)傳導(dǎo)學(xué)說(shuō)等，任意一種學(xué)說(shuō)均不能獨(dú)立解釋BPH 的發(fā)病機(jī)制。BPH 與HLP 常伴隨出現(xiàn)，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)HLP 可能是BPH 的病因?qū)W之一，且相互影響[11]。既往國(guó)內(nèi)外研究者大多從臨床角度研究HLP 與前列腺增生之間關(guān)系，從血脂代謝與前列腺增生關(guān)系，或血脂指標(biāo)與前列腺體積之間關(guān)系推測(cè)二者聯(lián)系，發(fā)現(xiàn)HLP 與BPH 關(guān)系密切[7-8，12]。也有資料顯示，動(dòng)物蛋白、脂肪的攝入量增加和BPH 的發(fā)生有關(guān)，是BPH 發(fā)生危險(xiǎn)因素[13-15]。大量調(diào)查資料顯示高脂肪、高熱量飲食與BPH 發(fā)病率之間呈正相關(guān)[16-18]。食物中的脂肪酸也在一定程度上影響著前列腺組織的生長(zhǎng)[19]。本研究從實(shí)驗(yàn)角度出發(fā)，應(yīng)用高脂飼料構(gòu)建HLP 大鼠前列腺增生模型，檢測(cè)大鼠血脂、LEP、IL-6、IL-8、前列腺病理，探討大鼠發(fā)生HLP 時(shí)前列腺增生病理狀態(tài)。

前列腺濕重、PSA、前列腺組織病理檢測(cè)為判斷前列腺是否增生常用重要指標(biāo)。PSA 是一種分子量為33 kD 的雄性激素調(diào)節(jié)絲氨酸蛋白酶，由前列腺上皮及尿道旁腺生成，以酶原（proPSA）形式貯存在前列腺腺管中。Stamey 等[20]認(rèn)為PSA 低于9 ng/ml 時(shí)，BPH 是導(dǎo)致PSA 升高的主要因素之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組大鼠前列腺濕重、前列腺指數(shù)、PSA 比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組前列腺組織病理結(jié)果顯示，大部分腺泡上皮顯著增生，呈復(fù)層或假?gòu)?fù)層上皮細(xì)胞，大量腺上皮呈乳頭狀向腺腔內(nèi)突出，以上結(jié)果綜合顯示HLP 大鼠前列腺增生模型構(gòu)建成功。

本實(shí)驗(yàn)造模時(shí)間及高脂飼料組成及干預(yù)方式參照既往實(shí)驗(yàn)[21-23]。既往實(shí)驗(yàn)用高脂飲食誘導(dǎo)前列腺增生造模時(shí)間多為8 周[24]；誘導(dǎo)方式亦多為喂養(yǎng)方式，亦有高脂肪乳灌胃方式?？紤]到成模時(shí)間及成模率等問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)造模方式為高脂飼料喂養(yǎng)10 周。在造模過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組高脂飼料喂養(yǎng)后出現(xiàn)進(jìn)食減少，體重增長(zhǎng)不明顯等現(xiàn)象，造模結(jié)果也顯示，實(shí)驗(yàn)組體重低于對(duì)照組，還需關(guān)注高脂飼料喂養(yǎng)模式可能會(huì)導(dǎo)致大鼠前列腺濕重、前列腺指數(shù)出現(xiàn)較大差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，高脂飼料誘導(dǎo)的大鼠TG 及LDL-C 升高不明顯。由此啟發(fā)，在進(jìn)行高脂飼料誘導(dǎo)前列腺增生造模時(shí)可以采取多種方式進(jìn)行改進(jìn)，例如改進(jìn)高脂飼料各成分比例，將飼養(yǎng)方式改為高脂肪乳灌胃，降低因進(jìn)食量不同多帶來(lái)的個(gè)體差異、提高高脂血癥成模率、縮短造模時(shí)間、以更接近人類脂質(zhì)代謝途徑[25]。值得注意的是，通過(guò)高脂肪乳灌胃誘導(dǎo)HLP 造模時(shí)間多為1～2 周，考慮到高脂飼料誘導(dǎo)前列腺增生成模時(shí)間及成模率等問(wèn)題，可適當(dāng)延長(zhǎng)高脂肪乳劑灌胃時(shí)間[25]。

慢性炎癥在促進(jìn)前列腺增生發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，HLP 其中重要病理狀態(tài)為L(zhǎng)EP 水平升高，高LEP 可導(dǎo)致促進(jìn)炎癥因子分泌產(chǎn)生致炎作用[26-27]。致炎作用導(dǎo)致機(jī)體處于全身性的慢性低度炎癥狀態(tài)，這種炎癥狀態(tài)誘導(dǎo)促炎因子分泌，包括IL-6、IL-8 等。IL-6 在感染和損傷時(shí)產(chǎn)生[28]；IL-8 參與炎癥反應(yīng)諸多環(huán)節(jié)，其檢測(cè)水平升高是BPH 發(fā)生、發(fā)展的重要預(yù)測(cè)因子[29]。前列腺增生及HLP 二者共有的炎癥狀態(tài)提示HLP 誘導(dǎo)的前列腺增生可能機(jī)制之一為炎癥反應(yīng)，因此將LEP、IL-6、IL-8 作為測(cè)試指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，實(shí)驗(yàn)組LEP、IL-6、IL-8 高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

此外實(shí)驗(yàn)組腺泡形態(tài)不規(guī)則、大部分腺泡上皮顯著增生，腔內(nèi)分泌物減少，大量腺上皮呈乳頭狀向腺腔內(nèi)突出，間質(zhì)增多，間質(zhì)局部大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，這也提示經(jīng)高脂飼料誘導(dǎo)后前列腺組織局部發(fā)生炎癥反應(yīng)。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。