李 震 郝恩剛 劉丹青

1.山東省聊城市第二人民醫(yī)院檢驗科，山東臨清 252600；2.山東省聊城市第二人民醫(yī)院心內(nèi)科，山東臨清 252600；3.山東省臨清市人民醫(yī)院檢驗科，山東臨清 252600

冠心?。╟oronary heart disease，CHD）是心血管系統(tǒng)常見疾病，近年來CHD 發(fā)病率在全球范圍內(nèi)上升，已成為我國乃至全球人類死亡的最常見因素之一[1-3]。冠狀動脈狹窄（coronary artery stenosis，CAS）程度對CHD 患者選擇最佳治療方案至關重要，并與心血管風險分層密切相關[4]。因此，需要一個潛在而有效的生物標志物來評估CHD 患者的CAS 程度。研究表明，動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）參與CHD 發(fā)生、發(fā)展[5]。微RNA（microRNA，miRNA）是一種長度為19～24 個核苷酸的單鏈非編碼RNA，能通過調(diào)控多種機制參與CHD 過程[6]。miR-296 被報道在CHD 個體中差異表達[7]。過表達miR-296 能促進心肌細胞增殖，改善心肌梗死后心功能[8]。血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管生成的重要介質(zhì)，能通過炎癥反應促進AS 發(fā)生、發(fā)展[9]。但有關miR-296、VEGF-B 與CHD 患者CAS 程度的相關性報道有限。本研究分析CHD 患者miR-296、VEGF-B表達與CAS 的關系，以期為CHD 診治提供一定參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年1 月至2022 年11 月山東省聊城市第二人民醫(yī)院收治的93 例CHD 患者，其中，女40例，男53 例；年齡42～73 歲，平均（56.71±6.50）歲；體重指數(shù)18.71～31.49 kg/m2，平均（23.94±2.63）kg/m2。納入標準：①符合《臨床冠心病診斷與治療指南》[10]CHD診斷標準；②初次確診，入院前未接受相關治療。排除標準：①冠狀動脈造影禁忌證；②既往冠狀動脈介入治療史；③先天性心臟??；④妊娠期或哺乳期；⑤合并其他心肌??；⑥血液、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)疾病，惡性腫瘤；⑦嚴重肝、腎功能障礙；⑧近1 個月內(nèi)急慢性感染。本研究經(jīng)山東省聊城市第二人民醫(yī)院倫理委員會批準（【2023】醫(yī)倫審第（04）號）。

1.2 研究方法

1.2.1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,Rt-PCR） 采集CHD 組空腹靜脈血6 ml，其中3 ml 血液抗凝后使用TRIzol 試劑（賽默飛世爾科技公司，編號：15596018CN）提取全血總RNA，TaKaRa PrimeScrip RT 試劑盒[寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司，編號：RR037A]合成cDNA。按照Cham QTMunivers SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司，編號：Q111-02）說明書進行RT-PCR。反應體系：互補DNA 1 μl、2×HieffRobust PCR Master Mix 10 μl、正反向引物各2.5μl，ddH2O 加至總體積25 μl；反應條件：95 ℃90 s、95 ℃30 s、63 ℃30 s、72 ℃15 s，循環(huán)40 次后收集Ct 值，miR-296 以U6 為內(nèi)參校正，2-ΔΔCt法計算miR-296相對表達量。miR-296：正向引物：5’-GGGGGGGAGGCCCCGA-3’，反向引物：5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’；U6：正向引物：5’-ACACGCACAAACGAGAAAGG-3’，反向引物：5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’。剩余3 ml 血液1 500 g 離心15 min 分離血清，保存于-80 ℃冰箱。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒（上海烜雅生物科技有限公司，編號：XY0196A）檢測VEGF-B 水平。

1.2.2 結合位點預測與雙螢光素酶報告實驗 經(jīng)Star-Base、TargetScan、miRWalk 數(shù)據(jù)庫預測miR-296 與VEGF-B 的結合位點。構建野生型miR-296（miR-296-wild type，miR-296-wt）、野生型VEGF-B（VEGF-B-wild type，VEGF-B-wt）和突變型miR-296（miR-296-mutant，miR-296-mut）、突變型VEGF-B（VEGF-B-mutant，VEGF-B-mut）螢光素酶載體，接下來將載體共轉染至H9C2 細胞中。轉染48 h 后使用雙螢光素酶測定法測定螢光素酶活性。

1.2.3 冠狀動脈造影 所有研究對象入院后均進行冠狀動脈造影（荷蘭飛利浦血管造影機，型號：FD20），記錄病變支數(shù)，參考Gensini 積分評估CAS 程度，每處冠脈病變積分為狹窄程度[狹窄直徑＜25%（1 分）、25%～＜50%（2 分）、50%～＜75%（4 分）、75%～＜90%（8 分）、90%～＜99%（16 分）、≥99%（32分）]×冠脈分支（右冠近、中、遠段和后降支均×1；后側支×0.5；遠段和后降支×1；左回旋支近段×2.5；第一對角支×1；第二對角支×0.5），總分為所有病變積分之和[11]。由2 名專業(yè)造影診斷醫(yī)生獨立評分，取一致結果。根據(jù)病變支數(shù)將CHD 患者分為單支病變組38 例、雙支病變組33 例、多支病變組22 例。根據(jù)Gensini 積分將CHD 患者分為輕度CAS 組（＜30 分，30 例）、中度CAS 組（31～60 分，34 例）、重度CAS 組（＞60 分，29例）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 28.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料符合正態(tài)分布采用均數(shù)±標準差（）表示，兩組比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較LSD-t 檢驗，計量資料不符合正態(tài)分布采用中位數(shù)（四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，比較采用非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗。相關性采用Pearson 相關系數(shù)或Spearman 相關系數(shù)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同CAS 程度CHD 患者臨床基線特征比較

不同CAS 程度CHD 患者臨床基線特征比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 不同CAS 程度CHD 患者臨床基線特征比較

2.2 不同冠狀動脈病變支數(shù)CHD 患者臨床基線特征比較

不同冠狀動脈病變支數(shù)CHD 患者臨床基線特征比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 不同冠狀動脈病變支數(shù)CHD 患者臨床基線特征比較

2.3 不同CAS 程度CHD 患者miR-296、VEGF-B 表達比較

重度組miR-296 表達低于輕度組和中度組，VEGF-B 水平高于輕度組和中度組，且中度組miR-296 表達低于輕度組，VEGF-B 水平高于輕度組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 不同CAS 程度CHD 患者miR-296、VEGF-B 表達比較

2.4 不同冠狀動脈病變支數(shù)CHD 患者血miR-296、VEGF-B 表達比較

多支病變組miR-296 表達低于單支病變組和雙支病變組，VEGF-B 水平高于單支病變組和雙支病變組，且雙支病變組miR-296 表達低于單支病變組，VEGF-B水平高于單支病變組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 不同冠狀動脈病變支數(shù)CHD 患者miR-296、VEGF-B 表達比較

2.5 CHD 患者miR-296、VEGF-B 表達與Gensini 積分的相關性

miR-296與VEGF-B存在結合位點（圖1）。與VEGFB-wt 和mir-NC 共轉染至H9C2 細胞比較，VEGFB-wt 和miR-296 共轉染至H9C2 細胞的螢光素酶活性降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。但VEGF-Bwt 和miR-296 共轉染至H9C2 細胞的螢光素酶活性與VEGF-B-wt 和miR-NC 共轉染至H9C2 細胞比較無下降，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖2）。Pearson相關性分析顯示，CHD 患者miR-296 與VEGF-B 表達呈負相關（r=-0.731，P＜0.001）。Spearman 相關性分析顯示，CHD 患者miR-296 表達與Gensini 積分及病變支數(shù)呈負相關（rs=-0.719、0.638，P＜0.001），VEGF-B表達與Gensini 積分及病變支數(shù)呈正相關（rs=0.727、0.698，P＜0.001）。

圖1 miR-296 與VEGF-B 的結合位點圖

圖2 miR-296、VEGF-B 的熒光素酶活性

3 討論

CHD 的特征是在病變的血管中形成的阻塞的富含脂質(zhì)的斑塊可導致血管腔狹窄或阻塞，導致包括心絞痛和心肌梗死在內(nèi)的缺血性心臟疾病[12-13]。雖然近年來隨著區(qū)域協(xié)同救治體系的逐漸完善，以及藥物與非藥物治療手段不斷進展，CHD 患者殘疾和死亡風險大幅度較低，但CHD 患者總體預后仍然較差[4，14]。因此早期準確評估CHD 患者CAS 程度，對選擇合理的治療方案和改善患者預后具有重要意義。

AS 是CHD 發(fā)生、發(fā)展的病理基礎，其病理生理過程涉及血脂代謝紊亂、炎癥反應、氧化應激、血管內(nèi)皮損害等多種機制[5]。miRNA 能通過引發(fā)信使核糖核酸的降解或轉錄后的基因沉默，通過調(diào)節(jié)血脂代謝、炎癥反應、氧化應激、血管內(nèi)皮損害等機制參與AS發(fā)生、發(fā)展[15]。miR-296 定位于人染色體20q13.32，研究報道，下調(diào)miR-296 能靶向基質(zhì)金屬蛋白酶15 抑制類風濕關節(jié)炎大鼠炎癥反應[16]；Pan 等[17]研究報道，敲低miR-296 能靶向S100 鈣結合蛋白A4 抑制深靜脈血栓形成小鼠氧化應激，促進血栓形成。下調(diào)miR-296 能靶向缺口受體1 加重中動脈閉塞大鼠血管內(nèi)皮損傷[18]。重要的是Dai 等[19]研究指出，miR-296降低是冠狀動脈疾病患者行經(jīng)皮冠狀動脈介入治療后支架內(nèi)再狹窄的獨立危險因素?；诖?，筆者推測miR-296 可能參與AS 過程。本研究結果顯示，CHD患者血miR-296 表達降低，這與Miao 等[7]報道結果相符。結果還顯示，CHD 患者miR-296 表達隨著CAS程度加重和病變支數(shù)增加而降低，說明miR-296 低表達與CHD 患者CAS 加重密切相關，分析原因可能是miR-296 低表達可能導致炎癥反應、氧化應激、血管內(nèi)皮損害，促進AS 發(fā)展，進而加重CAS。實驗也報道，上調(diào)miR-296 能抑制血管內(nèi)皮損傷，進而抑制AS發(fā)生、發(fā)展[20]。

VEGF 是血管內(nèi)皮特異性生長因子，在炎癥反應等損傷血管內(nèi)皮細胞時被大量釋放，同時VEGF 也能結合VEGF 受體激活核因子κB 信號通路促進炎癥反應，導致血管內(nèi)皮損傷加重[21]。VEGF-B 是VEGF 家族重要成員，主要表達于冠狀動脈內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和心肌等心血管系統(tǒng)，不僅能結合VEGF 受體1 發(fā)揮作用，還能與VEGF-A 協(xié)同作用，共同加重血管內(nèi)皮損害，促進AS 發(fā)生、發(fā)展[22-23]。近年來多項試驗均表明，抑制VEGF 能改善血管內(nèi)皮損傷，抑制AS進展[24-25]。本研究結果顯示，CHD 患者血清VEGF-B表達上調(diào)，并隨著CAS 程度加重和病變支數(shù)增加而升高，提示VEGF-B 高表達與CHD 患者CAS 加重密切相關，分析原因可能是VEGF-B 高表達反映血管內(nèi)皮損傷加重，導致AS 持續(xù)進展，進而導致CAS 加重[24]。既往有研究報道，miR-296 高表達能下調(diào)VEGF，減少肝細胞癌淋巴管生成[26]；miR-296-5p 表達增強可降低糖尿病視網(wǎng)膜病變小鼠VEGF 表達[27]。本研究通過數(shù)據(jù)庫預測發(fā)現(xiàn)，miR-296 與VEGF-B 存在結合位點，進一步研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-B 是miR-296 的靶點，且二者在CHD 患者血清中表達呈負相關，提示miR-296與VEGF-B 可能共同影響CHD 患者CAS 程度。因此筆者推測miR-296 表達下調(diào)可能引起VEGF-B 表達上調(diào)，通過炎癥反應、氧化應激等引起血管內(nèi)皮損傷，導致CAS 加重。

綜上所述，CHD 患者血miR-296 表達降低，VEGF-B 升高，二者可能共同影響CAS 病變程度。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。