朱衛(wèi) 曾婷婷

潰瘍性結(jié)腸炎是一種慢性結(jié)腸炎,臨床出現(xiàn)反復(fù)癥狀,還會出現(xiàn)腹痛、腹瀉和大便內(nèi)或表面黏液,并夾雜血液[1]。研究證實(shí),潰瘍性結(jié)腸炎與腸炎系列結(jié)直腸癌之間相互聯(lián)系,持續(xù)的炎性刺激會導(dǎo)致出現(xiàn)黏膜發(fā)生慢性炎性反應(yīng),連續(xù)損傷腸道黏膜,最后使癌變發(fā)生[2]。隨著潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病率的逐漸升高,炎癥性腸病惡化癌變腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌及患者死亡風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[3]。巨噬細(xì)胞具有可塑性和異質(zhì)性,可極化能分泌有利于炎癥免疫調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞以及能分泌抗炎因子巨噬細(xì)胞[4]。通常情況下,巨噬細(xì)胞分泌促炎細(xì)胞因子,主要對應(yīng)宿主防御、病毒等和腫瘤免疫反應(yīng);巨噬細(xì)胞主要有抗炎作用,介導(dǎo)調(diào)節(jié)黏膜損傷修復(fù)以及纖維化病變[5]。miRNA是一類非編碼RNA,對免疫細(xì)胞的發(fā)育凋亡、以至炎癥及腫瘤相關(guān)疾病都有重要作用[6]。有研究證明,miRNA參與了腫瘤生長等過程[7]。miRNA已逐漸成為多種診斷癌癥和識別患有相關(guān)疾病發(fā)生臨床事件、疾病復(fù)發(fā)和進(jìn)展的生物標(biāo)準(zhǔn)分子,在多種惡性腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展中均為異常,與結(jié)直腸癌等多種癌癥疾病關(guān)系密切。miRNA能夠明顯改善潰瘍性結(jié)腸炎小鼠的炎癥環(huán)境,減少結(jié)腸炎性細(xì)胞浸潤和充血水腫,改善結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)損傷。基于此,本研究探討并分析miRNA調(diào)控claudin-2表達(dá)對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠巨噬細(xì)胞極化機(jī)制分析。

1 材料與方法

1.1 材料 選取SPF級BALB/c雌性小鼠60只,體重20～22 g,由上海美迪西生物醫(yī)藥股份有限公司提供,動物許可證:SYXK(滬)2020-0038。在相對濕度為45%～55%、飼養(yǎng)溫度為(23.5±1.3)℃條件下喂養(yǎng),光照12 h/d,動物自由食用標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用蒸餾水,喂養(yǎng)7 d。本研究獲得醫(yī)院倫理會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑、儀器 IL-6(迪信泰檢測科技(北京)有限公司);IL-8(上海廣銳生物科技有限公司);TNF-α(上海酶研生物科技有限公司);CD4+、CD8+(上海華邦生物科技有限);iNOS抗體(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司);CD206抗體(艾美捷科技有限公司);HP300型組織脫水機(jī)(奧華科技有限公司);Elx808型全波長多功能酶標(biāo)儀(廣州吉源生物科技有限公司);ES30型組織包埋機(jī)(華速科技有限公司);ZE5型流式細(xì)胞儀(美國Bio-Rad生物科技有限公司);GAPDH(美國CST公司);RIPA裂解液(北京伊塔生物科技有限公司);光學(xué)顯微鏡(日本OLympus公司)。

1.3 方法

1.3.1 造模及分組:選取6-8周雌性BALB/c小鼠60只,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d,其中對照組15只,其余共45只小鼠,建模期間,對照組小鼠給予蒸餾水自由飲用,其他3組小鼠給予3.5% DSS溶液自由飲用,制作潰瘍性腸炎模板,造模小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的稀便、便血、體重量下降為造模成功。7 d后,所有小鼠造模成功,無死亡小鼠,隨機(jī)分為模型組、上調(diào)組、下調(diào)組,每組15只。

1.3.2 HE染色:小鼠腹腔注射麻醉后,經(jīng)腹部主動脈采血3 mL,4 μL石蠟切片脫蠟至水洗,蘇木精染色,進(jìn)行清洗,1%鹽酸酒精分化20 s,接著清洗1 min反藍(lán)30 s,進(jìn)行清洗,伊紅染色,再接著水洗,80%乙醇脫水20 s,90%乙醇脫水20 s,95%乙醇脫水1 min,無色透明液體2 min,封片固定,光學(xué)顯微鏡觀察。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 潰瘍性結(jié)腸炎評分:觀察小鼠活動性、進(jìn)食情況、毛色變化、體重變化,記錄小鼠排便次數(shù)、糞便形狀、并進(jìn)行潛血檢測。根據(jù)體重、大便形狀和便血情況評分[8]。小鼠體重下降評分:體重不變?yōu)?,1～5 g為1分,6～10 g為2分,11～15 g為3分,>15 g為4分;大便形狀評分:正常為0分,糞便成形但較軟為1分,沒有成形為2分,拉稀水為4分;血便情況:未出現(xiàn)出血癥狀為0分,出現(xiàn)出血癥狀為2分。

1.4.2 炎性因子水平檢測:將小鼠結(jié)腸組織加入適量0.9%氯化鈉溶液搗碎,加入磷酸鹽緩沖液500 μL的離心管中,攪拌使?jié)舛劝l(fā)生改變,3 500 r/min離心10 min取上清液。酶聯(lián)免疫吸附法檢測小鼠血清和結(jié)腸清液中的IL-6、IL-8、TNF-α水平。

1.4.3 巨噬細(xì)胞檢測:新鮮的小腸分離用冰冷的磷酸緩沖鹽溶液沖洗,切成2 mm長的小塊,放置于磷酸緩沖鹽溶液在冰上孵育90 min,30 min晃動1次。之后晃動樣本,收集上清。換新鮮的磷酸緩沖鹽溶液,繼續(xù)孵育,每30分鐘收集1次上清。最終收集清洗2次,3 000 r/min,于37℃處理1 min,過40 μm濾篩,制得單細(xì)胞懸浮液。將準(zhǔn)備的結(jié)腸單細(xì)胞懸液收集于流式管中,加入CD206抗體1 μL、進(jìn)行混勻,37℃避光孵育25 min。等待表明抗體孵育完成之后,使用冷的磷酸緩沖鹽溶液洗滌1次,洗滌之后每份流式管加入流式破膜固定液1 mL并脈沖渦旋,室溫孵育60 min。每份流式管添加透化液2 mL,室溫條件下800 r/min,離心5 min,棄上清。每份流式樣品重復(fù)懸后添加iNOS聚乙烯管抗體3.5 μL,室溫避光孵育30 min。每份流式管添加透化液2 mL,室溫條件下,進(jìn)行離心處理800 r/min,離心5 min,丟棄清液,洗滌1次。最后將樣品重懸與PBS 300 μL中,使用流式細(xì)胞儀分析。

1.4.4 miRNA表達(dá)檢測:采用qRT-PCR定量檢測,提取RNA:將適量細(xì)胞溶于1 mL RNA提取試劑TRIzol中,組織則需要在研缽中加入液氮和TRIzol研磨成粉末狀;每管加入200 μL三氯甲烷,進(jìn)行混勻,室溫靜置5 min;在4℃,5 000 r/min,離心15 min,收集上清放在離心管中,加入同體積的異丙醇,混勻,室溫靜置10 min;4℃,5 000 r/min,離心10 min,倒掉上清,在管中加入1 mL 75%DEPC-乙醇,4℃、12 000 g離心5 min;晾干沉淀,加入適量的DEPC水溶解。應(yīng)用mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒性逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,GAPDH為內(nèi)參,提取細(xì)胞引物反應(yīng)條件95℃ 5 min、95℃15 s、60℃退火30 s,72℃延伸32 s,40個循環(huán),樣本重復(fù)2次取平均值,每個miRNA相對標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參表達(dá)量用方程2-ΔΔCt表示。

1.4.5 claudin-2表達(dá)水平:采用Western BIot法檢測結(jié)腸組織claudin-2表達(dá)水平。將結(jié)腸組織剪碎后加50 μL細(xì)胞裂解液離心取上清,用0.9%氯化鈉溶液洗滌3次,并切碎,加入裂解液進(jìn)行溶解。離心處理1 500 r/min,離心20 min,4℃孵育膜過夜,清洗之后,加入一抗標(biāo)記大鼠于室溫封閉1 h,內(nèi)參為GAPDEH,對蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察:4組小鼠交通病理特征比較 對照組小鼠結(jié)腸黏膜整齊,腺體排列整齊,沒有出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤;模型組結(jié)腸黏膜缺損不均,潰瘍形成,隱窩膿腫,黏膜下層大量炎性性細(xì)胞浸潤;上調(diào)組結(jié)腸黏膜比較完整,出血點(diǎn)消失,但存在部分黏膜缺損,隱窩膿腫,少量炎性細(xì)胞浸潤;下調(diào)組表面出現(xiàn)脫落壞死,潰瘍形成,隱窩消失、存在膿腫,杯狀細(xì)胞增多。見圖1。

圖1 4組病理特征(HE×100)

2.2 4組潰瘍性結(jié)腸炎小鼠評分比較 與模型組比較,上調(diào)組3 d、5 d、7 d評分降低、下調(diào)組3 d、5 d、7 d評分升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組3 d、5 d、7 d評分升高(P<0.05)。見表1。

表1 4組潰瘍性結(jié)腸炎小鼠評分比較 n=15,分,

2.3 4組小鼠轉(zhuǎn)染效率比較 與對照組比較,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組miRNA表達(dá)量升高(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組miRNA表達(dá)量下降,下調(diào)組miRNA表達(dá)量升高(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組miRNA表達(dá)量升高(P<0.05)。見表2。

表2 4組小鼠轉(zhuǎn)染效率鑒定 n=15,

2.4 4組小鼠CD4+、CD8+免疫細(xì)胞比較 與對照組比較,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組CD4+、CD8+免疫細(xì)胞升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組CD4+、CD8+免疫細(xì)胞降低,下調(diào)組CD4+、CD8+免疫細(xì)胞升高(P<0.05)。見表3。

表3 4組免疫細(xì)胞功能比較 n=15,%,

2.5 4組小鼠炎性因子水平比較 與對照組比較,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組TNF-α、IL-6、IL-8水平升高(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組TNF-α、IL-6、IL-8水平降低、下調(diào)組TNF-α、IL-6、IL-8水平升高,(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組TNF-α、IL-6、IL-8水平明顯升高(P<0.05)。見表4。

表4 4組小鼠血清炎性因子水平比較 n=15,

2.6 4組小鼠巨噬細(xì)胞功能比較 與對照組比較,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組iNOS水平升高、CD206水平降低(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組iNOS水平降低、CD206水平升高(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組iNOS水平明顯升高、CD206水平明顯下降(P<0.05)。見表5。

表5 4組小鼠巨噬細(xì)胞功能比較 n=15,

2.7 4組小鼠claudin-2蛋白表達(dá)比較 與對照組比較,模型組、上調(diào)組、下調(diào)組claudin-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與模型組比較,上調(diào)組claudin-2蛋白表達(dá)下降、下調(diào)組claudin-2蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05);與上調(diào)組比較,下調(diào)組水平明顯升高(P<0.05)。見表6,圖2。

表6 4組claudin-2蛋白表達(dá)比較 n=15,ng/mL,

圖2 claudin-2蛋白表達(dá)WB圖

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎臨床表現(xiàn)為長期慢性頻繁腹瀉伴有嚴(yán)重腹痛,還會出現(xiàn)黏液膿血便的癥狀,長期的炎癥會致癌,還可能會導(dǎo)致結(jié)腸穿孔、壞死等[9-10]。潰瘍性結(jié)腸炎癥作為一類非特異性炎癥性腸病,其發(fā)生發(fā)展與腸道炎癥變化有密不可分的聯(lián)系,對炎癥有著調(diào)節(jié)作用。由于潰瘍性結(jié)腸炎癥反復(fù)發(fā)病,還會出現(xiàn)結(jié)直腸痛、黏液血便等癥狀。

miRNA屬于一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA,在許多生命中起到了重要的作用,具有調(diào)控的功能,并且參與機(jī)體內(nèi)不同的生理、病理過程。還參與多種生物進(jìn)程,包括早期細(xì)胞分化、增殖等,免疫應(yīng)答和維持病毒感染機(jī)體后內(nèi)環(huán)境平衡;miRNA基因存在于許多不同基因編碼位置上,如細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外編碼蛋白質(zhì)基因和未編碼RNAs上,能有效抑制相關(guān)蛋白質(zhì)合成、降解靶基因miRNA;介于固有免疫在抵抗病源中發(fā)揮重要作用和miRNA在調(diào)控固有免疫進(jìn)程中的重要性和作用的特殊性,作為一種重要調(diào)控物質(zhì)參與其中可達(dá)到減少炎性因子的釋放,從而緩解潰瘍性結(jié)腸炎性反應(yīng),控制向癌變發(fā)展[11]。而研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)不同時間點(diǎn)來進(jìn)行觀察小鼠潰瘍性結(jié)腸炎情況,發(fā)現(xiàn)第3、5、7天在上調(diào)miRNA中小鼠潰瘍性結(jié)腸炎中明顯降低。

CD4+、CD8+作為一種重要的免疫細(xì)胞,CD4+細(xì)胞的異常失衡在疾病的發(fā)生中占據(jù)主導(dǎo)地位[12]。CD8+具有直接殺傷活性,通過消滅目標(biāo)細(xì)胞而清除特殊抗體反應(yīng),從而調(diào)節(jié)免疫活性[13]。研究證明,小鼠潰瘍性結(jié)腸炎中CD4+、CD8+細(xì)胞比例失衡,會導(dǎo)致相關(guān)細(xì)胞因子和炎癥出現(xiàn)異常,從而導(dǎo)致腸道炎癥及組織受損,形成潰瘍[14]。而水平研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)過上調(diào)miRNA對小鼠潰瘍性結(jié)腸炎干預(yù)后,免疫細(xì)胞中CD4+、CD8+水平明顯降低,說明調(diào)節(jié)了結(jié)腸黏膜免疫細(xì)胞功能,起到了調(diào)控炎性因子的作用,緩解了炎癥。

TNP-α主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞產(chǎn)生,它不僅刺激巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞和細(xì)胞因子、催化蛋白質(zhì)水解酶類,還能吞噬細(xì)胞產(chǎn)物的補(bǔ)體片段引起細(xì)胞壞死、和水腫的發(fā)生等,從而促進(jìn)胃腸細(xì)胞組織損害。另外還可以誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡,促進(jìn)潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生[15]。IL-6在急性炎性反應(yīng)中處于中心地位,主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)產(chǎn)生C-反應(yīng)蛋白和降鈣素原生成[16]。IL-8作為一個潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病過程中的炎性因子,是一種強(qiáng)而有力的中性粒細(xì)胞趨化和活化因子,并激活中性粒細(xì)胞,促進(jìn)中性粒細(xì)胞的穩(wěn)定以及溶解和吞噬作用,對白細(xì)胞血液中的一類細(xì)胞和T細(xì)胞也有一定的作用[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),TNP-α、IL-6、IL-8在小鼠潰瘍性結(jié)腸炎中明顯升高;而經(jīng)過上調(diào)miRNA對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠進(jìn)行干預(yù),能夠降低TNP-α、IL-6、IL-8水平。說明通過上調(diào)miRNA,反映了潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生,緩解了腸道受損和腸道炎癥癥狀。

巨噬細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)起著重要的清除病原體和細(xì)胞垃圾的作用[18]。當(dāng)機(jī)體受到感染損傷時,巨噬細(xì)胞會被激活,從而釋放出一系列的細(xì)胞因子和化學(xué)物質(zhì),以引導(dǎo)其他細(xì)胞參與反應(yīng)[19]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),iNOS水平在小鼠潰瘍性結(jié)腸炎中升高、CD206水平在小鼠潰瘍性結(jié)腸炎中降低;而經(jīng)過上調(diào)miRNA對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠進(jìn)行干預(yù),能夠降低iNOS水平,升高CD206水平,說明調(diào)整了機(jī)體適應(yīng)性免疫應(yīng)答,恢復(fù)了腸黏膜屏障功能。

claudin-2在直腸癌細(xì)胞中過表達(dá),與促進(jìn)細(xì)胞增殖,維護(hù)腸黏膜損傷中有著重要作用,形成細(xì)胞膜水通道介導(dǎo)調(diào)節(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞水通量[20]。本研究結(jié)果顯示,claudin-2蛋白表達(dá)在小鼠潰瘍性結(jié)腸炎中升高,經(jīng)過上調(diào)miRNA對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠進(jìn)行干預(yù),降低了claudin-2蛋白表達(dá),因?yàn)閙iRNA對claudin-2蛋白表達(dá)具有調(diào)控作用,能夠?qū)σ种萍?xì)胞的增殖,調(diào)節(jié)免疫功能,減輕炎性因子,從而明顯改善了潰瘍性結(jié)腸炎病狀。

綜上所述,miRNA通過調(diào)控claudin-2蛋白表達(dá),促使巨噬細(xì)胞極化,從而緩解了小鼠潰瘍性結(jié)腸炎腸道的損傷和炎癥,抑制了病癥的發(fā)展。