王壯壯 周正新 朱 磊 朱彩玉 顧一帆 李子鵬 陳少奇李 勝

1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，安徽合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨傷二科，安徽合肥 230031

股骨頭壞死是由各種原因?qū)е鹿晒穷^血運(yùn)受阻及骨細(xì)胞數(shù)量減少的一種骨關(guān)節(jié)疾病[1]。糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）在近些年應(yīng)用廣泛，導(dǎo)致激素性股骨頭壞死（steroid-induced avascular necrosis of the femoral head，SANFH）患者日益增多[2]。醫(yī)學(xué)界各大學(xué)者從未停止過對此病的深入研究，但仍有很多病理學(xué)及病因在臨床尚未得到充分驗(yàn)證[3]。人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human bone marrow mesenchymal stem cell，hBMMSC）是一種能夠分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞的成體干細(xì)胞[4]。研究表明，使用過量激素可能會造成hBMMSC 成骨/成脂分化功能紊亂，使骨組織的修復(fù)再造受阻[5]。而SANFH 的發(fā)病與hBMMSC分化異常密切相關(guān)。因此，調(diào)控hBMMSC分化對于治療SANFH 至關(guān)重要。中藥骨痹通消顆粒是由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院著名骨科專家丁鍔教授的經(jīng)驗(yàn)方化裁而來，前期基礎(chǔ)研究表明，該方能夠抑制糖皮質(zhì)激素對骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的破壞[6-7]。為此，本研究通過提取hBMMSC進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，探討骨痹通消顆粒對hBMMSC成骨和成脂分化的影響，進(jìn)一步為骨痹通消顆粒治療SANFH 奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞 30 只清潔級新西蘭白兔，體重3.0～3.5 kg，采購于安徽省動物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號SCXK（皖）2020-001，合格證號：NO.202213656]，嚴(yán)格遵守動物倫理學(xué)進(jìn)行飼養(yǎng)（AHUCM-rabbits-2022023）。骨髓取自2021 年9 月至2022 年9 月安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院10 例骨傷科SANFH 并行手術(shù)患者，用于體外培養(yǎng)hBMMSC?；颊咂骄挲g（52.83±8.55）歲。本研究方案已獲得安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（2022AH-81）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 骨痹通消顆粒（赤芍12 g、丹參15 g、續(xù)斷10 g、川芎10 g、淫羊藿10 g、當(dāng)歸10 g、甘草6 g、土鱉蟲6 g、肉桂4 g）是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，由該院中藥房制作、采購，注射用地塞米松磷酸鈉（5 mg/支，馬鞍山豐原制藥有限公司）。

1.1.3 主要試劑和儀器 茜素紅染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C0140）；油紅O 染液（北京索萊寶科技有限公司，批號：G1262）；成骨與成脂誘導(dǎo)分化試劑盒（加拿大STEMCELL 公司，批號：2320036、2320056）；CCK-8 試劑盒（上海奕杉生物科技有限公司，批號：100-106）；RNA 提取試劑盒（廣州美基生物，批號：RJH19-01）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒[新貝（上海）生物科技有限公司，批號：R202-02]；BMP-2、Runx2、βcatenin、PPARγ、C/EBP-α 及Fabp4 抗體均購自Bioss公司（批號：AB11286487、AB09245415、AB10163878、AB178860、AB40764、AB32552）；二抗羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司，批號：BST16D22C16C54）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 含藥血清制備 20 只大白兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，按照人與兔的體重計(jì)算等效劑量[8]，給予骨痹通消顆粒（4.5 g/kg）灌胃，每天2 次，灌胃7 d 后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）進(jìn)行麻醉，進(jìn)而心臟采血并無菌分離含藥血清，分裝后貯存在-20 ℃冰箱備用。動物尸體由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心統(tǒng)一處理。

1.2.2 hBMMSC 分離、培養(yǎng)及鑒定 在患者行全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)時，用5 ml 注射器從股骨中抽取1～2 ml 骨髓液，加入完培培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔2 d 換液1 次，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時，消化并傳代細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。取第三代細(xì)胞在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)，并分別進(jìn)行成骨和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)。每隔3 d 換液1 次，21 d 后進(jìn)行茜素紅染色、油紅O 染色，顯微鏡下觀察胞髓系分化潛能。

1.2.3 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖 將第三代細(xì)胞以1×104/孔均勻鋪在96 孔板上，并分為完培組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%的胎牛血清）及1%、2%、5%、8%、10%體積分?jǐn)?shù)的含藥血清A 組，每組10 個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h 后，每孔加入CCK-8 溶液10 μl，孵育1 h，在酶標(biāo)儀上以450 nm 的波長檢測各組的光密度（optical density，OD）值。為了進(jìn)一步探究骨痹通消顆粒對GCs 環(huán)境下hBMMSC 細(xì)胞活力的影響，繼續(xù)種細(xì)胞于96 孔板，細(xì)胞貼壁后，每孔加入0.52 μl 地塞米松溶液，分為損傷組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%的胎牛血清+0.52 μl 地塞米松溶液）與含藥血清B 組（分別為基礎(chǔ)培養(yǎng)基+2%、5%、8%含藥血清+0.52 μl 地塞米松溶液），同時制備完培組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%的胎牛血清）。每組10 個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h 后，按照CCK-8 試劑盒測定各孔波長450 nm 處的OD 值。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組 基于“1.2.3”的實(shí)驗(yàn)結(jié)果重新分組為對照組、模型組、實(shí)驗(yàn)組。無激素誘導(dǎo)細(xì)胞作為對照組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%的胎牛血清）。參考文獻(xiàn)[9]中方法，使用地塞米松（10-5mol/L）溶液誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，隨后將體外激素誘導(dǎo)的hBMMSC 細(xì)胞分為模型組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%的胎牛血清+10-5mol/L 地塞米松溶液）、實(shí)驗(yàn)組（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+5%的骨痹通消含藥血清+10-5mol/L地塞米松溶液）。

1.2.5 hBMMSC 成骨分化 調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml，鋪在6 孔板上，按“1.2.4”項(xiàng)下分組，每組3 個復(fù)孔。分別給予各組含相應(yīng)血清的hBMMSC 成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔3 d 更換1 次培養(yǎng)基。21 d 后按照成骨染色試劑盒染色后在顯微鏡下觀察。

1.2.6 hBMMSC 成脂分化 調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml，鋪于6 孔板，按“1.2.4”項(xiàng)下分組，每組3 個復(fù)孔。分別給予各組含相應(yīng)血清的hBMMSC 成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔3 d 更換1 次培養(yǎng)基。21 d 后按照成脂染色試劑盒染色后在顯微鏡下觀察。

1.2.7 RT-qPCR 檢測hBMMSC 中成脂相關(guān)基因的表達(dá) 選取PPARγ、C/EBP-α 及Fabp4 作為目標(biāo)檢測基因，β-actin 為內(nèi)參。按照試劑盒說明書提取細(xì)胞中RNA，并檢測其純度。取2 μg 的RNA，按照37 ℃、15 min，85 ℃、5 s 反應(yīng)程序?qū)NA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-20℃冰箱保存，加入相應(yīng)引物和熒光染料擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μl，其中10×PCR Buffer 5 μl,d NTPs 1 μl，正反向引物各1 μl，DNA 模板2 μl，Tap 酶0.5 μl，加雙蒸水至50 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火及延伸30 s，循環(huán)45 次，72 ℃延伸5 min。采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。引物序列見表1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

表1 各基因引物序列（5’-3’）

1.2.8 Western blot 檢測hBMMSC 中成骨相關(guān)蛋白的表達(dá) 選取BMP-2、Runx2 及β-catenin 為目標(biāo)蛋白，β-actin 為內(nèi)參。使用RIPA 和PMSF 混合而成的裂解液提取各組蛋白，BCA 法測定濃度。依次進(jìn)行上樣、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉，在4 ℃環(huán)境下配搖床孵育一抗（1∶1 000）過夜。TBST 洗膜3 次，室溫孵育對應(yīng)的二抗（1∶5 000），采用Image J 軟件分析條帶。并計(jì)算目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)或百分率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hBMMSC 的形態(tài)學(xué)及髓系分化潛能鑒定

將抽提的骨髓接種后，顯微鏡下觀察顯示，原代細(xì)胞呈圓形或其他不規(guī)則形狀，7 d 后，可見梭形、紡錘形或多角形的貼壁細(xì)胞（圖1A）。第三代細(xì)胞生長均勻，平行排列，透光率好（圖1B）。成骨誘導(dǎo)21 d，細(xì)胞發(fā)生改變，局部細(xì)胞聚集，并有礦化結(jié)節(jié)產(chǎn)生，茜素紅染色呈陽性（圖1C）；成脂誘導(dǎo)21 d，脂滴與油紅O染液結(jié)合變?yōu)榧t色，油紅O 染色呈陽性（圖1D）。

圖1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及髓系分化（40×）

2.2 骨痹通消顆粒降低GCs 對hBMMSC 細(xì)胞活力的影響

與完培組比較，10%體積分?jǐn)?shù)的含藥血清A 組細(xì)胞活力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與完培組比較，損傷組細(xì)胞活力下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與損傷組比較，2%、5%、8%體積分?jǐn)?shù)的含藥血清B 組可細(xì)胞活力升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。5%體積分?jǐn)?shù)的含藥血清B 組細(xì)胞活力高于2%、8%體積分?jǐn)?shù)的含藥血清B 組。見圖2～3。

圖2 不同體積分?jǐn)?shù)的骨痹通消含藥血清作用24 h 后對細(xì)胞增殖的影響（n=10）

圖3 不同體積分?jǐn)?shù)的骨痹通消含藥血清對激素環(huán)境中細(xì)胞活力的影響（n=10）

2.3 各組成骨分化情況

與對照組比較，模型組染色面積降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組中礦化結(jié)節(jié)與沉積升高，染色范圍也更廣，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4、表2。

圖4 各組茜素紅染色情況（40×）

表2 各組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)（±s）

表2 各組細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)數(shù)（±s）

注與對照組比較，aaP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05。

2.4 各組成脂分化情況

與對照組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組較細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5、表3。

圖5 各組油紅O 染色情況（40×）

表3 各組細(xì)胞脂滴數(shù)（±s）

表3 各組細(xì)胞脂滴數(shù)（±s）

注與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

2.5 各組成脂相關(guān)基因表達(dá)

與對照組比較，模型組PPARγ、C/EBP-α 和Fabp4的表達(dá)量升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組PPARγ、C/EBP-α 和Fabp4 的表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組細(xì)胞基因表達(dá)情況（n=3）

2.6 各組成骨相關(guān)蛋白表達(dá)。

與對照組比較，模型組BMP-2、Runx2 及β-catenin蛋白表達(dá)含量升高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，實(shí)驗(yàn)組BMP-2、Runx2 及β-catenin 蛋白表達(dá)含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖7～8。

圖7 各組成骨蛋白條帶圖

圖8 各組蛋白的相對表達(dá)量（n=3）

3 討論

SANFH 的發(fā)病機(jī)制有很多，如成骨成脂分化失衡、脂肪栓塞、骨質(zhì)疏松、細(xì)胞凋亡與功能失衡，以及凝血異常等[10-12]。hBMMSC 成骨成脂分化的失衡是最主要的發(fā)病機(jī)制之一。當(dāng)脂肪細(xì)胞增多，容易引起凝血障礙，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與功能失衡，繼而導(dǎo)致股骨頭骨髓壞死的惡性循環(huán)[13]。該病在中醫(yī)上為“骨蝕”范疇?！端貑枴け哉摗菲唬骸帮L(fēng)、寒、濕三氣雜至合，病在骨，骨髓酸痛，而為骨蝕?！卑l(fā)病根本在于腎虛，與脾腎密切相關(guān)，脾腎兩虛導(dǎo)致痰結(jié)血瘀，不通則痛，不榮則痛，而疼痛是SANFH 最明顯的臨床特征[14-15]。大量研究數(shù)據(jù)表明，補(bǔ)腎壯陽、活血化瘀類方藥對激素性股骨頭壞死具有一定的治療效果[16-18]。骨痹通消顆粒選用有強(qiáng)筋健骨之功的淫羊藿、續(xù)斷、土鱉蟲與活血化瘀止痛作用的丹參、赤芍、川芎、當(dāng)歸及引火歸元的肉桂，加以甘草調(diào)和諸藥，共奏補(bǔ)腎活血化瘀之功[19]。hBMMSC 在疾病的發(fā)展過程中至關(guān)重要，成骨-成脂分化在生理狀態(tài)下處于動態(tài)平衡狀態(tài)，若長期使用大量糖皮質(zhì)激素會打破這種平衡，導(dǎo)致二者分化出現(xiàn)異常，進(jìn)而引起SANFH 等相關(guān)疾病[20-21]。因此，對于改善成骨-成脂的分化比例，延緩SANFH 的進(jìn)程有重大意義。本研究于體外分離hBMMSC，加以骨痹通消顆粒含藥血清培養(yǎng)，觀察其對hBMMSC 增殖及成骨、成脂分化的影響，明確骨痹通消顆粒發(fā)揮作用的機(jī)制。

茜素紅染色能夠反映成骨分化晚期鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量。本研究表明，骨痹通消顆粒含藥血清能夠促進(jìn)hBMMSC 鈣化并減少細(xì)胞中脂質(zhì)生成，抑制其成脂分化的能力。hBMMSC 的分化由許多轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。Runx2 是一種hBMMSC 向成骨細(xì)胞分化的不可或缺的轉(zhuǎn)錄因子，且可抑制hBMMSC 成脂分化[22]。BMP-2能夠促進(jìn)hBMMSC 分化為成骨細(xì)胞[23]。β-catenin 作為Wnt/β-catenin 的通路蛋白，能夠激活該通路來促進(jìn)hBMMSC 向成骨分化。PPARγ 對Runx2 有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。在hBMMSC 成骨與成脂分化時，Runx2 和PPARγ 共同調(diào)控各種細(xì)胞因子以維持平衡，GCs 能夠通過下調(diào)Runx2 的表達(dá)抑制hBMMSC 的成骨分化作用，通過上調(diào)PPARγ 的表達(dá)促進(jìn)其向成脂分化[24]。C/EBP-α 與Fabp4 同樣為hBMMSC 在脂肪分化過程中的關(guān)鍵基因，能夠與PPARγ 共同調(diào)控成脂相關(guān)蛋白[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，骨痹通消顆粒能夠促進(jìn)hBMMSC 中成骨相關(guān)蛋白BMP-2、Runx2 及β-catenin的表達(dá)，且可下調(diào)成脂相關(guān)基因PPARγ、C/EBP-α 和Fabp4 中mRNA 的表達(dá)，進(jìn)一步證明骨痹通消顆粒含藥血清促進(jìn)成骨分化、抑制成脂分化的藥效作用。

綜上所述，骨痹通消顆粒能夠促進(jìn)hBMMSC 成骨分化的能力，并抑制其向成脂分化，進(jìn)一步調(diào)控hBMMSC 成骨-成脂分化的平衡與穩(wěn)態(tài)，起到防治激素性股骨頭壞死的作用。為了更好地發(fā)揮骨痹通消顆粒的功效，還需更多臨床及動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究其對SANFH 的防治優(yōu)勢。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。