王中琪 吳西 高玉海 柏鑫 陳克明,3*

1.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四○醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730050

2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院,甘肅 蘭州 730030

3.甘肅省干細(xì)胞與基因藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730050

伴隨著載人航空事業(yè)的進(jìn)步,宇航員在太空失重環(huán)境發(fā)生的骨骼和肌肉丟失、心血管功能障礙等問題卻日益突出,其中骨丟失是至今仍未解決的一個難題[1]。有研究發(fā)現(xiàn)在國際空間站任務(wù)期間,8名航天員的股骨骨密度降低了3%～10%,其中4名股骨頸骨密度降低了1.7%～10.5%。并且有7名宇航員的腰椎骨密度降低了2.5%～10.6%,而在正常重力環(huán)境中患有骨質(zhì)疏松癥的人群每年的骨量流失率僅為0.5%～1%[2]。這一發(fā)現(xiàn)表明,失重條件下骨密度的下降速度遠(yuǎn)快于骨質(zhì)疏松癥的人群[3]。目前針對太空失重引起骨丟失采取的防治措施包括運(yùn)動預(yù)防法、電磁場療法和藥物治療等[4]。但運(yùn)動療法與電磁場療法存在一定的不便,而長期使用雙膦酸鹽類藥物又存在潛在的副作用,因此筆者嘗試從中醫(yī)角度尋找新的治療方法。

中藥淫羊藿最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,認(rèn)為其具有溫腎益陽、強(qiáng)筋骨、固精等功效[5]。研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿有效成分含量研究主要集中于黃酮類成分,其中淫羊藿苷為淫羊藿黃酮類中主要有效成分,在預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松方面也具有較好的療效[6]。相關(guān)研究表明淫羊藿苷可以通過激活成骨基因表達(dá),促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化,預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松[7]。程琳燕等[8]研究發(fā)現(xiàn),淫羊藿苷通過下調(diào)RANKL-p38/ERK-NFAT信號通路抑制破骨細(xì)胞分化,從而保護(hù)骨組織結(jié)構(gòu)。同時本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),淫羊藿苷可以提高成骨細(xì)胞活性,促進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的成骨性分化,抑制破骨細(xì)胞發(fā)生與骨吸收活性,并且通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷可以提高生長期大鼠峰值骨量以及預(yù)防切出卵巢發(fā)生絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松[9-15]。

基于淫羊藿苷抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥領(lǐng)域的研究以及本團(tuán)隊前期研究成果,本研究提出淫羊藿苷具有預(yù)防微重力環(huán)境導(dǎo)致的骨丟失作用的假說。為了證明此假說,本實(shí)驗(yàn)采用國際公認(rèn)的大鼠鼠尾懸吊模型來研究微重力環(huán)境下引起的骨丟失,并查閱相關(guān)文獻(xiàn)給予淫羊藿苷50 mg/kg進(jìn)行干預(yù)治療,對比各組大鼠的骨微結(jié)構(gòu)、血清骨代謝指標(biāo)、骨形成相關(guān)蛋白表達(dá)水平及氧化應(yīng)激水平的差異來證明淫羊藿苷能預(yù)防模擬微重力環(huán)境下大鼠骨丟失并研究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物:2月齡Wistar雄性大鼠30只,體重(200±10) g。飼養(yǎng)于中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四○醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心(許可證編號:SYXK(軍)2017-0047),自由進(jìn)食、攝水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四○醫(yī)院科研管理倫理委員會審查符合動物倫理(審批編號:2021KYLL184)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物及試劑:淫羊藿苷(寶雞辰光生物科技有限公司,純度98%,產(chǎn)品批號:HI008055298);戊巴比妥鈉(美國sigma化學(xué)公司,產(chǎn)品批號:11715-100G);β-actin、Runx2、COL-1、BMP2、OSX抗體(江蘇親科生物有限公司,批號:AF7018、AF4770、AF7001、DF6034、AF7580);山羊抗兔IgG-HRP抗體(巴傲得生物科技有限公司,批號:BS13278);PINP、CTX-1、OPG、RANKL、8-iso-PGF2α、8-OHdG ELISA試劑盒(泉州睿信生物科技有限公司,批號:20211217-30103B、20211217-35070B、20211217-30397B、20211217-30432B、20211217-30030B、20211217-30027C);MDA、SOD試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號:A003-1-2、A001-3-2)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備:NMC-100型Micro-CT(平生醫(yī)療科技);全波長酶標(biāo)測試儀(Epoch Biotek);Scientz-48L冷凍型高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技有限公司);MiniChemiTM580型化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(森西賽智);DP71型正置顯微鏡(奧林巴斯)。

1.2 方法

1.2.1動物分組及模型建立:將2月齡雄性Wistar大鼠利用隨機(jī)數(shù)字表法分為CON組、HLS組、ICA組,每組10只,CON組單只分籠飼養(yǎng),HLS組和ICA組大鼠均建立大鼠鼠尾懸吊模型,具體模型建立方法參考陳杰等[16]的改良方法。尾吊模型建立后,ICA組按50 mg/kg濃度灌胃給藥,CON組及HLS組給予等體積的蒸餾水灌胃,每日1次,灌服28 d后,腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉下取血處死,摘取主要臟器及骨骼。

1.2.2檢測指標(biāo):(1)Micro-CT掃描股骨及腰椎。對大鼠左側(cè)股骨及第4腰椎進(jìn)行Micro-CT掃描,感興趣區(qū)域?yàn)榫嚯x股骨髁上2 mm,厚度2 mm區(qū)域及第4腰椎椎體中心1 cm3立方體,獲得三維結(jié)構(gòu)圖以及骨小梁詳細(xì)結(jié)構(gòu)參數(shù)。(2)ELISA血清骨代謝指標(biāo)分析。大鼠通過腹主動脈采血液樣本,4 ℃冰箱靜置1 h后以3 500 r/min離心15 min,吸取上清液,按照雙抗體酶聯(lián)免試劑盒說明書,采用ELISA檢測法測定大鼠血清骨代謝指標(biāo)PINP、CTX-1、OPG、RANKL的含量。(3)Western blotting分析骨形成相關(guān)蛋白。取脛骨髁下4 mm骨組織剪碎,提取骨組織蛋白樣品,上樣,電泳,電轉(zhuǎn),封閉2 h,分別加入COL-1、Runx2、BMP2、OSX和β-actin抗體4 ℃過夜,次日加入山羊抗兔IgG-HRP抗體,室溫孵育2 h后曝光,用ImageJ軟件對結(jié)果進(jìn)行量化分析。(4)氧化與抗氧化指標(biāo)檢測。采用WST-1法檢測血清中的SOD活力,TBA法檢測血清中的MDA含量,ELISA檢測法測定大鼠血清中8異前列腺素F2α(8-iso-PGF2α)和8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)的含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0、Graphpad Prism9.3.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均為定量資料,符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,不服從正態(tài)分布采用中位數(shù)和四分位數(shù)間距(M,IQ)表示。符合正態(tài)分布且方差齊性的多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Micro-CT股骨及腰椎掃描結(jié)果

通過股骨骨小梁三維重建圖及股骨縱截面可觀察到CON組骨小梁密集交織呈網(wǎng)狀;HLS組的骨小梁分布稀疏且骨小梁之間的孔隙明顯;ICA組骨小梁分布密度與CON組接近(圖1A)。骨小梁參數(shù)的量化結(jié)果顯示,與CON組相比,HLS組的BMD、BS/TV、BV/TV、Tb.N及Tb.Th均降低(P<0.05),且Tb.Sp升高(P<0.05)。與HLS組相比,ICA組的BMD、BS/TV、BV/TV、Tb.N及Tb.Th均升高(P<0.05),而Tb.Sp降低(P<0.05)(圖1B)。

圖1 各組大鼠股骨遠(yuǎn)端Mirco-CT三維重建及掃描參數(shù)

同樣在第4腰椎的三維重建圖中,能觀察到CON組的骨小梁交錯排列,形成了緊密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);HLS組中的骨小梁分支顯著減少,間隙增大,結(jié)構(gòu)疏松;ICA組骨小梁仍呈致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖2A)。根據(jù)對骨小梁參數(shù)的量化結(jié)果可知,與CON組相比,HLS組的BMD、BS/TV、BV/TV、Tb.N及Tb.Th均降低(P<0.05),且Tb.Sp升高(P<0.05)。與HLS組相比,ICA組的BMD、BS/TV、BV/TV、Tb.N及Tb.Th均升高(P<0.05),且Tb.Sp降低(P<0.05)(圖2B)。

圖2 各組大鼠第4腰椎Mirco-CT三維重建及掃描參數(shù)

2.2 血清骨代謝指標(biāo)檢測結(jié)果

如圖3所示,與CON組相比,HLS組血清中骨形成指標(biāo)PINP、OPG含量均降低(P<0.05),而骨吸收指標(biāo)CTX-1、RANKL含量均升高(P<0.05);ICA組中骨形成指標(biāo)PINP、OPG含量與骨吸收指標(biāo)CTX-1含量與CON組相近(P>0.05)。與HLS組相比,ICA組血清中骨形成指標(biāo)PINP、OPG含量均升高(P<0.05),骨吸收指標(biāo)CTX-1、RANKL含量均降低(P<0.05)。

圖3 各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)量化結(jié)果

2.3 Western blotting 檢測骨形成蛋白結(jié)果

如圖4所示,與CON組相比,HLS組BMP2、Runx2、COL-1、OSX蛋白表達(dá)均降低(P<0.05);ICA組Runx2、OSX蛋白表達(dá)與CON組相近(P>0.05)。與HLS組相比,ICA組BMP2、Runx2、COL-1、OSX蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)。

圖4 各組大鼠骨形成蛋白表達(dá)結(jié)果

2.4 氧化與抗氧化指標(biāo)檢測結(jié)果

與CON組相比,HLS組血清中氧化指標(biāo)8-iso-PGF2α、8-OhdG和MDA含量均升高(P<0.05),抗氧化指標(biāo)SOD酶活力降低(P<0.05)。與HLS組相比,ICA組血清中8-iso-PGF2α、8-OHdG、MDA含量降低(P<0.05),SOD酶活力升高(P<0.05)(圖5)。

圖5 各組大鼠氧化與抗氧化指標(biāo)結(jié)果

3 討論

骨丟失導(dǎo)致的骨小梁的顯微結(jié)構(gòu)和幾何形狀的改變是丟失程度的直觀顯示[17]。本實(shí)驗(yàn)首先通過Micro-CT提供的三維圖像,觀察骨小梁的形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)量,分析骨小梁的參數(shù)變化。其結(jié)果能清晰地對比出各組間的骨丟失程度,與CON相比,HLS組骨小梁分布稀疏且連續(xù)性較差,骨小梁厚度減少,說明尾吊后導(dǎo)致HLS組發(fā)生骨丟失,骨微結(jié)構(gòu)遭到破壞;與HLS組相比,ICA組骨小梁增厚,連續(xù)性較好,分布均勻。說明淫羊藿苷預(yù)防了骨小梁結(jié)構(gòu)的破壞,抵抗了骨丟失導(dǎo)致的骨小梁形態(tài)特征改變。

在骨骼重建過程中,成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞會分泌不同的細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)和特定分子,這些分子可以影響骨吸收和骨形成[18]。這些分子也被稱為骨形成標(biāo)志物和骨吸收標(biāo)志物,在血清中檢測可反映骨細(xì)胞的活動狀態(tài)[19]。本實(shí)驗(yàn)中HLS組PINP、OPG均降低,CTX-1、RANKL均升高,說明模擬微重力環(huán)境下大鼠成骨活動減弱,骨礦化減少,骨吸收增加;ICA組相較于HLS組PINP、OPG均升高,CTX-1、RANKL均降低,說明淫羊藿苷可以改善尾吊大鼠造成的成骨活動減弱,骨吸收增加。同時ICA組骨形成指標(biāo)PINP、OPG含量與骨吸收指標(biāo)CTX-1含量與CON組相近,說明灌服淫羊藿苷能促進(jìn)尾吊大鼠骨形成,抑制骨吸收,并在一定程度上使骨形成和骨吸收恢復(fù)至正常水平?；谝陨?本研究也對參與骨形成的相關(guān)蛋白COL-1、BMP-2、Runx2、OSX的表達(dá)進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示HLS組的骨形成相關(guān)蛋白均呈下降趨勢,ICA組的骨形成相關(guān)蛋白均高于HLS組,但與CON組仍存在一定差距。說明淫羊藿苷能在一定程度上調(diào)大鼠骨組織中COL-1、BMP2、Runx2、OSX的表達(dá)量,進(jìn)而減緩微重力導(dǎo)致的骨丟失。

長時間的空間飛行后,人體內(nèi)氧化劑的產(chǎn)生和抗氧化劑的防御之間的平衡被打亂,過量的氧化劑會導(dǎo)致骨骼氧化損傷[20]。相關(guān)研究表明,模擬微重力條件下成骨細(xì)胞的活性氧水平升高,增殖速率減慢,成骨活性下降,抗氧化干預(yù)能恢復(fù)成骨細(xì)胞細(xì)胞增殖速率和代謝[21]。MDA是常見氧化代謝產(chǎn)物,可以反映出體內(nèi)細(xì)胞的損傷程度,8-iso-PGF2α和8-OhdG也是氧化損傷標(biāo)志物,分別與脂質(zhì)和DNA相關(guān)[22]。同時,測量SOD可以間接反映人體清除氧自由基的能力,與氧化損傷結(jié)合指標(biāo)起來,可以較為全面地反映氧化應(yīng)激狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)中大鼠在微重力環(huán)境下體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平升高,清除氧自由基的能力下降,而淫羊藿苷能夠減輕大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平預(yù)防骨丟失。相關(guān)研究表明,尾吊后大鼠體內(nèi)的氧化標(biāo)志物顯著升高,并且包慧蘭等[23]、趙博雅等[24]的研究中發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷能抑制心肌線粒體MDA含量,增加心肌線粒體SOD活性。上述結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證本結(jié)論,淫羊藿苷能夠減輕尾吊狀態(tài)引起的氧化應(yīng)激程度從而減少對骨細(xì)胞的損害,維持正常骨微結(jié)構(gòu)及骨質(zhì)量。

綜上所述,本研究結(jié)果表明模擬微重力環(huán)境會引起骨密度下降,最大載荷下降,骨微結(jié)構(gòu)退化,而淫羊藿苷能促進(jìn)骨形成,抑制骨吸收,減輕體內(nèi)氧化程度,提升抗氧化能力從而有效預(yù)防大鼠產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致骨丟失。未來,通過更多的實(shí)驗(yàn)和研究,也可以繼續(xù)探索我國傳統(tǒng)中藥在太空探索和太空醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用,為太空探索提供更多解決方案。