鄧英光，銀雪艷，郭秀彩，張紫萍，李峰（廣州市第十二人民醫(yī)院，廣州 510620）

吳茱萸堿（evodiamine，EVO）是蕓香科植物吳茱萸、石虎和疏毛吳茱萸的干燥近成熟果實中的色胺吲哚類生物堿成分[1-2]，具有抗炎、抗纖維化、抗脂毒性、抗腫瘤活性[3]，但EVO存在水溶性差，代謝過快，靶向性差等缺點[4-5]，使其臨床應(yīng)用受到限制。甘草酸（glycyrrhizic acid，GL）所具有的兩親性結(jié)構(gòu)特點使其對難溶性藥物具有增溶作用，大量研究表明以甘草酸作為載體的新型藥物，其藥物溶解度和生物利用度均有明顯的提高[6]，甘草酸作為天然藥物活性成分，已被證實是安全無毒的生物材料，在一定條件下不會導(dǎo)致溶血[7]，符合國家靜脈注射的標(biāo)準(zhǔn)，因此甘草酸可以滿足作為有前景的藥物遞送載體的靜脈藥物開發(fā)的基本要求。前期我們以甘草酸作為載體對EVO進行包封，采用薄膜分散法制備出吳茱萸堿-甘草酸納米膠束[（EVOGL）-micelles]，制備成膠束后EVO的溶解度明顯增加[8]，可作為靜脈注射藥物。為進一步了解（EVOGL）-micelles在大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)過程，尾靜脈分別注射EVO和（EVO-GL）-micelles后，采用HPLC測定大鼠血漿中EVO含量，評價膠束對EVO藥代動力學(xué)的影響，以期為EVO新型給藥系統(tǒng)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A島津高效液相色譜儀（日本島津有限公司）；Quintix65-1CN電子天平（德國賽多利斯公司）；5804R Eppendorf冷凍離心機（美國艾本德公司）；減壓真空干燥箱（上海高致精密儀器有限公司）。

1.2 試藥

EVO（純度＞98%，批號：C16244049，Aladdin），EVO對照品（純度＞99%，Aladdin，批號：A1629030），甘草酸（純度＞98%，北京百靈威科技有限公司，批號：LS40R62），乙腈、甲醇（色譜級，德國Merck公司），乙醇等其他試劑為分析純，水為超純水。

1.3 動物

雄性SD大鼠，200～220 g[南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院實驗動物中心，動物使用許可證，SYXK（粵）2015-0056；合格證號：44002100013124]。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

所用色譜柱為Ecosil C18反相液相色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；柱溫40℃；流動相為乙腈-水＝60∶40；流速1.0 mL·min-1；檢測波長225 nm；檢測器為二極管陣列紫外可見光檢測器（SPD-M20A）；進樣量20 μL；分析時間7 min。

2.2 溶液的制備

精密稱量10 mg EVO對照品，用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至50 mL棕色量瓶，加入甲醇定容至50 mL，即得到200 μg·mL-1的EVO對照品儲備液。精密吸取適量EVO對照品儲備液，使用適量的甲醇稀釋制成質(zhì)量濃度為100、500、2000 ng·mL-1作為EVO對照品溶液。

2.3 動物給藥方案及樣品采集處理

將12只雄性SD大鼠隨機平均分成（EVO-GL）-micelles組和EVO溶液組[用復(fù)合溶劑（5% DMSO，10%吐溫80，85% 0.9%氯化鈉溶液）超聲溶解[9]]。給藥前稱量大鼠體重，按 3 mg·kg-1（以EVO計）的劑量分別尾靜脈注射EVO溶液和（EVO-GL）-micelles。給藥后分別于0、0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24 h進行眼底取血，置于肝素化離心管，4℃、3500 r·min-1離心10 min，吸取上層血漿到離心管，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 樣品的處理

取100 μL血漿樣品，加入300 μL乙腈沉淀蛋白，渦旋混合3 min，12 000 r·min-1離心15 min，取上清液，50℃真空干燥揮干有機溶劑，加入100 μL甲醇復(fù)溶，渦旋3 min，12 000 r·min-1離心15 min。取上清液20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性 記錄EVO對照品、空白血漿樣品、空白血漿＋EVO對照品溶液、靜脈（EVOGL）-micelles給藥后30 min血漿樣品的HPLC圖，結(jié)果如圖1所示，血漿樣品中的內(nèi)源物質(zhì)不干擾EVO的色譜峰，EVO出峰時間短，保留時間為4.7 min，峰形良好。

圖1 吳茱萸堿-甘草酸納米膠束的HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of（EVO-GL）-micelles

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線以及定量下限 空白血漿中加入不同濃度的EVO溶液，即得到含EVO質(zhì)量濃度分別為25、50、100、250、500、1000、2000、4000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按照“2.4”項下方法處理血漿樣品。按“2.1”項下色譜條件進樣測定峰面積。以藥物質(zhì)量濃度（μg·mL-1，c）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)進行回歸擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到EVO的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A＝2.624×105c＋2.234×104（r＝0.998）。結(jié)果顯示血漿樣品中的EVO在25～4000 ng·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好。根據(jù)信噪比（S/N）＝10的原則，確定定量下限為25 ng·mL-1。

2.5.3 精密度 分別吸取100 μL空白血漿，制備低、中、高3個EVO質(zhì)量濃度（100、500、2000 ng·mL-1）的血漿樣品，每個濃度準(zhǔn)備5份，按照“2.4”項下方法處理后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定峰面積。在同一天內(nèi)每個濃度各測定3次，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，考察日間精密度。結(jié)果日內(nèi)精密度RSD為4.5%～5.1%，日間精密度RSD為5.3%～8.5%，達到生物樣品分析要求。

2.5.4 提取回收率 分別吸取100 μL空白血漿，制備低、中、高3個EVO質(zhì)量濃度（100、500、2000 ng·mL-1）的血漿樣品各5份，分別按照“2.4”方法處理后，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算EVO的濃度，提取回收率（%）＝提取后實測EVO濃度/理論濃度×100%。得出3個濃度EVO提取回收率為95.3%～98.4%，RSD范圍為5.7%～8.1%。達到生物樣品分析要求。

2.5.5 藥代動力學(xué)實驗數(shù)據(jù)處理及結(jié)果 數(shù)據(jù)處理后，得大鼠靜脈注射后各時間點EVO的平均血藥濃度，大鼠尾靜脈給藥 EVO和（EVO-GL）-micelles后吳茱萸堿的藥物濃度-時間曲線見圖2。使DAS 2.0軟件用對血藥濃度和時間采用靜脈給藥模型擬合，得到藥代動力學(xué)參數(shù)見表1。數(shù)據(jù)顯示EVO組在體內(nèi)符合二室模型，（EVO-GL）-micelles組符合三室模型。（EVO-GL）-micelles組的Cmax明顯高于EVO組（P＜0.05）。（EVO-GL）-micelles組的AUC0～t是EVO組的2.30倍。（EVO-GL）-micelles組清除率（CL）較EVO組明顯降低（P＜0.05）。

表1 EVO和(EVO-GL)-micelles的藥代動力學(xué)參數(shù)(±s，n＝6)Tab 1 Pharmacokinetic parameters of EVO and (EVO-GL)-micelles(±s，n＝6)

表1 EVO和(EVO-GL)-micelles的藥代動力學(xué)參數(shù)(±s，n＝6)Tab 1 Pharmacokinetic parameters of EVO and (EVO-GL)-micelles(±s，n＝6)

注：與EVO組相比，*P＜0.05。Note：Compared with the EVO group，* P＜0.05.

參數(shù)（EVO-GL）-micellesEVO Cmax/（μg·mL-1）1.61±0.19*0.92±0.11 t1/2/h3.66±1.493.26±0.59 V1/（L·kg-1）1.91±0.20*3.42±0.48 CL/（L·h-1·kg-1）0.67±0.21*1.38±0.14 AUC0～t/（mg·L-1·h）4.76±1.41*2.07±0.22 AUC0～∞/（mg·L-1·h）4.88±1.47*2.19±0.22

圖2 大鼠尾靜脈給藥 EVO和（EVO-GL）-micelles后吳茱萸堿的藥物濃度-時間曲線（±s，n＝6）Fig 2 Plasma concentration-time profile of evodiamine after tail vein administration of EVO and（EVO-GL）-micelles in rats（±s，n＝6）

3 討論

本實驗建立了HPLC法測定大鼠血漿中EVO含量，對（EVO-GL）-micelles和EVO進行了藥代動力學(xué)評價，結(jié)果顯示，EVO制備成（EVO-GL）-micelles納米膠束后，（EVO-GL）-micelles組的AUC0～t是原藥EVO的2.30倍，CL是原藥EVO的0.48倍，說明制備成（EVO-GL）-micelles納米膠束后，EVO在體內(nèi)的血漿清除率降低，表明（EVOGL）-micelles組相比EVO原藥在大鼠體內(nèi)具有更好的緩釋性，明顯改善了EVO的藥代動力學(xué)過程，提高EVO在血液中的濃度和滯留時間。前期我們體外釋藥實驗證明（EVO-GL）-micelles累計釋放量明顯高于EVO原藥，膠束中EVO 釋放緩慢，可能是由于藥物主要包載于膠束疏水性內(nèi)核中，以膠束的形式存在，從而起到緩釋作用[8]。同時可能與制備成甘草酸膠束后的靶向作用有關(guān)，甘草酸具有皂苷類兩親性物質(zhì)結(jié)構(gòu)特點，使其能夠結(jié)合細胞膜上的膽固醇或磷脂，改變細胞膜上脂質(zhì)的流動性，誘導(dǎo)細胞膜孔隙的形成，細胞膜通透性明顯增加，膠束與細胞膜相互作用，釋放大量的皂苷，從而在病變部位可達到高濃度的累積，甘草酸的直接跨膜遞送機制可能影響了EVO的代謝，從而起到緩釋的作用[10-11]。DAS 2.0擬合數(shù)據(jù)顯示EVO組符合二室模型，（EVO-GL）-micelles組更符合三室模型，可能在組織分布上與EVO組存在差異，體內(nèi)正常器官如肝臟中肝細胞膜上有甘草酸和甘草次酸的結(jié)合位點，有研究發(fā)現(xiàn)靜脈注射甘草酸后，甘草酸快速被肝臟攝取及蓄積，由甘草酸修飾后的藥物具有明顯的肝靶向性[7]，可用于肝臟疾病的治療，利用甘草酸的直接跨膜遞送機制及顯著的肝靶向性能力，用于構(gòu)建作用于肝纖維化組織的靶向藥物具有良好的應(yīng)用前景，需要進一步研究。