李明慧，張鈺明，盧新穎，李花花，彭紫薇，宋揚(yáng)，翟曉峰，顧妍，熱西旦木·馬木江，白潔，杜守穎（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488）

真武湯為第一批經(jīng)典名方目錄中的第八方，此方首載于張仲景編著的《傷寒論》，由茯苓、芍藥、生姜、白術(shù)和附子5味藥組成，具有溫陽(yáng)利水的功效，主治陽(yáng)虛水泛證[1]?，F(xiàn)代臨床多用于慢性腎炎、腎病綜合征、尿毒癥、糖尿病腎病、心律失常等陽(yáng)虛水飲內(nèi)停者。將其開(kāi)發(fā)為顆粒劑，可更好地滿(mǎn)足臨床順應(yīng)性的要求。

根據(jù)經(jīng)典名方研究的相關(guān)文件，顆粒劑的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）應(yīng)與基準(zhǔn)樣品保持一致，以確保其質(zhì)量符合標(biāo)準(zhǔn)，CQAs包括指紋圖譜相似度、指標(biāo)性成分含量以及出膏率。經(jīng)典名方顆粒劑的工藝研究的重點(diǎn)并非追求CQAs的最高水平，而是確保CQAs與基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍保持較高的一致性。質(zhì)量源于設(shè)計(jì)（quality by design，QbD）理念注重全面了解和把握整個(gè)制藥過(guò)程，注重對(duì)生產(chǎn)工藝的理解，以及生產(chǎn)過(guò)程中的產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)管和控制，從而指導(dǎo)整體理論[2-5]。

在QbD理念下優(yōu)化經(jīng)典名方真武湯的提取工藝，能夠有效地控制顆粒劑制備工藝過(guò)程，從而獲得與基準(zhǔn)樣品一致的重要特性。提取工藝對(duì)顆粒劑的最終質(zhì)量有直接影響，是整個(gè)制備工藝中質(zhì)量傳遞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。中藥提取的結(jié)果受到人為操作、環(huán)境條件、藥材本身、使用的儀器設(shè)備以及提取過(guò)程中的條件等因素的影響。其中，提取條件是關(guān)鍵因素。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，有效地控制提取條件，才能確保CQAs與基準(zhǔn)樣品一致。

課題組前期成功制備了15批真武湯基準(zhǔn)樣品[6]，并最終確定了以指紋圖譜相似度、芍藥苷和6-姜辣素的含量以及出膏率作為CQAs并確定其范圍。本研究以QbD理念為基礎(chǔ)，以指標(biāo)性成分的含量和出膏率為衡量標(biāo)準(zhǔn)，在單因素篩選的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化，構(gòu)建一個(gè)提取工藝的設(shè)計(jì)空間，以篩選出最佳的提取條件，從而確保制劑中間體和基準(zhǔn)樣品在CQAs方面保持一致，為后續(xù)顆粒劑的制備工藝奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

賽多利斯BSA 224S電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；JM-B10002電子天平（余姚市紀(jì)銘稱(chēng)重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）；HH-6型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器（上海一恒科技有限公司）；DZF-6051型真空干燥器（北京利康達(dá)圣科技有限公司）；DZTW 1000 mL電子調(diào)溫電熱套、DZTW 250 mL電子調(diào)溫電熱套（北京中儀泓瑞科技發(fā)展有限公司）；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；Thermo Fisher U3000高效液相色譜儀[DAD檢測(cè)器，CM 7.2色譜工作站，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]。

1.2 試藥

芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201842，純度：97.48%）、6-姜辣素對(duì)照品（批號(hào)：111833-201705，純度：96.8%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院）；乙腈、甲醇、磷酸（Fisher公司，色譜級(jí)）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；甲醇（分析純）。

茯苓飲片（批號(hào)：20200901，產(chǎn)地：安徽岳西）；白芍飲片（批號(hào)：20200801，產(chǎn)地：浙江磐安）；白術(shù)飲片（批號(hào)：20200801，產(chǎn)地：浙江磐安）；生姜飲片（批號(hào)：GX1，產(chǎn)地：廣西百色）；附子飲片（批號(hào)：SCJ20200701，產(chǎn)地：四川江油）。

2 方法與結(jié)果

2.1 真武湯基準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)實(shí)物的制備[6]

稱(chēng)取茯苓、白芍、生姜飲片各41.4 g，白術(shù)飲片27.6 g、附子飲片15 g于陶瓷砂鍋內(nèi)，加入1600 mL水，武火（1600 W）煮至沸騰，后用文火（800 W）繼續(xù)煎煮約70 min，用一層300目尼龍篩網(wǎng)趁熱（約80℃）過(guò)濾，濾液放涼后加水調(diào)整體積至600 mL。精密移取一定量的水煎液于25 mL西林瓶中，于冰箱冷凍層預(yù)凍12 h后，轉(zhuǎn)移至-80℃的真空冷凍干燥機(jī)中（真空度為4～5 Pa），冷凍3 d，得基準(zhǔn)樣品對(duì)應(yīng)實(shí)物。

2.2 CQAs和關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPPs）的確定

2.2.1 CPPs的篩選及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估 采用魚(yú)骨圖作為風(fēng)險(xiǎn)辨識(shí)工具，按照“儀、環(huán)、人、藥、法”梳理挖掘質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)工藝參數(shù)，初步確定潛在的CPPs（見(jiàn)圖1）。根據(jù)前期研究經(jīng)驗(yàn)[6]，選擇提取次數(shù)、提取時(shí)間、提取加水倍量為真武湯提取工藝的關(guān)鍵考察因素。

圖1 真武湯提取工藝參數(shù)風(fēng)險(xiǎn)辨識(shí)魚(yú)骨圖Fig 1 Risk identification of the extraction parameters of Zhenwu decoction

2.2.2 CQAs的確定 依據(jù)前期確定的基準(zhǔn)樣品標(biāo)準(zhǔn)[6]選取芍藥苷、6-姜辣素含量以及出膏率為CQAs。

2.3 指標(biāo)性成分含量測(cè)定方法的建立

2.3.1 色譜條件 芍藥苷測(cè)定的色譜柱：Thermo Acclaim 120-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（14∶86）；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1；對(duì)照品與供試品進(jìn)樣體積：10 μL。

6-姜辣素測(cè)定的色譜柱：Thermo Acclaim 120-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-甲醇-水（40∶5∶55）；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1；對(duì)照品進(jìn)樣體積：8 μL；供試品進(jìn)樣體積：20 μL。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取芍藥苷，加甲醇將其定容至10 mL量瓶中，最后配制成213 μg·mL-1的芍藥苷對(duì)照品溶液。精密稱(chēng)取6-姜辣素，加純甲醇定容至10 mL量瓶，最后配制成21.325 μg·mL-1的6-姜辣素對(duì)照品溶液。

2.3.3 供試品溶液的制備

① 基準(zhǔn)樣品供試品溶液的制備：精密稱(chēng)取0.1 g凍干粉于10 mL量瓶中，加10 mL 25%甲醇溶液超聲30 min（250 W，40 kHz），放冷后，用25%甲醇溶液補(bǔ)足并定容，振勻后，靜置，取上清液，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

② 提取液供試品溶液的制備：取1個(gè)處方量的飲片，置于圓底燒瓶中，加適量水，回流70 min，300目尼龍篩網(wǎng)趁熱過(guò)濾，補(bǔ)足體積，精密移取1 mL提取液用水稀釋相應(yīng)倍數(shù)后離心，過(guò)濾，即得。

③ 陰性樣品溶液：逐個(gè)去除處方中缺味藥飲片，分別制備不含白芍和生姜的陰性樣品，制備陰性基準(zhǔn)樣品，按照①項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.3.4 線性關(guān)系考察 按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備998.4 μg·mL-1芍藥苷對(duì)照品溶液和230.2 μg·mL-16-姜辣素對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋成系列濃度的對(duì)照品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別對(duì)芍藥苷、6-姜辣素質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，得回歸方程芍藥苷：A＝0.2104C-0.9087，R2＝0.9999，線性范圍為19.97～998.4 μg·mL-1；6-姜辣素：A＝0.0733C＋0.0059，R2＝0.9998，線性范圍為2.302～230.2 μg·mL-1。

2.3.5 精密度考察 取供試品溶液1份，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得芍藥苷、6-姜辣素的峰面積的RSD值分別為 0.76%、1.2%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液于0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定芍藥苷、6-姜辣素的峰面積，計(jì)算RSD。由結(jié)果可知，芍藥苷和6-姜辣素的峰面積的RSD值分別為1.3%、0.37%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 按照供試品溶液的制備方法制備6個(gè)樣品，測(cè)得芍藥苷、6-姜辣素的峰面積及RSD值分別為2.3%、1.6%，說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收試驗(yàn) 取基準(zhǔn)樣品6份，每份0.05 g，分別精密加入1.3052 mg·mL-1的芍藥苷對(duì)照品溶液1 mL，0.0483 mg·mL-1的6-姜辣素對(duì)照品溶液1 mL，按“2.3.3”項(xiàng)下方法操作得到加樣供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得芍藥苷、6-姜辣素的平均加樣回收率分別為101.98%、97.78%，RSD值分別為3.0%、2.1%。

2.3.9 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 按照“2.3.3”項(xiàng)下方法分別制備陰性樣品溶液和全方供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖2與圖3。在此色譜條件下，可準(zhǔn)確測(cè)定全方中芍藥苷和6-姜辣素的含量而無(wú)干擾。

圖2 真武湯中白芍成分的HPLC圖Fig 2 HPLC of paeonia lactiflora in Zhenwu decoction

圖3 真武湯中生姜成分的HPLC圖Fig 3 HPLC of ginger components in Zhenwu decoction

2.4 出膏率測(cè)定

2.4.1 基準(zhǔn)樣品出膏率的測(cè)定 根據(jù)前期研究[6]稱(chēng)取處方量飲片于陶瓷砂鍋內(nèi)，加水1600 mL，煎煮約70 min后，用一層300目尼龍篩網(wǎng)趁熱（約80℃）過(guò)濾，濾液放涼后加水調(diào)整體積至600 mL。分取一半的水煎液（300 mL）以600 W濃縮至合適程度時(shí)，于水浴鍋濃縮成稠膏狀后，置于真空干燥箱，60℃干燥，稱(chēng)重，計(jì)算出膏率。

出膏率（%）＝干膏質(zhì)量/生藥質(zhì)量×100%。

2.4.2 提取液出膏率的測(cè)定 將提取液于水浴鍋濃縮至稠膏狀后，置于60℃真空干燥箱中，3 d后取出，稱(chēng)重，折算，按上述公式計(jì)算出膏率。

2.5 單因素試驗(yàn)

以芍藥苷、6-姜辣素含量及出膏率為考察指標(biāo)，固定提取次數(shù)1次，提取時(shí)間為1.5 h，加水倍量分別為8、10、15倍進(jìn)行加水倍量單因素試驗(yàn)考察；固定提取次數(shù)為1次，提取加水倍量為10倍，提取時(shí)間為 1、1.5、2 h 進(jìn)行提取時(shí)間單因素試驗(yàn)考察；固定提取加水倍量為10倍，提取時(shí)間為1.5 h，進(jìn)行提取1、2、3次單因素考察，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同加水倍量、提取時(shí)間以及提取次數(shù)下芍藥苷、6-姜辣素含量及出膏率柱狀圖Fig 4 Histograms of paeoniflorin and 6-gingerol content and paste yield at different times of water addition，extraction time and number of extractions

由圖4可知，隨著加水倍量的增加，提取液中芍藥苷的含量先增加后降低，6-姜辣素含量與出膏率增加漸緩，所以將響應(yīng)面加水倍量的高水平設(shè)定為15倍。隨著提取時(shí)間從1 h增加到2 h，芍藥苷含量先增加后減少，6-姜辣素含量與出膏率增加趨勢(shì)逐漸變小，所以將提取時(shí)間的高水平設(shè)定為2 h。隨著提取次數(shù)的增加，芍藥苷含量逐漸降低到基本不變，6-姜辣素含量與出膏率增加趨勢(shì)較緩，最后基本不變。所以將提取次數(shù)高水平設(shè)定為3次。

2.6 Box-Behnken設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化真武湯提取工藝

2.6.1 因素水平設(shè)計(jì) 基于以上分析，選取提取時(shí)間A（X1），加水倍量B（X2），提取次數(shù) C（X3）三因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以?xún)蓚€(gè)指標(biāo)成分含量（Y1：芍藥苷含量；Y2：6-姜辣素含量）和出膏率（Y3）為CQAs，采用 Design Expert 13.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析，篩選出最佳提取工藝。最后，選擇三個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，進(jìn)行已建立模型的驗(yàn)證。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平Tab 1 Factor and level of Box-Behnken design

2.6.2 試驗(yàn)結(jié)果 17組試驗(yàn)提取液中指標(biāo)性成分含量和出膏率結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 17組試驗(yàn)提取液中指標(biāo)性成分含量和出膏率結(jié)果Tab 2 Content of index components and paste yield in 17 groups of test extracts

2.6.3 模型建立與評(píng)價(jià) 根據(jù)表2結(jié)果，采用多項(xiàng)式及一項(xiàng)式回歸模型對(duì)芍藥苷含量、6-姜辣素含量、出膏率及對(duì)應(yīng)的因素（提取加水倍量、提取時(shí)間、提取次數(shù)）分別進(jìn)行擬合，回歸方程如下：Y1（芍藥苷）＝0.73-0.063X1＋0.0965X2＋0.098X3＋0.045X1X2-0.10X1X3-0.077X2X3＋0.091X12＋0.16X22＋0.019X32-0.047X12X2-0.16X12X3-0.24X1X22；

Y2（6-姜辣素）＝0.082＋0.006X1＋0.004X2＋0.013X3；

Y3（出膏率）＝19.93＋0.1675X1＋1.32X2＋4.23X3-0.55X1X2-2.42X1X3-0.75X2X3-0.2817X12＋0.4158X22-0.9268X32-0.1850X12X2-2.69X12X3＋0.1725X1X22。

分別應(yīng)用不同的回歸類(lèi)型對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3～5，芍藥苷含量和出膏率的回歸總模型的方差顯著（P＜0.05），6-姜辣素的一項(xiàng)式回歸總模型的方差顯著（P＜0.05）；所建三個(gè)模型均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Y1（芍藥苷含量）和Y3（出膏率）二方程的R2分別為0.9849、0.9902，Y2（6-姜辣素含量）的R2＝0.6102，因此三個(gè)回歸方程均可用于后期的試驗(yàn)。

表3 芍藥苷含量的方差分析Tab 3 Variance analysis of paeoniflorin content

表4 6-姜辣素含量的方差分析Tab 4 Variance analysis of 6-gingerol content

表5 出膏率的方差分析Tab 5 Variance analysis of paste yield

2.6.4 芍藥苷含量的響應(yīng)面分析 芍藥苷含量的等高線和3D圖如圖5所示，在圖5A中，當(dāng)提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，提取次數(shù)的等高線密度超過(guò)了加水倍量，說(shuō)明提取次數(shù)對(duì)芍藥苷含量的影響更大。在圖5B中，當(dāng)提取次數(shù)固定為2次時(shí)，提取時(shí)間的等高線密度高于加水倍量，因此可以得出提取時(shí)間對(duì)于芍藥苷的含量影響較大。圖5C描述了當(dāng)提取加水倍量為11.5倍時(shí)，提取次數(shù)的等高線密度高于提取時(shí)間，因此可以得出提取次數(shù)對(duì)芍藥苷含量的影響更大。在給定的變量范圍內(nèi)，芍藥苷含量受到三個(gè)因素的影響程度，其中提取次數(shù)對(duì)其影響最大，其次是提取時(shí)間，而加水倍量對(duì)其影響較小，這一結(jié)論與方差分析的結(jié)果一致。

圖5 各因素交互作用對(duì)芍藥苷含量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig 5 Response surface and contour plot of the effect of factor interaction on the content of paeoniflorin

2.6.5 6-姜辣素含量的響應(yīng)面分析 6-姜辣素含量的等高線和3D圖分析見(jiàn)圖6，在給定的變量范圍內(nèi)，6-姜辣素含量受到三個(gè)因素的影響程度，其中提取次數(shù)對(duì)其影響最大，其次是提取加水倍量，而提取時(shí)間對(duì)其影響較小，與方差結(jié)果基本一致。在圖6A中，當(dāng)提取時(shí)間為1 h時(shí)，提取次數(shù)的等高線密度大于提取加水倍量，從而，提取次數(shù)對(duì)6-姜辣素的含量影響有很大的影響；在圖6B中，當(dāng)提取次數(shù)固定在2次時(shí)，提取加水倍量的等高線密度比提取時(shí)間要大，所以，提取加水倍量對(duì)于6-姜辣素的含量影響較大。

圖6 各因素交互作用對(duì)6-姜辣素含量的影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig 6 Response surface and contour plot of the effect of factor interaction on the content of 6-gingerol

2.6.6 出膏率的響應(yīng)面分析 出膏率的響應(yīng)面及等高線分析見(jiàn)圖7，在指定變量范圍內(nèi)，三個(gè)變量對(duì)出膏率的影響中，提取次數(shù)最大，其次是提取時(shí)間，提取加水倍量影響最小，與方差結(jié)果分析基本一致。如圖7A所示，當(dāng)提取時(shí)間固定為1.5 h時(shí)，提取次數(shù)等高線密度大于提取加水倍量，因此，提取次數(shù)對(duì)于出膏率的影響更大；在圖7B中，當(dāng)提取次數(shù)固定為2次時(shí)，提取時(shí)間的等高線密度高于提取加水倍量，因此可以得出提取時(shí)間對(duì)出膏率影響更大。在圖7C中，當(dāng)提取加水倍量固定為11.5倍時(shí)，提取次數(shù)等高線密度要比提取時(shí)間更高，所以，提取次數(shù)對(duì)出膏率影響更大。

圖7 各因素交互作用對(duì)出膏率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig 7 Response surface and contour plot of the effect of factor interaction on the paste yield

2.7 設(shè)計(jì)空間的建立及驗(yàn)證

2.7.1 設(shè)計(jì)空間的建立 前期研究表明基準(zhǔn)樣品標(biāo)準(zhǔn)中芍藥苷的含量在0.5150%～ 0.8811%，6-姜辣素的含量在0.0198%～ 0.0337%，研究設(shè)定優(yōu)化目標(biāo)為該標(biāo)準(zhǔn)范圍再分別加上前期預(yù)試驗(yàn)濃縮干燥過(guò)程芍藥苷和6-姜辣素的損失率，因此最終設(shè)定優(yōu)化目標(biāo)為芍藥苷含量為0.7357%～1.2587%；6-姜辣素含量為0.0396%～0.0674%；出膏率為10.00%～14.85%。在優(yōu)化的工藝參數(shù)空間內(nèi)搜集所有符合設(shè)定目標(biāo)的參數(shù)，構(gòu)建出設(shè)計(jì)空間并用Overlay Plot進(jìn)行展示，結(jié)果如圖8所示。黃色部分即為提取工藝的可優(yōu)化控制空間。因此將真武湯的提取工藝范圍定為：提取加水量8～10.39倍；提取時(shí)間60～100 min；提取次數(shù)固定為1次。

圖8 真武湯提取工藝的設(shè)計(jì)空間Fig 8 Design space of Zhenwu decoction extraction process

2.7.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 為驗(yàn)證響應(yīng)面結(jié)果的可靠性，在設(shè)定的優(yōu)化工藝參數(shù)空間內(nèi)搜集符合目標(biāo)的組別，選取設(shè)計(jì)空間內(nèi)的三個(gè)點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，根據(jù)實(shí)際情況對(duì)組別中的提取工藝參數(shù)調(diào)整如表6所示，按照調(diào)整后的提取參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，每組平行3份，驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)表7。按照提取工藝進(jìn)行提取后，其結(jié)果均能達(dá)到預(yù)測(cè)值，表明在優(yōu)化工藝參數(shù)空間內(nèi)驗(yàn)證的這幾組均能達(dá)到提取工藝的預(yù)期目標(biāo)。考慮到實(shí)際生產(chǎn)問(wèn)題及便于操作，因此后期采用第三組的工藝參數(shù)進(jìn)行提?。禾崛〖铀读?0倍，提取時(shí)間60 min，提取次數(shù)1次。

表6 響應(yīng)面設(shè)計(jì)空間試驗(yàn)點(diǎn)的選取Tab 6 Selection of spatial test points for response surface design

表7 響應(yīng)面試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果Tab 7 Verification test of response surface

3 討論

按照《古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑及其物質(zhì)基準(zhǔn)的申報(bào)資料要求（征求意見(jiàn)稿）》，繪制特征圖譜并對(duì)指標(biāo)性成分含量和浸出物進(jìn)行檢測(cè)應(yīng)作為CQAs來(lái)檢驗(yàn)基準(zhǔn)樣品和顆粒劑間的量值傳遞關(guān)系[7]，前期研究顯示，基準(zhǔn)樣品指紋圖譜相似度均在0.9以上，相似度良好[6]，因此不再以此作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，芍藥苷為白芍的主要成分，6-姜辣素為生姜的主要成分，出膏率對(duì)提取液亦有顯著影響，故選取芍藥苷、6-姜辣素和出膏率作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

在由傳統(tǒng)砂鍋煎煮向現(xiàn)代提取工藝轉(zhuǎn)化過(guò)程中，改變工藝參數(shù)常導(dǎo)致指標(biāo)性成分含量大幅改變。所以對(duì)制備工藝特別是提取工藝進(jìn)行研究，是經(jīng)典名方研制過(guò)程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。在QbD理念下，認(rèn)識(shí)原料、工藝與產(chǎn)品質(zhì)量多維組合及相互作用，從而可以達(dá)到對(duì)產(chǎn)品CQAs的預(yù)測(cè)[2]，QbD理念應(yīng)用的一個(gè)關(guān)鍵是設(shè)計(jì)空間的構(gòu)建[8]。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇三因素三水平并使用響應(yīng)面法，采用多元回歸方程擬合各因素與效應(yīng)值的函數(shù)，并以最佳工藝水平為目標(biāo)，對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)與優(yōu)選[9-13]，將芍藥苷與6-姜辣素的含量及出膏率均設(shè)置在一定的范圍之內(nèi)，對(duì)設(shè)計(jì)空間進(jìn)行篩選，可有效地對(duì)試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，并為后續(xù)真武湯顆粒劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供了可控范圍。

前期考察發(fā)現(xiàn)在提取-濃縮-干燥過(guò)程中，芍藥苷和6-姜辣素均具有較高的損失率，可能是高溫影響芍藥苷穩(wěn)定性的原因[14]。6-姜辣素在高溫條件下會(huì)轉(zhuǎn)化為醛類(lèi)物質(zhì)，并且還會(huì)受到合劑水溶液環(huán)境的影響[15]。因此在考察提取時(shí)間時(shí)充分考慮了指標(biāo)性成分損失率高的實(shí)際情況，選取2 h為高水平。并且添加到設(shè)計(jì)空間優(yōu)化的目標(biāo)條件中，以便使該制劑間體與基準(zhǔn)樣品質(zhì)量屬性接近。

4 結(jié)論

本研究基于QbD理念，通過(guò)失效模式及效應(yīng)分析（FMEA）進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，結(jié)合經(jīng)驗(yàn)篩選工藝參數(shù)，進(jìn)一步采用Box-Behnken優(yōu)化真武湯提取工藝，建立其設(shè)計(jì)空間，最終確定的提取工藝為：提取加水倍量10倍、提取時(shí)間60 min、提取次數(shù)1次。驗(yàn)證試驗(yàn)證明，該工藝參數(shù)正在確立中的設(shè)計(jì)空間發(fā)生了變化，產(chǎn)品仍然可以實(shí)現(xiàn)預(yù)期目標(biāo)，為后續(xù)顆粒劑的干燥、濃縮、成型工藝奠定基礎(chǔ)。