朱國梁，羅順，張曉瑩（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 20012；2.南通市海門長三角藥物高等研究院，江蘇 南通 2261；.澳斯康生物（南通）股份有限公司，江蘇 南通 226100）

近年來治療性抗體藥物迅速發(fā)展，廣泛應(yīng)用于癌癥、自身免疫性疾病、傳染病等的治療。大多數(shù)抗體藥物是一類以γ型免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）形式存在的治療性糖蛋白，通常在哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)。中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細(xì)胞具有生長穩(wěn)定、適合大規(guī)模培養(yǎng)、對人類病毒敏感以及對人類細(xì)胞的類似翻譯后修飾的特性，是生產(chǎn)重組抗體的常用宿主細(xì)胞[1-2]。

提高CHO細(xì)胞培養(yǎng)性能，對降低抗體藥物的生產(chǎn)成本至關(guān)重要，優(yōu)化細(xì)胞株和工藝開發(fā)是提高抗體產(chǎn)量和質(zhì)量的重點(diǎn)[3]，可采用基因工程[4-5]、優(yōu)化培養(yǎng)基、改進(jìn)補(bǔ)料策略[6]、使用添加劑等?？贵w藥物的翻譯后修飾對其質(zhì)量和功能具有重要影響，糖基化是一種常見且復(fù)雜的修飾方式，被廣泛認(rèn)為是抗體藥物關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attributes，CQA）之一，與藥效學(xué)特性、免疫原性、穩(wěn)定性等具有密切聯(lián)系[7]。

許多培養(yǎng)基添加劑可有效地提高CHO細(xì)胞培養(yǎng)中抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量，如短鏈脂肪酸丁酸鈉（NaBu）可有效促進(jìn)CHO細(xì)胞培養(yǎng)過程中抗體的生物合成[8-9]；金屬陽離子對CHO細(xì)胞的生長、抗體的表達(dá)及糖基化具有重要的影響，如添加0.25～1.0 μmol·L-1氯化錳（MnCl2）可以有效降低Man5水平，并維持G0F、G1F和G2F等主要糖型的含量[10]；鋅離子可增加mRNA穩(wěn)定性并發(fā)揮抗凋亡和抗氧化作用，添加超過30 μmol·L-1的鋅離子可以有效提高CHO細(xì)胞培養(yǎng)過程中的抗體表達(dá)[11-12]。本實(shí)驗(yàn)旨在探究NaBu、MnCl2和硫酸鋅（ZnSO4）組合使用對CHO細(xì)胞的生長、抗體表達(dá)和糖基化的影響，以期提高抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

本實(shí)驗(yàn)采用可穩(wěn)定表達(dá)CD40/PD-L1的IgG1型雙特異性抗體的CHO細(xì)胞株，細(xì)胞株來源于澳斯康生物（南通）股份有限公司。

1.2 試藥

Dynamis培養(yǎng)基、抗結(jié)團(tuán)劑（Anti-Clumping Agent，ACA）（美國Gibco公司）；Cell Boost 5、Cell Boost 7a、Cell Boost 7b補(bǔ)料（美國Hyclone公司）；L-谷氨酰胺（美國Sigma公司）；MnCl2（批號：C12791111，中國Macklin公司）；ZnSO4（批號：JSB0483107）、NaBu溶液（批號：20007038BLM）（中國甘肅健順生物科技有限公司）；肽N-糖苷酶F（美國New England Biolabs公司）；Glycoworks RapiFluor糖分析試劑盒（美國Waters公司）。所有溶液均按照說明書使用純化水配制，純化水由澳斯康生物（南通）股份有限公司制備。

1.3 儀器

無菌細(xì)胞培養(yǎng)管（美國TPP公司）；搖瓶（美國Corning公司）；Vanquish UPLC系統(tǒng)（美國Thermo Fisher公司）；二氧化碳搖床（瑞士Kuhner公司）；Vi-Cell XR細(xì)胞活力分析儀（美國Beckman Coulter公司）；Bioprofile 400生化分析儀（美國Nova Biomedical公司）；E2695 HPLC系統(tǒng)（美國Waters公司）。

2 方法

2.1 方案設(shè)計(jì)

利用JMP 13.0軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)-中心復(fù)合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，錳離子（X1）、鋅離子（X2）、丁酸鈉（X3）作為X因子，收獲時(shí)細(xì)胞活率（Y1）、抗體產(chǎn)量（Y2）、細(xì)胞特異性生產(chǎn)力（Y3）、Man5糖型含量（Y4）作為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)次數(shù)為16；每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果如表1所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案和結(jié)果Tab 1 Experimental scheme and results of response surface design

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

取適量處于對數(shù)生長期的細(xì)胞于50 mL TPP管中，在200 g離心力條件下離心5 min后去上清液，用含4 mmol·L-1谷氨酰胺、2.5% Cell Boost 5和0.5% ACA的Dynamis培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，使細(xì)胞密度為（0.5±0.2）×106cells·mL-1，工作體積為25 mL，并將其放置于二氧化碳搖床中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。搖床條件為：37℃、濕度80%、5%CO2、200 r·min-1，振幅50 mm。培養(yǎng)至Day3（接種時(shí)為Day0）時(shí)隔日測樣并將葡萄糖濃度補(bǔ)充至7 g·L-1，分別于Day 3、Day 5、Day 7、Day 9、Day 11流加4% Cell Boost 7a和0.4% Cell Boost 7b；MnCl2和ZnSO4于Day3時(shí)按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案加入細(xì)胞液中；培養(yǎng)至Day5時(shí)，加入NaBu，并將培養(yǎng)溫度從37℃降至33℃；培養(yǎng)至Day14時(shí)，將細(xì)胞液離心后，取上清液放至-80℃冰箱保存待用。

2.3 檢測和抗體純化

細(xì)胞密度和細(xì)胞活率利用Vi-Cell XR細(xì)胞活力分析儀分析；葡萄糖濃度、乳酸濃度、NH4＋濃度等利用Bioprofile 400生化分析儀分析；上清液中抗體產(chǎn)量使用Protein A-HPLC親和色譜法測定；抗體的純化采用1 mL HiTrap Protein A HP（GE Healthcare）親和層析柱；抗體糖基化檢測采用Vanquish UPLC串聯(lián)熒光檢測器，色譜柱為ACQUITY UPLC Glycan BEH Amide Column（2.1 mm×150 mm，1.7 μm）。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用JMP 13.0軟件對模型進(jìn)行擬合分析，運(yùn)行特質(zhì)和重點(diǎn)分別為標(biāo)準(zhǔn)最小二乘法和效應(yīng)篩選，通過均方根誤差（RMSE）、決定系數(shù)（Rsq）和P值評估模型的預(yù)測性能、擬合程度以及統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RMSE越小表示模型的預(yù)測結(jié)果越接近實(shí)測值，Rsq越接近1表示模型擬合程度越好，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；顯著性差異分析利用SPSS 26.0軟件單因素分析ANOVA檢驗(yàn)計(jì)算；作圖采用Origin2021軟件。

3 結(jié)果

3.1 響應(yīng)面-中心復(fù)合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)

3.1.1 培養(yǎng)基添加劑對收獲時(shí)細(xì)胞活率的影響三種培養(yǎng)基添加劑對收獲時(shí)細(xì)胞活率的影響結(jié)果見圖1和表2。收獲時(shí)細(xì)胞活率的預(yù)測值-實(shí)測值的擬合結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)擬合參數(shù)估計(jì)值對各個(gè)項(xiàng)進(jìn)行分析，其中鋅離子和丁酸鈉對收獲時(shí)細(xì)胞活率的影響差異具有統(tǒng)計(jì)意義（P＜0.05），其余各項(xiàng)、交互項(xiàng)和二次項(xiàng)作用差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。從圖2中可以看出鋅離子和丁酸鈉與收獲時(shí)細(xì)胞活率都成負(fù)相關(guān)，丁酸鈉濃度從250 μmol·L-1提高到1250 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞活率降低10%～15%；鋅離子濃度從30 μmol·L-1提高到120μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞活率降低7%左右。

圖1 收獲時(shí)細(xì)胞活率預(yù)測值-實(shí)測值關(guān)系圖Fig 1 Predicted value-measured value of cell viability at harvest

圖2 收獲時(shí)細(xì)胞活率響應(yīng)曲面圖Fig 2 Response surface plot of cell viability at harvest

表2 收獲時(shí)細(xì)胞活率參數(shù)估計(jì)值Tab 2 Estimates of fitting parameters for cell viability at harvest

3.1.2 培養(yǎng)基添加劑對抗體產(chǎn)量的影響 三種培養(yǎng)基添加劑對抗體產(chǎn)量的影響結(jié)果見圖3和表3?？贵w產(chǎn)量的預(yù)測值-實(shí)測值的擬合結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。根據(jù)擬合參數(shù)估計(jì)值對各個(gè)項(xiàng)進(jìn)行分析，錳離子和丁酸鈉對抗體產(chǎn)量的影響差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余因子和因子之間不存在交互作用和二次項(xiàng)（P＞0.05）。如圖4顯示，丁酸鈉濃度從250 μmol·L-1增加到1250μmol·L-1時(shí)，抗體產(chǎn)量下降大約33%；將錳離子濃度從100 nmol·L-1提高到1200 nmol·L-1時(shí)，抗體產(chǎn)量呈先上升后略微下降的趨勢，當(dāng)濃度為1100 nmol·L-1時(shí)，抗體產(chǎn)量達(dá)到最高。

圖3 抗體產(chǎn)量的預(yù)測值-實(shí)測值關(guān)系圖Fig 3 Predicted value-measured value of antibody production

圖4 抗體產(chǎn)量響應(yīng)曲面圖Fig 4 Response surface plot of antibody production

表3 抗體產(chǎn)量參數(shù)估計(jì)值Tab 3 Estimates of fitting parameters for antibody production

3.1.3 培養(yǎng)基添加劑對細(xì)胞特異性生產(chǎn)力的影響

三種培養(yǎng)基添加劑對細(xì)胞特異性生產(chǎn)力的影響結(jié)果如圖5和表4所示。細(xì)胞特異性生產(chǎn)力的預(yù)測值-實(shí)測值的擬合結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通過擬合參數(shù)估計(jì)值對各個(gè)項(xiàng)進(jìn)行分析可知，錳離子和丁酸鈉對細(xì)胞特異性生產(chǎn)力的影響差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），鋅離子及其他各交互項(xiàng)、二次項(xiàng)之間與細(xì)胞特異性生產(chǎn)力差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由圖6可知，錳離子對細(xì)胞特異生產(chǎn)力影響呈曲線反應(yīng)，當(dāng)錳離子濃度為900 nmol·L-1左右時(shí)達(dá)到最大，細(xì)胞特異性生產(chǎn)力提高約14%；丁酸鈉在250～1250 μmol·L-1內(nèi)與細(xì)胞特異生產(chǎn)力成負(fù)相關(guān)，當(dāng)丁酸鈉濃度為1250 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞特異性生產(chǎn)力降低了25%；鋅離子濃度在30～120 μmol·L-1時(shí)對細(xì)胞特異生產(chǎn)力的影響不明顯。

圖5 細(xì)胞特異性生產(chǎn)力的預(yù)測值-實(shí)測值關(guān)系圖Fig 5 Predicted value-measured value of cell specific productivity

圖6 細(xì)胞特異生產(chǎn)力響應(yīng)曲面圖Fig 6 Response surface plot of cell specific productivity

表4 細(xì)胞特異性生產(chǎn)力參數(shù)估計(jì)值Tab 4 Estimates of fitting parameters for cell specific productivity

3.1.4 培養(yǎng)基添加劑對Man5糖型含量的影響 三種培養(yǎng)基添加劑對Man5糖型含量的影響如圖7和表5所示。Man5糖型含量的預(yù)測值-實(shí)測值的擬合結(jié)果表明該模型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。通過擬合參數(shù)估計(jì)值對各個(gè)項(xiàng)進(jìn)行分析表明除了錳離子和丁酸鈉對Man5糖型含量不存在交互作用外，其他單因子，雙因子交互作用以及二次項(xiàng)都對Man5糖型含量影響均差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。從圖8可知，錳離子濃度低于900 nmol·L-1，鋅離子濃度低于100 μmol·L-1和丁酸鈉濃度低于800 μmol·L-1時(shí)，與Man5糖型含量成負(fù)相關(guān)。但是大于這些濃度時(shí)，與Man5糖型含量成正相關(guān)。

圖7 Man5含量預(yù)測值-實(shí)測值關(guān)系圖Fig 7 Predicted value-measured value of Man5 percent

圖8 Man5含量響應(yīng)面圖Fig 8 Response surface plot of Man5 percent

表5 Man5含量參數(shù)估計(jì)值Tab 5 Estimates of fitting parameters for Man5 percent

3.2 設(shè)計(jì)空間

丁酸鈉的添加量越大活率下降越為明顯，會降低抗體的產(chǎn)量，為了盡可能地提高抗體產(chǎn)量，因此選擇設(shè)置丁酸鈉的濃度為最小量250 μmol·L-1，目標(biāo)抗體產(chǎn)量大于5.2 g·L-1，Man5糖型含量低于5%。通過使用JMP軟件等高線刻畫器功能對實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行刻畫，鋅離子和錳離子的濃度設(shè)計(jì)空間如圖9所示，圖中空白部分即為可滿足條件的添加量，當(dāng)錳離子、鋅離子和丁酸鈉濃度分別為1000 nmol·L-1、30 μmol·L-1和250 μmol·L-1時(shí)抗體產(chǎn)量達(dá)到最大化，此時(shí)即為最佳添加量，在此條件下收獲時(shí)細(xì)胞活率的預(yù)測值為81.8%，抗體產(chǎn)量的預(yù)測值為5.21 g·L-1，細(xì)胞特異性生產(chǎn)力的預(yù)測值為21.68 pg·d-1，Man5糖型含量的預(yù)測值為3.79%。

圖9 設(shè)計(jì)空間模型Fig 9 Design space model

3.3 模型驗(yàn)證

根據(jù)上述設(shè)計(jì)空間參數(shù)，對最優(yōu)添加條件進(jìn)行驗(yàn)證，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組（Test）和對照組（Control），對照組不含錳離子、鋅離子和丁酸鈉，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)圖10可知，培養(yǎng)后期實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞密度和活率都顯著高于對照組，活細(xì)胞峰值密度達(dá)到了25.23×106cells·mL-1，比對照組提高了11.8%；在培養(yǎng)過程中乳酸的積累低于對照組，如圖11，這更有利于細(xì)胞的生長和抗體的表達(dá)，最終抗體的產(chǎn)量達(dá)到5.21 g·L-1，比對照組提高了14.5%。抗體糖基化變化如圖12所示，與對照組相比，Man5和G0F含量有所減少，其中Man5含量減少了28.9%，其余糖型含量均有所提升。實(shí)驗(yàn)組中的收獲時(shí)細(xì)胞活率、抗體產(chǎn)量、細(xì)胞特異生產(chǎn)力和Man5糖型含量均與預(yù)測結(jié)果接近，表明模型真實(shí)有效。

圖10 細(xì)胞活力曲線Fig 10 Cell viability curve

圖11 乳酸含量變化曲線Fig 11 Lactic acid content change curve

圖12 抗體糖基化修飾Fig 12 Antibody glycosylation modification

4 討論

在動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基添加劑在抗體的表達(dá)和質(zhì)量等方面起著不可或缺的作用，通過使用小分子添加劑來提高抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量，可大幅降低抗體藥物的生產(chǎn)成本，本實(shí)驗(yàn)用表達(dá)雙特異性抗體的CHO細(xì)胞作為研究對象，探究錳離子、鋅離子和丁酸鈉組合使用對細(xì)胞生長、抗體表達(dá)和Man5糖型含量的影響，通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)并建立回歸模型，結(jié)果預(yù)測值與實(shí)際值相近，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的有效性。

在流加培養(yǎng)的早期，細(xì)胞會迅速增殖，這種指數(shù)生長期通常會伴隨著葡萄糖大量消耗、酵解并會導(dǎo)致乳酸積累[13]，這種乳酸的積累會對細(xì)胞生長和生產(chǎn)力產(chǎn)生不利影響[14]，本實(shí)驗(yàn)中，在添加30 μmol·L-1鋅離子、250 μmol·L-1丁酸鈉的條件下，錳離子濃度從100 nmol·L-1提高到1000 nmol·L-1時(shí)，不僅減少了乳酸的積累，細(xì)胞活率和細(xì)胞密度均有所提升，抗體表達(dá)量提高了10.6%，比對照組提高了14.5%，在保持相同培養(yǎng)周期的情況下，成功實(shí)現(xiàn)了抗體產(chǎn)量的提高，這一成果對于提高生物制藥生產(chǎn)效率具有顯著的意義，并在降低生產(chǎn)成本方面發(fā)揮著重要作用，這一研究成果不僅對于提升CHO細(xì)胞生產(chǎn)抗體的能力具有重要啟示，同時(shí)也為其他生物制藥相關(guān)的研究和應(yīng)用提供了有價(jià)值的參考。鋅離子和丁酸鈉的加入均抑制了細(xì)胞的生長，也降低了細(xì)胞的活率，進(jìn)而影響了抗體的表達(dá)，這與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[15-16]，然而并沒有發(fā)現(xiàn)鋅離子和丁酸鈉對細(xì)胞特異性生產(chǎn)力有明顯的提升，這可能與細(xì)胞株對這兩種物質(zhì)較為敏感和外源蛋白的特性有關(guān)，也可能是培養(yǎng)工藝、培養(yǎng)參數(shù)等對實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了不同的結(jié)果。

當(dāng)糖蛋白通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）時(shí)，高甘露寡糖的還原端被α-甘露糖苷酶-Ⅰ在內(nèi)的多種酶剪切而形成Man5，ER修飾過程是糖蛋白正確折疊（包括正確的二硫鍵形成）的一種特殊而復(fù)雜的機(jī)制，聚糖結(jié)構(gòu)在這過程被各種折疊蛋白和糖苷酶作為識別序列，并通過ER相關(guān)機(jī)制導(dǎo)致糖蛋白的再折疊或降解[17]，而錳離子是參與N-鏈接聚糖合成的幾種糖基轉(zhuǎn)移酶的重要輔助因子，它的含量會影響各糖苷酶的活性從而影響細(xì)胞內(nèi)糖基化通量[18]。在本研究中，添加1000 nmol·L-1錳離子，Man5糖型含量有較為明顯地降低，這與Pacis等[10]的研究結(jié)果一致。也有研究表明，在CHO細(xì)胞培養(yǎng)過程中補(bǔ)充過量的錳離子時(shí)會表現(xiàn)出不同的糖鏈構(gòu)象，如在CHO-K1細(xì)胞株培養(yǎng)過程中添加40 μmol·L-1錳鹽時(shí)，G1F糖型含量增加，G0和G0F糖型減少[19]，本研究中也觀察到了G1F糖型含量的增加和G0F糖型含量的減少，但提高了G0糖型含量，同時(shí)G1F’和G2F糖型含量也有所提升，這可能是鋅離子和丁酸鈉共同影響了糖基化的結(jié)果，后續(xù)將繼續(xù)研究這些物質(zhì)對其他糖型的影響。

為優(yōu)化培養(yǎng)性能，降低生產(chǎn)成本，商業(yè)培養(yǎng)基中添加微量金屬離子、丁酸鈉等培養(yǎng)基添加劑是必要的，這些添加劑的使用會影響細(xì)胞的生長狀態(tài)、抗體產(chǎn)量及糖基化。在生物藥行業(yè)，焦點(diǎn)聚集在如何最大限度地減少原料的可變性，從而提高治療性蛋白的產(chǎn)量和保持各批次間產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。糖基化作為CQA之一，可以顯著影響抗體的結(jié)構(gòu)和功能，其評估貫穿于開發(fā)的早期階段、產(chǎn)品表征和法規(guī)申報(bào)，因此研究培養(yǎng)基添加劑對抗體糖基化的影響具有重大意義。此外，培養(yǎng)時(shí)間、銨離子濃度、滲透壓等都會對抗體產(chǎn)量和糖基化造成影響。在CHO細(xì)胞培養(yǎng)的早期階段，細(xì)胞處于對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝的快速增長期，此時(shí)抗體產(chǎn)量可能較低，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞代謝逐漸穩(wěn)定，抗體的產(chǎn)量也會逐漸增加。然而，過長的培養(yǎng)時(shí)間可能會導(dǎo)致銨根離子堆積、滲透壓升高和細(xì)胞死亡，并且可能影響糖基化酶的活性和細(xì)胞內(nèi)的糖基化途徑，從而降低抗體產(chǎn)量和改變糖基化結(jié)果，進(jìn)一步深入研究這些因素的影響將極大地推動生物制藥產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步創(chuàng)新和發(fā)展。

5 結(jié)論

本研究運(yùn)用JMP軟件響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)-中心復(fù)合設(shè)計(jì)考察錳離子、鋅離子和丁酸鈉組合使用對CHO細(xì)胞的生長、抗體產(chǎn)量和Man5糖型含量的影響，結(jié)果表明，三種因子對CHO細(xì)胞的生長、抗體產(chǎn)量和Man5糖型含量的調(diào)控發(fā)揮著重要作用，控制三者間的添加濃度可有效提高抗體產(chǎn)量和優(yōu)化抗體糖型。