孟祎，趙伊君，薛志鵬，王寧，白吉慶，2*，王小平，2（.陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，陜西 咸陽 72046；2.陜西省中藥原料質(zhì)量監(jiān)測(cè)技術(shù)服務(wù)中心，陜西 咸陽 72046）

柳葉鼠李（RhamnuserythroxylumPallas）是鼠李科鼠李屬灌木樹種，稀喬木，高可達(dá)2 m，別名黑疙瘩、黑格鈴、紅木鼠李[1]，在《中華本草》《全國中草藥匯編》上均有記載，具有清熱除煩、消食化積之功效，但目前尚未有相關(guān)的臨床研究報(bào)道，主要分布在內(nèi)蒙古、青海、甘肅、陜西、河北、山西等省區(qū)，在海拔1200～2600 m山坡陰濕處或山谷灌叢中生長[2]。目前，國內(nèi)對(duì)柳葉鼠李的研究主要集中在季節(jié)變化[3]和生物活性[4]方面，為了深入對(duì)其研究，本研究首先對(duì)其進(jìn)行全面的化學(xué)成分解析。HPLC-Q-TOF-MS分析技術(shù)是現(xiàn)在中藥成分研究領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛的定性測(cè)定方法，可以盡可能地檢測(cè)出中藥所含的化學(xué)成分[5]，具有高速、高靈敏度以及高選擇性等特點(diǎn)[6]。本試驗(yàn)運(yùn)用HPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)柳葉鼠李的化學(xué)成分進(jìn)行鑒定分析，為柳葉鼠李的質(zhì)量控制以及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究提供依據(jù)。

1 材料

Vauquish Flex型超高效液相色譜系統(tǒng)、Q Exactive Orbitrap型質(zhì)譜儀、Direct-Q3 UV超純水一體機(jī)（美國Millipore公司），十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司，精度：0.01 mg），KQ-500DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），無水乙醇（天津市天力化學(xué)試劑有限公司），乙腈、甲酸均為分析純。

鼠李素（批號(hào)：PS220817-07）、異鼠李素（批號(hào)：PS010460）、柚皮素（批號(hào)：PS0240-0025MG）、山柰酚（批號(hào)：PS011676）、芹菜素（批號(hào)：PS010177）、槲皮苷（批號(hào)：PS010791）（純度均≥98%，成都普思生物科技股份有限公司）；秦皮素（純度≥98.0%，批號(hào)：111731-200501）、蘆丁（純度≥90.5%，批號(hào)：100080-200707）、秦皮乙素（純度≥98.0%，批號(hào)：110741-200506）、槲皮素（純度≥ 96.5%，批號(hào)：100081-200907）、木犀草素（純度≥ 98.0%，批號(hào)：111520-202107）（中國食品藥品檢定研究院）。

柳葉鼠李采于陜西省富縣蔣家村，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王薇教授鑒定為鼠李科植物柳葉鼠李RhamnuserythroxylumPallas的葉（標(biāo)本存放于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源普查樣本儲(chǔ)藏室，標(biāo)本號(hào)：20210812LY）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的配制

精密稱取柳葉鼠李粉末2 g，加入60%乙醇50 mL置玻璃瓶中，超聲提取40 min（功率80 W，頻率45 kHz），冷卻后，經(jīng) 0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液備用，即為供試品溶液。

2.2 混合對(duì)照品溶液的配制

精密稱取適量各對(duì)照品，用60%乙醇溶解并定容，用0.22 μm微孔膜過濾，得混合對(duì)照品溶液（鼠李素、異鼠李素、柚皮素、秦皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素、槲皮苷、蘆丁、秦皮乙素、槲皮素質(zhì)量濃度分別為0.09、0.22、0.17、0.15、0.09、0.13、0.38、0.09、1.05、0.16、0.11 mg·mL-1）。

2.3 色譜-質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 色譜柱為BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫：0～1.5 min，5%B；1.50～15 min，5%～75%B；15～20 min，75%～95%B；20～26 min，95%B；26～26.1 min，95%～5%B；26.1～30 min，5%B，體積流量0.3 mL·min-1；柱溫35℃，進(jìn)樣體積5 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 噴霧電壓3.5 kV，鞘氣流量45 arb，輔助氣流量10 arb，輔助加熱器溫度450℃，毛細(xì)管溫度275℃，掃描方式采用正、負(fù)離子Full-ddMS2模式。

2.4 結(jié)果

如圖1所示，通過 HPLC-Q-TOF-MS檢測(cè)，通過質(zhì)譜裂解碎片分析并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)[7-36]對(duì)照，在柳葉鼠李60%乙醇提取液中鑒定了138種化合物，結(jié)果如表1所示。

圖1 柳葉鼠李的 HPLC-Q-TOF-MS正離子模式（A）和負(fù)離子模式（B）總離子流圖Fig 1 Total ion chromatograms of HPLC-Q-TOF-MS by positive mode（A）and negative mode（B）for Rhamnus erythroxylum Pallas

表1 柳葉鼠李中化學(xué)成分解析結(jié)果Tab 1 Chemical constituents identified from the extracts of Rhamnus erythroxylum Pallas

續(xù)表1

2.4.1 黃酮類化合物的分析鑒定 黃酮類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物，以游離態(tài)或與糖結(jié)合為苷的形式存在[7]，由于普遍具有相同的基本骨架，因此通常表現(xiàn)出相似的質(zhì)譜裂解途徑[8]，黃酮及其苷類在裂解過程中容易發(fā)生糖苷鍵斷裂、C環(huán)的逆狄爾斯-阿爾德（RDA）裂解以及一氧化碳（CO）、二氧化碳（CO2）、水（H2O）等一些中性分子的丟失，本研究共鑒定或推斷出黃酮類化合物60個(gè)。

化合物59的裂解過程如圖2所示，化合物脫去了1分子鼠李糖產(chǎn)生的離子碎片峰m/z465.1018[M+H-Rha]＋，再失去1分子葡萄糖而得到的碎片離子峰m/z303.0497 [M+H-Rha-Glc]＋，也可以m/z303.0497碎片離子通過準(zhǔn)分子離子m/z610.3118 [M+H]＋失去多糖直接生成，根據(jù)參考文獻(xiàn)[9-10]，并與圖2對(duì)比，鑒定該化合物為蘆丁。例如化合物77，在tR＝6.613 min處檢測(cè)到化學(xué)式為C15H10O7，分子離子峰m/z303.0486 [M+H]＋。主要進(jìn)行兩種方式的裂解，裂解方式1為C環(huán)的RDA裂解，產(chǎn)生特征碎片離子m/z153.0183 [M+H-C8H6O3]＋，裂解方式2為丟失C7H6O3形成離子碎片m/z165.0183 [M+H-C7H6O3]＋，與文獻(xiàn)報(bào)道裂解方式一致[8，11]，故推測(cè)其為槲皮素，質(zhì)譜圖和裂解過程如圖3?；衔?05在負(fù)離子模式下，其準(zhǔn)分子離子峰m/z271.0619 [M-H]-，根據(jù)元素組成綜合分析預(yù)測(cè)可能的分子式為C15H12O5。母離子通過RDA裂解反應(yīng)，產(chǎn)生m/z151.0032碎片離子和119.0495的碎片離子，結(jié)合以上信息以及文獻(xiàn)研究[12]和質(zhì)譜裂解規(guī)律可知，此化合物為柚皮素，可能的裂解途徑見圖4。

圖4 柚皮素質(zhì)譜圖（A）及裂解規(guī)律（B）Fig 4 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of naringenin

2.4.2 有機(jī)酸類化合物的分析鑒定 根據(jù)液質(zhì)分析結(jié)果并參考相關(guān)文獻(xiàn)，該類化合物在負(fù)離子模式下有較高的響應(yīng)，大多具有很強(qiáng)的分子離子峰，由于結(jié)構(gòu)中包含羧基和酚羥基，因此質(zhì)譜裂解的過程中容易丟失H2O和-COOH，且易在羰基處斷裂形成碎片離子[13-14]。

化合物2在負(fù)離子模式下保留時(shí)間是1.011 min，準(zhǔn)分子離子峰是m/z135.0293 [M-H]-（C4H8O5），誤差為4.44，主要的特征碎片離子為m/z59.0127 [M-HC2H4O3]-，m/z75.0076 [M-H-C2H4O2]-，m/z89.0233[M-H-HCOOH]-，結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律，再結(jié)合參考文獻(xiàn)[15]，推測(cè)出化合物2為L-蘇糖酸（C4H8O5），質(zhì)譜圖見圖5。化合物52的保留時(shí)間為5.825 min，準(zhǔn)分子離子峰為m/z153.0189 [M-H]-（C7H6O4），特征碎片離子峰有m/z109.0287，是由準(zhǔn)分子離子峰失去1分子CO2產(chǎn)生的，通過質(zhì)譜裂解規(guī)律和文獻(xiàn)報(bào)道[16]，確定該化合物為原兒茶酸，可能的裂解規(guī)律如圖6所示?；衔?4的準(zhǔn)分子離子峰為m/z179.0350 [M-H]-，推測(cè)其分子式為C9H8O4。其二級(jí)碎片離子有m/z135.0445 [M-H-CO2]-，結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律和文獻(xiàn)報(bào)道[17-18]，推測(cè)其為咖啡酸，其可能的質(zhì)譜裂解途徑和質(zhì)譜圖如圖7。

圖5 L-蘇糖酸質(zhì)譜圖（A）及裂解規(guī)律（B）Fig 5 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of L-threonic acid

圖6 原兒茶酸質(zhì)譜圖（A）及裂解規(guī)律（B）Fig 6 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of protocatechuic acid

圖7 咖啡酸質(zhì)譜圖（A）及裂解規(guī)律（B）Fig 7 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of caffeic acid

2.4.3 氨基酸類化合物的分析鑒定 氨基酸為含有氨基和羧基的一類有機(jī)化合物，一般會(huì)丟失18、28、46，分別對(duì)應(yīng)母離子丟失H2O、CO、COOH2的特征碎片，有些氨基酸會(huì)丟失17即NH3?；衔?3，正離子給出準(zhǔn)分子離子峰m/z166.0860 [M+H]＋，保留時(shí)間是2.113 min，在TOF-MS/MS中，分子離子分別丟失1分子HCOOH和NH3形成m/z120.0812[M+H-HCOOH]＋的碎片離子和m/z103.0547 [M+HHCOOH-NH3]＋的基峰離子，根據(jù)參考文獻(xiàn)[19]，并推測(cè)其可能裂解途徑，見圖8。

圖8 L-苯丙氨酸質(zhì)譜圖（A）及裂解規(guī)律（B）Fig 8 Mass spectrum（A）and fragmentation pathway（B）of L-phenylalanine

3 討論

目前關(guān)于柳葉鼠李葉化學(xué)成分研究的報(bào)道比較少，化學(xué)成分相關(guān)研究還有很大空間。《中華本草》《全國中草藥匯編》等均有記載柳葉鼠李具有治療消化不良的作用，但具體起到治療疾病作用的成分是什么，并沒有相關(guān)的文獻(xiàn)記載，因此本研究首先采用HPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對(duì)柳葉鼠李化學(xué)成分進(jìn)行全面分析，共鑒定出138個(gè)化合物，但是具體起到治療作用的成分以及作用機(jī)制，仍需要通過藥效實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

HPLC-Q-TOF-MS技術(shù)作為鑒定中藥中復(fù)雜化合物的有效方法，克服了傳統(tǒng)中草藥提取分離方法耗時(shí)長、效率低的缺點(diǎn)，能夠在較短時(shí)間內(nèi)完成化學(xué)成分分析工作，避免了提取分離的煩瑣過程。本研究首次對(duì)柳葉鼠李葉中的化學(xué)成分進(jìn)行全面定性分析，為進(jìn)一步闡明葉鼠李葉的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制提供了方法依據(jù)。