羅珍華，宋成慧，李小川，張樞，張維維，李玉杰，段小群，徐笑天*（.桂林醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，廣西 桂林 5499；.蘇州旭輝檢測有限公司，江蘇 蘇州 56；.桂林醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)學(xué)院，廣西 桂林 5499）

7-乙基-10-羥基喜樹堿（SN-38）是一種高效的選擇性拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑[1]，由伊立替康在體內(nèi)經(jīng)過羧酸酯酶轉(zhuǎn)化的代謝產(chǎn)物，其活性較伊立替康強100～1000倍，是結(jié)直腸癌的一線化療藥物[2]。然而，SN-38的疏水性和不穩(wěn)定性限制了其臨床應(yīng)用[3]。研究表明SN-38在大鼠體內(nèi)的生物利用度較低[4]，這與其在體內(nèi)跟血漿蛋白的結(jié)合有關(guān)。

藥物的血漿蛋白結(jié)合率是藥代動力學(xué)的重要參數(shù)，是藥物臨床評價的必要指標(biāo)。常用的測定方法有平衡透析法、凝膠過濾法和離心超濾法等[5-6]。在前期試驗過程中發(fā)現(xiàn)采用離心超濾法預(yù)處理，對SN-38吸附性較強，凝膠過濾法操作較為煩瑣，且對于樣本量較大時不適用，而平衡透析法的主要優(yōu)點是可測定處于平衡狀態(tài)下的游離型藥物的濃度，可以最大限度反映藥物在體內(nèi)的情況，操作方便快捷，抗吸附能力較強，溫度易于控制，設(shè)備成本低廉，實驗原理簡單。研究表明SN-38與血漿中的蛋白結(jié)合率在90%以上[7-8]，實際上能真正發(fā)揮藥理作用的是不與血漿蛋白結(jié)合的游離藥物。目前，國內(nèi)多項研究采用LCMS/MS法測定SN-38的血藥濃度[9-10]，這些研究多是測定血漿中SN-38的總濃度，并不能準(zhǔn)確反映發(fā)揮藥理作用部分的游離SN-38濃度。本實驗以[2H5]SN-38為內(nèi)標(biāo)，優(yōu)化了實驗條件，采用平衡透析法分離出游離SN-38，建立平衡透析結(jié)合LC-MS/MS的檢測方法，用蛋白沉淀法預(yù)處理透析液側(cè)（F側(cè)）、透析后血漿側(cè)（T側(cè)）和血漿樣品檢測其SN-38 的濃度；根據(jù)公式計算得到大鼠體內(nèi)游離SN-38的濃度。該方法靈敏度高、簡單快速，可為開展臨床研究提供方法學(xué)的支持。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津）；API 4000、QTRAP 6500型質(zhì)譜（AB SCIEX.PTE.LTD.，其中API 4000型質(zhì)譜用于總SN-38濃度及T側(cè)SN-38濃度的測定，QTRAP 6500型質(zhì)譜用于F側(cè)SN-38濃度測定）；96孔平衡透析裝置（HTD 96 b-Complete Unit）、平衡透析膜（HTD 96 b-Adhesive Sealing Film）（HTDialysis）；高速冷凍離心機(jī)（5810R，Eppendorf）；精密電子天平（Secura 225D-1CN，Sartorius）。

1.2 試藥

鹽酸伊立替康對照品（批號：100767-202004，純度：86.6%，中國食品藥品檢定研究院）；SN-38對照品（批號：C020GWS22001，純度：95.3%，四川協(xié)力制藥股份有限公司）；[2H5]SN-38內(nèi)標(biāo)對照品（批號：1J165-X1，純度：97.74%，ISOREAG）；磷酸鹽（PBS）片劑（批號：1227H0310，Solarbio）；乙腈（批號：205906）、甲酸（批號：C13594075）（Thermo Fisher）；純水為實驗室自制超純水。

1.3 生物基質(zhì)

1.3.1 大鼠空白血漿 采用腹主動脈采血的方式采集大鼠血液，血液置于肝素鈉管中輕輕搖8次，3500 r·min-1離心10 min，取上層血漿于-80℃冰箱冷凍備用。用于血漿樣品及T側(cè)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的配制。

1.3.2 空白生物基質(zhì) 采用96孔平衡透析裝置，將50 μL空白大鼠血漿樣品加入到每個透析孔的給藥端，在透析孔對應(yīng)的接收端中加入100 μL 0.01 mol·L-1PBS緩沖液，將透析板置于醫(yī)用冷藏箱中，在4℃下孵育24 h。經(jīng)過平衡透析后得到的PBS緩沖液與空白大鼠血漿混合后的生物基質(zhì)作為空白生物基質(zhì)（2∶1），用于配制F側(cè)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱取適量SN-38對照品10 mg，置棕色瓶中，經(jīng)質(zhì)量校正后以二甲基亞砜溶解[11]至1 mg·mL-1，得SN-38儲備液。取適量SN-38儲備液用50%乙腈配制系列濃度Ⅰ（分別為10、100、200、1000、2000、4000、10 000、20 000 ng·mL-1）和系列濃度Ⅱ（分別0.8、4、8、20、80、200、800、1600 ng·mL-1）溶液。精密稱取適量[2H5]SN-38對照品10 mg，置棕色瓶中，以二甲基亞砜溶解至1 mg·mL-1，得[2H5]SN-38內(nèi)標(biāo)儲備液。取一定量的[2H5]SN-38內(nèi)標(biāo)儲備液，經(jīng)質(zhì)量校正后以0.1%甲酸乙腈為溶劑，分別將[2H5]SN-38內(nèi)標(biāo)儲備液稀釋至濃度為20 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液A和1 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液B。以上所有溶液于-20℃儲存，臨用前用50%乙腈稀釋到所需濃度。

2.2 PBS緩沖液配制

取PBS片劑1片，溶于100 mL純水中，得到濃度為0.01 mol·L-1，pH為7.2～7.4的PBS緩沖液，4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 分析條件

2.3.1 血漿樣品及T側(cè)樣品的分析條件

① 色譜條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，3.5 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.5%甲酸乙腈（B），梯度洗脫（0～0.6 min，20%B；1.6～2.20 min，95%B；2.21～3 min，20%B；3 min停止）；流速0.60 mL·min-1，進(jìn)樣量2.00 μL；柱溫40℃。

② 質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI），離子源溫度550℃，離子噴霧電壓5500 V，輔助加熱氣壓力55 psi，霧化氣壓力55 psi，氣簾氣壓力20 psi，碰撞氣12 psi，去簇電壓90 V，碰撞電壓39 V；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）正離子模式；用于定量分析的離子對分別為：m/z393.1→349.1（SN-38）、m/z398.3→354.3（[2H5]SN-38）。

2.3.2 F側(cè)樣品的分析條件

① 色譜條件：色譜柱及流動相同“2.3.1”項下；梯度洗脫（0～0.8 min，10%B，1.6～2.20 min，90%B；2.21～3 min，10%B；3 min停止）；流速0.50 mL·min-1，進(jìn)樣量2.00 μL；柱溫40℃。

② 質(zhì)譜條件：采用ESI，離子源溫度550℃，離子噴霧電壓5500 V，輔助加熱氣壓力55 psi，霧化氣壓力55 psi，氣簾氣壓力40 psi，碰撞氣9 psi，去簇電壓158 V，碰撞電壓35 V。檢測方式及定量分析的離子對同“2.3.1”項下。

2.4 平衡透析方法[12-13]

實驗前先將透析膜用重蒸餾水淋洗兩遍，裝好透析裝置，將100 μL血漿樣品加入到每個透析孔的給藥端，在透析孔對應(yīng)的接收端中加入200 μL 0.01 mol·L-1的PBS緩沖液。將透析板置于4℃下平衡24 h完成透析平衡。

2.5 樣品預(yù)處理

2.5.1 血漿樣品及T側(cè)樣品處理 取血漿樣品60 μL或T側(cè)樣品60 μL，分別加入540 μL內(nèi)標(biāo)溶液A，渦旋約1 min，15 400 g，4℃，離心10 min，取上清液進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.5.2 F側(cè)樣品處理 透析完成后，防止透析液側(cè)SN-38被吸附，取F側(cè)溶液40 μL分別加入20 μL按照“1.3.2”項下制備的大鼠空白血漿配制成F側(cè)樣品，渦旋混勻后加入180 μL內(nèi)標(biāo)溶液B，渦旋約1 min，15 400 g 4℃離心10 min，取上清液進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.6 方法學(xué)驗證

2.6.1 血漿樣品專屬性 精密吸取大鼠空白血漿95 μL，分別加入SN-38儲備液及內(nèi)標(biāo)儲備液[2H5]SN-38；按照“2.5.1”項下方法處理后進(jìn)行LC-MS/MS分析。結(jié)果表明，大鼠空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾SN-38的測定，[2H5]SN-38與SN-38之間也互不干擾（見圖1），說明該方法的專屬性好。

圖1 血漿樣品專屬性Fig 1 Specificity of plasma samples

2.6.2 F側(cè)樣品專屬性 精密吸取空白生物基質(zhì)95 μL，分別加入SN-38儲備液及內(nèi)標(biāo)儲備液[2H5]SN-38；按照“2.5.2”項下方法處理后進(jìn)行LC-MS/MS分析。結(jié)果表明，空白生物基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾SN-38的測定，[2H5]SN-38與SN-38之間也互不干擾（見圖2），說明該方法的專屬性好。

圖2 F側(cè)樣品專屬性Fig 2 Specificity of samples on the F side

2.6.3 線性關(guān)系考察 取大鼠空白血漿95 μL，分別加入SN-38系列濃度Ⅰ溶液各5 μL，得到含SN-38質(zhì)量濃度分別為0.5、5、10、50、100、200、500、1000 ng·mL-1的血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品。按照“2.5.1”項下方法對樣品進(jìn)行處理。取上清液進(jìn)行LC-MS/MS分析，以對照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)（Y），以待測物濃度與內(nèi)標(biāo)（內(nèi)標(biāo)濃度歸一化）之比為橫坐標(biāo)（X），線性擬合成標(biāo)準(zhǔn)曲線，權(quán)重系數(shù)為1/χ2，得到血漿樣品中SN-38的回歸方程為y＝0.0107x＋0.000 924（r＝0.9990），這說明血漿樣品中SN-38在0.5～1000 ng·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好，定量下限為0.5 ng·mL-1。

取“1.3.2”項下空白生物基質(zhì)95 μL，分別加入SN-38系列濃度Ⅱ溶液各5 μL，得到含SN-38質(zhì)量濃度分別為0.04、0.2、0.4、1、4、10、40、80 ng·mL-1的F側(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣品。按照“2.5.2”項下方法對樣品進(jìn)行處理。取上清液進(jìn)行LC-MS/MS分析，以對照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)（Y），以待測物濃度與內(nèi)標(biāo)（內(nèi)標(biāo)濃度歸一化）之比為橫坐標(biāo)（X），線性擬合成標(biāo)準(zhǔn)曲線，權(quán)重系數(shù)為1/χ2，得到F側(cè)樣品中SN-38的回歸方程為y＝0.294x-0.00128（r＝0.9969），說明F側(cè)樣品中SN-38在0.04～80 ng·mL-1與峰面積線性關(guān)系良好，定量下限為0.04 ng·mL-1。

2.6.4 精密度與準(zhǔn)確度 按照“2.1”項下方法配制制備SN-38質(zhì)量濃度為1、20、400、800 ng·mL-1的血漿質(zhì)控樣品。按照“2.5.1”項下方法對樣品進(jìn)行處理，每個濃度重復(fù)6次，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同批測定，連續(xù)測定3 d。計算血漿SN-38的精密度（RSD）與準(zhǔn)確度（RE），結(jié)果見表1。

表1 SN-38在T側(cè)和F側(cè)樣品中的日內(nèi)及日間精密度和準(zhǔn)確度(Mean±SD，n＝6)Tab 1 Intra-day and inter-day precision and accuracy of SN-38 in the plasma of T side and F side (Mean±SD，n＝6)

按照“2.1”項下配制F側(cè)樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，同法制備SN-38質(zhì)量濃度為0.12、0.8、8、64 ng·mL-1的F側(cè)質(zhì)控樣品。按照“2.5.2”項下方法處理，每個濃度重復(fù)6次，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同批測定，連續(xù)測定3 d。計算F側(cè)SN-38的精密度（RSD）與準(zhǔn)確度（RE），結(jié)果見表1。

2.6.5 提取回收率 取大鼠空白血漿樣品配制20、400、800 ng·mL-1的血漿樣品，用得到的峰面積與用空白血漿樣品離心后的上清液作為生物基質(zhì)，按照“2.1”項下方法配制血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按照“2.5.1”項下方法對樣品進(jìn)行處理的未提取濃度樣品的峰面積進(jìn)行比較。每個濃度6份樣本分析，考察血漿樣品的提取回收率。大鼠空白血漿中SN-38的提取回收率在97.3%～99.5%，表明該方法回收率穩(wěn)定，結(jié)果見表2。

表2 SN-38在T側(cè)和F側(cè)樣品中的提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)(Mean±SD，n＝6)Tab 2 Matrix effect and extraction recovery of SN-38 and [2H5] SN-38 in T side and F side (Mean±SD，n＝6)

取空白生物基質(zhì)配制0.8、8、64 ng·mL-1的樣品，用得到的峰面積與用空白血漿樣品離心后的上清液作為生物基質(zhì)，按照“2.1”項下方法配制F側(cè)樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線，并按照“2.5.2”項下對樣品進(jìn)行處理的未提取濃度樣品的峰面積進(jìn)行比較。每個濃度6份樣本分析，考察F側(cè)樣品的提取回收率?？瞻咨锘|(zhì)中SN-38的提取回收率在98.6%～101.6%，表明該方法回收率穩(wěn)定，結(jié)果見表2。

2.6.6 基質(zhì)效應(yīng) 以大鼠空白血漿配制20、400、800 ng·mL-1的提取后血漿樣品，與以溶劑配制的同濃度樣品進(jìn)行峰面積比較。每個濃度6份樣本，考察血漿樣品的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表2。

取透析后空白生物基質(zhì)配制0.8、8、64 ng·mL-1的提取后基質(zhì)樣品，與以溶劑配制的同濃度的樣品進(jìn)行峰面積比較。每個濃度6份樣本，考察F側(cè)樣品的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表2。

2.6.7 穩(wěn)定性 配制質(zhì)量濃度分別為20、800 ng·mL-1的血漿質(zhì)控樣品，每個濃度6份樣本，分別考察血漿樣品在室溫放置24 h、-20℃冷凍7 d、反復(fù)凍融3次，按照“2.5.1”項下方法對樣品進(jìn)行處理。配制質(zhì)量濃度分別為0.8、64 ng·mL-1的F側(cè)質(zhì)控樣品，每個濃度6份樣本，分別在室溫放置24 h、-20℃冷凍7 d、反復(fù)凍融3次后，按照“2.5.2”項下方法對樣品進(jìn)行處理。血漿樣品或F側(cè)樣品中各兩個質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品在上述條件下的RSD均＜10%，樣品穩(wěn)定性良好。結(jié)果分別見表3和表4。

表3 不同條件下T側(cè)SN-38穩(wěn)定性結(jié)果Tab 3 Stability of SN-38 in the plasma of T side at different conditions

表4 不同條件下F側(cè)SN-38穩(wěn)定性結(jié)果Tab 4 Stability of SN-38 in the plasma of F side at different conditions

2.6.8 透析平衡時間的考察 取含800 ng·mL-1SN-38的血漿樣品，平衡時間分別為12、24、36 h，將透析板置于4℃下，測定透析后T側(cè)及F側(cè)藥物濃度。T側(cè)按照“2.5.1”項下方法、F側(cè)按照“2.5.2”項下方法對樣品進(jìn)行處理。由表5可知，當(dāng)平衡時間為24、36 h時，測得的血漿蛋白結(jié)合率比較接近，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。因此確定平衡時間為24 h，平衡溫度為4℃。

表5 不同透析平衡時間的濃度的測定結(jié)果(Mean±SD，n＝3)Tab 5 Concentration under different balance time (Mean±SD，n＝3)

2.7 方法學(xué)應(yīng)用

SD大鼠，雌雄各半，220～250 g [湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司]，實驗禁食不禁水12 h。取大鼠3只，按照單劑量（5 mg·kg-1）尾靜脈注射鹽酸伊立替康注射液。于給藥前0 h和給藥后0.08、3、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24 h從頜下靜脈取血約0.5 mL置肝素鈉抗凝試管中，3500 r·min-1離心10 min分離血漿，于-80℃冰箱中保存待測。

取血漿60 μL按“2.5.1”項下方法處理樣品，再按“2.3.1”項下方法測定總SN-38濃度。剩余血漿取100 μL經(jīng)96孔平衡透析裝置透析后，取T側(cè)樣品60 μL按“2.5.1”項下方法處理樣品，再按“2.3.1”項下分析方法測定T側(cè)SN-38濃度；取F側(cè)樣品40 μL按“2.5.2”項下方法處理，再按“2.3.2”項下方法測定F側(cè)SN-38濃度。以隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各時間點的血藥濃度，按照計算公式計算：Cf＝Ct×（CF/CT）；其中Ct是SN-38總濃度；Cf是SN-38游離濃度；CT是透析24 h后T側(cè)SN-38濃度；CF是透析24 h后F側(cè)SN-38濃度，結(jié)果見表6及圖3。

表6 大鼠血漿中總SN-38及游離SN-38的平均血藥濃度(±s，n＝3)Tab 6 Mean plasma concentrations of total SN-38 and free SN-38 in rats (±s，n＝3)

表6 大鼠血漿中總SN-38及游離SN-38的平均血藥濃度(±s，n＝3)Tab 6 Mean plasma concentrations of total SN-38 and free SN-38 in rats (±s，n＝3)

時間/h總SN-38/（ng·mL-1）游離SN-38/（ng·mL-1）0 0 0 0 0 T側(cè)/（ng·mL-1）F側(cè)/（ng·mL-1）0.083534.33±75.05 503.33±83.6847.3±3.450.30±1.81 0.25226.67±21.94200.67±6.35 17.5±1.2519.73±1.85 0.5149.33±24.50 132.00±17.0612.03±1.5313.62±2.23 1114.87±16.31100.70±8.92 9.24±2.1610.54±2.77 2 76.27±11.71 69.37±9.10 6.11±1.05 6.76±1.30 431.37±6.42 28.10±7.772.36±0.6 2.64±0.47 8 4.51±1.43 3.97±1.38 0.4±0.15 0.45±0.15 12 1.62±0.49 1.28±0.34 0.16±0.05 0.20±0.08 240000

圖3 大鼠血漿中總SN-38和游離SN-38濃度的平均藥物濃度-時間曲線（n＝3）Fig 3 Mean drug time concentration curve of total and free SN-38 concentrations in the rat plasma（n＝3）

3 討論

藥物在吸收入血后以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式存在，其中血漿蛋白結(jié)合率表示吸收進(jìn)入人體后的藥物與血漿蛋白結(jié)合形成的結(jié)合型藥物，占全部藥物總量的比例[14]。游離藥物假說認(rèn)為只有游離態(tài)的藥物才能透過生物膜擴(kuò)散到靶部位發(fā)揮藥效[15]；另外游離藥物的比例還會顯著影響藥物分布、代謝和排泄的過程[16]，血漿蛋白結(jié)合率與藥物的諸多藥理性質(zhì)均有關(guān)。因此，近些年來游離藥物濃度的血藥濃度測定越來越受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注和重視[17-18]。

目前，由于方法技術(shù)的限制，游離藥物濃度的測定在臨床前藥代動力學(xué)研究中的應(yīng)用并不廣泛[19]。本文采用的平衡透析法[20]，具有操作簡單、分析成本低、待測物在透析裝置上吸附少等特點[21]。與已報道的文獻(xiàn)研究相比[9，22]，本文所建立的分析方法定量下限低，線性范圍寬，提取回收率高，因此測定游離SN-38濃度更有優(yōu)勢。難溶性藥物通過注射方式給藥一直是藥劑學(xué)研究中的難點，然而白蛋白作為難溶性藥物的新型載體，使得越來越多的難溶性藥物應(yīng)用到臨床中，本文所建立的分析方法已應(yīng)用到體內(nèi)研究，隨著后期的深入研究，該方法將應(yīng)用到更多的白蛋白類制劑檢測中。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，采用平衡透析法時，一般可選擇37℃或4℃作為平衡溫度。由于SN-38在37℃下平衡透析時不穩(wěn)定，故選擇4℃為平衡溫度[23]；另外分別考察了平衡透析時間12、24、36 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SN-38在透析12 h后透析不完全，藥物濃度并未達(dá)到分布平衡，而透析24 h后透析完全。故選擇4℃下透析24 h作為最終平衡透析條件。

SN-38是一種高強度的蛋白結(jié)合藥物，且恒定的血漿蛋白結(jié)合率會使發(fā)揮藥效的游離型藥物濃度相對穩(wěn)定，當(dāng)游離型藥物濃度因為組織分布而下降時，結(jié)合型藥物會與血漿蛋白解離并補充到組織中，使其與游離型藥物保持動態(tài)平衡，從而保證藥效能持續(xù)發(fā)揮作用[24-25]。本實驗采用LC-MS/MS法及平衡透析結(jié)合LC-MS/MS法分別測定大鼠血漿中總SN-38和T側(cè)、F側(cè)SN-38的濃度，根據(jù)計算可知SN-38的血漿蛋白結(jié)合率大于90%，該結(jié)果與其他文獻(xiàn)報道的結(jié)果吻合[7]；同時繪制了SN-38總藥物濃度和游離藥物濃度的藥物濃度-時間曲線，比僅測定總SN-38血藥濃度具有更重要的意義。該方法為藥物游離濃度的測定提供了一種可能性，后期可協(xié)助臨床進(jìn)行個體化給藥，為提高療效和減少藥物不良反應(yīng)提供可靠的參考[26]。