周洪亮，王海丹，王澤琨，馬麗娟*（.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 藥學部，南京 009；.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 基礎藥理實驗室，南京 009；.南京中醫(yī)藥大學 第一臨床醫(yī)學院，南京 0046）

丹皮酚（paeonol）是一種天然的酚類化合物，易溶于甲醇或乙醇，溶于熱水，不溶于冷水[1]，是毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.、蘿藦科植物徐長卿Cynanchumpaniculatum（Bge.）Kitag.的主要活性物質。前期研究發(fā)現(xiàn)丹皮酚存在多晶型現(xiàn)象[2]，多晶型是固體化合物普遍存在的一種現(xiàn)象，晶型差異不僅影響藥物的穩(wěn)定性，而且影響其溶解吸收過程，從而影響療效。丹皮酚固體制劑已在臨床應用多年，由于其多晶型現(xiàn)象的存在，比較不同晶型之間的藥物代謝動力學特點及藥效差異對丹皮酚優(yōu)勢晶型的選擇、藥物質量水平的提高及臨床療效一致性的保證具有重要意義。

本實驗在發(fā)現(xiàn)并表征丹皮酚6種晶型（Ⅰ～Ⅵ）的基礎上，選取了體外溶出具有代表性的晶型（Ⅰ～Ⅲ）進行藥動學研究[2]，并在前期發(fā)現(xiàn)的丹皮酚抗痛經(jīng)作用[3]的基礎上比較不同晶型的藥效差異，以期為尋找其優(yōu)勢晶型奠定基礎。

1 材料

1.1 試藥

丹皮酚晶型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（自制[3]，不同晶型XRPD數(shù)據(jù)見表1），丹皮酚（批號：220503）、香豆素（批號：220425）（純度均≥98%，南京聚康醫(yī)藥化工有限公司），羧甲基纖維素鈉（批號：20190520，國藥集團化學試劑有限公司），苯甲酸雌二醇注射液（2 mL/4 mg，批號：20220201）、縮宮素注射液（1 mL/10單位，批號：20220201）（合肥新科信動物藥業(yè)有限公司），大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、大鼠前列腺素E2（PGE2）ELISA試劑盒、組織一氧化氮（NO）定量檢測試劑盒（上海哈靈生物科技有限公司）。甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

表1 丹皮酚不同晶型XRPD數(shù)據(jù)Tab 1 XRPD data of different crystal forms of paeonol

1.2 動物

SPF級雌性SD大鼠，體重180～220 g [上海必凱科翼生物科技有限公司，許可證號：SCXK（滬）2018-0006]。

1.3 儀器

Agilent 1290高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司），Sartorius BP-211D十萬分之一電子分析天平（賽多利斯公司），高速冷凍離心機（貝克曼庫爾特有限公司），多功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；Eppendorf離心機、微量移液器（Eppendorf公司）；Pannoramic 1000全景切片掃描儀（匈牙利3DHISTECH）。

2 方法與結果

2.1 藥動學研究

2.1.1 溶液的制備

① 對照品儲備液：精密稱取丹皮酚對照品適量，置25 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，混勻，得到質量濃度為471.34 μg·mL-1的丹皮酚對照品儲備液，備用。

② 內標溶液：精密稱取香豆素適量，置10 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，混勻，得到113.40 μg·mL-1的內標儲備液。精密吸取內標儲備液2 mL，置100 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，混勻，得到2.268 μg·mL-1的內標溶液，備用。

2.1.2 血漿樣品的處理 精密量取待測血漿樣品100.0 μL，置1.5 mL EP管中，加入香豆素內標溶液（2.268 μg·mL-1）100.0 μL及含0.1%甲酸的乙腈200.0 μL，渦旋1 min后12 000 r·min-1、4℃離心10 min，上清液在室溫下用氮氣吹干，100 μL流動相復溶，振蕩2 min，離心，取上清液備用。

2.1.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（4.6 mm×50 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈-0.05%甲酸水溶液（50∶50）；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：30℃；檢測波長：273 nm；進樣量：10 μL。

2.1.4 專屬性實驗 取空白血漿（A）、空白血漿＋丹皮酚＋香豆素（B）及給藥1 h的血漿樣品＋香豆素（C），照“2.1.2”項下方法處理后，進樣測定，得各樣品色譜圖見圖1。結果表明，香豆素（內標）及丹皮酚的保留時間分別為2.8 min和4.5 min，且峰形好，血漿中的內源性物質與丹皮酚及香豆素分離度良好。

圖1 丹皮酚高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of paeonol

圖2 不同晶型丹皮酚在大鼠體內平均血藥濃度-時間曲線圖（n＝5）Fig 2 Plasma concentration-time curves in rats of paeonol different crystal forms（n＝5）

2.1.5 標準曲線的繪制及定量限 取空白血漿100.0 μL，置于EP管中，加入香豆素（2.268 μg·mL-1）100.0 μL，再分別加入0.024、0.118、0.236、0.589、1.178、2.357、3.535 μg·mL-1的丹皮酚對照品溶液100 μL及含0.1%甲酸的乙腈100 μL，渦旋1 min后12 000 r·min-1、4℃離心10 min，取上清液，室溫下氮氣吹干，用100 μL流動相復溶，進樣測定。以丹皮酚質量濃度（Y）對丹皮酚峰面積與香豆素峰面積的比值（X）進行線性回歸，標準曲線方程為Y＝0.3851X-0.0553（r＝0.9991），丹皮酚在0.024～3.535 μg·mL-1內與峰面積呈良好的線性關系，定量限為0.024 μg·mL-1。

2.1.6 精密度、準確度考察 取空白血漿100.0 μL，分別加入不同質量濃度的丹皮酚對照品溶液至終濃度分別為0.118、0.589、2.357 μg·mL-1，每種濃度平行制備對照品血漿5份。照“2.1.2”項下方法處理后，進樣測定，記錄峰面積。每個濃度同日內測定5次，考察日內精密度；連續(xù)測定3 d，考察日間精密度。以測得值與真實值的比值計算回收率，考察準確度。結果不同質量濃度的丹皮酚血漿樣品的日內精密度RSD＜3.0%，日間精密度RSD＜4.0%，日內、日間回收率在81.2%～100.0%，表明本法精密度、準確度均符合相關要求。

2.1.7 提取回收率 分別配制質量濃度為0.118、0.589、2.357 μg·mL-1的含藥血漿各5份，按照“2.1.2”項下方法處理后測定，得峰面積A；取空白血漿，按“2.1.2”項下方法沉淀蛋白后，取上清液分別加入0.118、0.589、2.357 μg·mL-1的丹皮酚對照品溶液，氮氣吹干溶劑，復溶后同法測定，得峰面積B。提取回收率（%）＝A/B×100%，結果丹皮酚的提取回收率均在88.2%～96.6%，RSD＜5.0%。

2.1.8 穩(wěn)定性 取空白血漿100.0 μL，分別加入不同質量濃度的丹皮酚對照品溶液，使終質量濃度分別為0.118、0.589、2.357 μg·mL-1，每種濃度平行制備對照品血漿5份，照“2.1.2”項下方法處理后，分別在室溫放置36 h、-20～20℃反復凍融3次和-20℃放置30 d，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，考察穩(wěn)定性。結果不同質量濃度的丹皮酚血漿樣品經(jīng)不同條件處理后的回收率在82.4%～101.0%，均符合要求。

2.1.9 藥動學研究 15只SD雌性大鼠隨機分成3組（每組5只），分別為晶型I組、晶型Ⅱ組、晶型Ⅲ組。給藥前禁食12 h，自由飲水。每只大鼠分別單次灌胃給予同一粒徑的（通過三號篩，不通過四號篩）不同晶型丹皮酚粉末138 mg·kg-1（以0.2% CMC-Na混懸[4]），分別于給藥后0、15、30、60、90、120、150、180、240、300、360、420 min眼眶靜脈叢取血0.4 mL置于肝素潤洗過的EP管中，以3000 r·min-1離心10 min，取上清液100 μL，置于2 mL EP管中，照“2.1.2”項下方法處理，進樣分析。計算不同時間點各晶型丹皮酚血藥濃度，繪制血藥濃度-時間曲線，使用Phoenix WinNonLin 8.3.5軟件進行非房室模型擬合計算主要藥動學參數(shù)，采用GraphPad Prism 9.4.1軟件對獲得的組間數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。根據(jù)血藥濃度-時間曲線可知，晶型Ⅰ吸收較其他晶型慢，該結果與各晶型體外溶出行為具有一致性，晶型Ⅱ、Ⅲ藥動學參數(shù)中的tmax、AUC0～7h、MRT0～7h與晶型Ⅰ相比差異顯著。其中，達峰時間最長相差115 min，曲線下面積最大相差32.5%，平均滯留時間最大相差75.9 min。主要藥動學參數(shù)統(tǒng)計結果見表2。

表2 不同晶型丹皮酚在大鼠體內藥動學參數(shù)(n＝5)Tab 2 Pharmacokinetic parameters of paeonol polymorphs (n＝5)

2.2 藥效學研究

2.2.1 原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠的制備及給藥方案SD雌性大鼠25只，隨機分成5組（每組5只），分別為正常組，模型組，丹皮酚晶型Ⅰ組、晶型Ⅱ組、晶型Ⅲ組。模型組和各給藥組大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇，每日1次，連續(xù)10 d（第1日和第10日為2.5 mg·kg-1，第2～9日為1 mg·kg-1）[5]，于第3～10日分別灌胃給予同一粒徑的（過三號篩，不過四號篩）不同晶型丹皮酚粉末138 mg·kg-1（以0.2% CMC-Na混懸）。

2.2.2 行為學測試 最后一次（第10日）丹皮酚干預后1 h，每只大鼠腹腔注射縮宮素注射液1U·kg-1[5]。以扭體潛伏期和20 min內扭體次數(shù)為行為觀察指標，測定不同晶型丹皮酚對痛經(jīng)模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用。大鼠扭體主要表現(xiàn)為腹部向內凹陷、軀干和后肢伸展、臀部和一側的肢體內旋，有時還有抱頭舔腹的行為[6-8]。

模型組大鼠均出現(xiàn)了明顯的扭體反應，表明原發(fā)性痛經(jīng)模型建立成功。與模型組比較，丹皮酚晶型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組均能顯著降低扭體反應次數(shù)（P＜0.001，分別減少80.2%、57.6%、52.5%），晶型Ⅲ與晶型Ⅰ相比有顯著性差異（P＜0.05）。與模型組比較，丹皮酚對大鼠扭體潛伏期的影響雖然沒有顯著差異，但仍具有一定的延長作用。綜合比較，丹皮酚晶型Ⅰ對扭體反應的抑制作用優(yōu)于晶型Ⅱ、Ⅲ，見圖3。

圖3 不同晶型丹皮酚對原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠扭體次數(shù)和扭體潛伏期的影響（n＝5）Fig 3 Effect of paeonol polymorphs on writhing latency and writhing times of PD rats（n＝5）

2.2.3 大鼠子宮中炎癥因子含量的測定 扭體試驗完成后，大鼠腹腔注射戊巴比妥（2 mg·kg-1）麻醉，剖腹，取出子宮后剪取200 mg組織在冰浴下制成10%的子宮組織勻漿，4000 r·min-1、4℃離心10 min，取上清液，用于PGE2、NO和TNF-α的測定。

結果與正常組比較，模型組子宮中PGE2、TNF-α含量明顯升高，NO含量則顯著降低（P＜0.01，P＜0.001），丹皮酚不同晶型均能促使原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠子宮組織中PGE2、TNF-α、NO水平趨于正?；?種晶型中晶型Ⅰ改善最明顯，見表3。

表3 不同晶型丹皮酚對原發(fā)性痛經(jīng)模型大鼠子宮組織中PGE2、NO和TNF-α的影響(n＝5)Tab 3 Effect of paeonol polymorphs on PGE2，NO and TNF-α in the uterus of PD rats (n＝5)

2.2.4 組織病理學檢測 分離大鼠子宮組織并浸泡于4%多聚甲醛固定液中進行固定，乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切成5 μm的切片后進行HE染色，評價子宮組織病理學變化。結果正常組大鼠子宮組織形態(tài)正常，組織平滑形態(tài)清晰，上皮細胞單層柱狀，排列整齊，腔壁結構各層完整、清晰。模型組大鼠子宮組織肌層結構紊亂模糊不清，固有層水腫，上皮細胞變性呈空泡樣改變或壞死、脫落（紅色箭頭），炎癥細胞浸潤（藍色箭頭）。不同晶型丹皮酚給藥后大鼠子宮病變均不同程度改善并趨于正常化，晶型Ⅰ組改善最明顯。各組子宮內膜相對平整，空泡樣改變大幅改善，固有層水腫消失，肌層紋理清晰，見圖4。

圖4 不同晶型丹皮酚對原發(fā)性痛經(jīng)大鼠子宮組織病理變化的影響Fig 4 Effect of paeonol polymorphs on the histopathological changes in the uterus of PD rats

3 討論

臨床應用丹皮酚已有50多年的歷史[9]，主要上市劑型有丹皮酚片、丹皮酚注射液等，它們對多種疼痛具有確切的治療作用。多晶型現(xiàn)象是指一種化合物分子由于排列方式不同而形成的兩種或者兩種以上的晶型狀態(tài)[10]。藥物的不同晶型可影響藥物的吸收和生物利用度，從而導致療效的差異[11]。本課題組前期共制備并表征了丹皮酚6種晶型，體外溶出研究過程中發(fā)現(xiàn)，所制備的各晶型中，晶型Ⅲ在各介質中溶出均較快，晶型Ⅱ次之，晶型Ⅰ溶出最慢[2]，因此選取了上述3種晶型進行藥動學及藥效學對比研究。

本實驗通過對大鼠口服不同晶型丹皮酚藥動學及藥效學進行比較，探討晶型對于藥物吸收及臨床療效的影響，因前期研究過程中發(fā)現(xiàn)丹皮酚抗痛經(jīng)作用明顯[3]，因此藥效學比較選擇了大鼠痛經(jīng)模型作為研究對象。難溶性藥物的晶型及粒徑均可能對藥物的吸收產(chǎn)生較大影響，本研究使用的丹皮酚為同一粒徑的不同晶型樣品，這樣可以更好地反映晶型這單一因素對吸收、療效的影響。

藥動學研究對比了乙腈沉淀與乙酸乙酯萃取對樣品處理效果的影響，結果采用乙酸乙酯萃取的血漿樣品，丹皮酚的提取回收率僅50%～60%，且容易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，而乙腈沉淀法處理的血漿樣品低濃度下回收率＞80%，中、高濃度回收率＞90%，且日內、日間精密度，穩(wěn)定性均符合要求。

運用Phoenix WinNonLin軟件對3種晶型丹皮酚在大鼠體內的相關藥動學參數(shù)進行分析，結果表明，各晶型丹皮酚代謝均較快，大鼠口服半衰期僅30 min左右，無顯著性差異。然而，根據(jù)丹皮酚血藥濃度-時間曲線可見，晶型Ⅲ的吸收速度更快，達峰濃度更高，晶型Ⅰ則吸收緩慢，但是其平臺期相對較長，180 min還存在一吸收峰，該現(xiàn)象可能與丹皮酚的腸吸收有關。不同晶型丹皮酚抗痛經(jīng)作用效果存在差異，其中晶型Ⅰ在抑制痛經(jīng)模型大鼠甩尾及子宮組織中炎癥因子等方面優(yōu)于其他晶型，分析可能與該晶型的溶解、釋放速度有關，體內研究中晶型Ⅲ的達峰時間僅15 min，而晶型Ⅰ則達到了2 h，達峰時間顯著延長，而丹皮酚的吸收、消除速度均較快，因此慢溶出的晶型能夠維持較長時間的血藥濃度，從而達到更好的治療效果，這也提示丹皮酚制劑的開發(fā)應著重于緩控釋制劑的研究，而非提高溶解度。

本研究闡明了晶型對丹皮酚藥動學及藥效學的影響。丹皮酚吸收、消除速度極快[12-13]，溶出、釋放較慢的晶型Ⅰ可以較好地維持血藥濃度，因而抗痛經(jīng)作用優(yōu)于其他晶型，具有更高的開發(fā)價值。本研究可為丹皮酚優(yōu)勢晶型的選擇及固體藥物制劑的開發(fā)提供參考。