王玨，陳佩弦，何玲，孫逸（中國藥科大學藥學院，南京 211198）

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一種慢性神經退行性疾病，是老年癡呆癥的主要病因，其臨床特征是以記憶力減退為常見癥狀的進行性認知障礙[1]。《世界阿爾茨海默病報告》指出，目前全球范圍內的AD患者約有5000萬名，預計到2060年，將增長到1.38億[2]。AD的兩個主要組織病理學標志物是細胞內的神經原纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs）和細胞外的β-淀粉樣蛋白斑塊沉積（β-amyloid protein plaque，SP），分別由過度磷酸化的Tau（microtubule-associated protein tau，Tau）蛋白和β-淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）組成[3]。但是，基于清除Aβ或降低過度磷酸化的Tau蛋白的藥物開發(fā)策略屢次失敗[4]。

隨著實驗技術的提高，在對Aβ假說進行修正和深入研究的同時，新的致病假說也不斷被提出，其中顱內神經炎癥已經被確定為AD的關鍵驅動因素[5]。流行病學研究顯示，使用非甾體抗炎藥可預防或減緩AD的進程[6]。AD患者腦組織和腦脊液中包含多種促炎介質，腦內淀粉樣斑塊周圍激活的膠質細胞增多[7]。近期的研究發(fā)現(xiàn)，信號傳導及轉錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription，STAT3）是炎癥信號的重要調節(jié)因子[8]。AD模型病理過程和AD患者腦中也檢測到了活化形式的STAT3上調[9]。STAT3表達上升伴隨著小膠質細胞的活化和星形膠質細胞的激活和增殖，這些反應加劇了腦內的神經炎癥，使腦內的病理環(huán)境進一步惡化，形成惡性循環(huán)，導致患者的認知和學習能力進一步降低[8]。STAT3的抑制或許可以成為改善AD癥狀的新途徑。

氯硝柳胺（nicolsamide，NIC）是WHO批準的首選滅螺藥，已在臨床應用50余年[10]，主要通過影響細胞線粒體、溶酶體以及乳酸脫氫酶等多種細胞酶的活性，參與細胞的氧化磷酸化，引起細胞凋亡和自噬性死亡[11-12]。氯硝柳胺是公認的STAT3抑制劑，可抑制巨噬細胞誘導的炎癥反應，在治療腫瘤、細菌病毒感染、糖尿病、心血管系統(tǒng)疾病、神經退行性疾病等方面具有潛在的應用效果[13]。因此，本研究擬以氯硝柳胺為工具藥，探討STAT3在AD小鼠認知障礙發(fā)生發(fā)展中的作用和機制。

1 材料

曠場實驗視頻分析系統(tǒng)、新物體識別視頻分析系統(tǒng)、Y迷宮、穿梭實驗視頻分析系統(tǒng)（北京眾實迪創(chuàng)科技有限公司）；Morris水迷宮（上海吉量軟件科技有限公司）；ANY-maze動物行為分析系統(tǒng)（美國Stoelting公司）；腦立體定位儀及適配器、動物顱骨鉆（成都泰盟科技）；微量注射泵（保定蘭格恒流泵）；分析天平（上海舜宇恒平科學儀器）；渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造）；KD-160型電子秤（TANITA公司）；手持組織勻漿器（寧波新芝生物科技）；臺式高速冷凍離心機（長沙湘儀）；恒溫孵箱（德國Heraeus）；酶標儀（深圳雷杜生命科學）；恒溫磁力攪拌器（江蘇省金壇市榮華儀器）；PHS-25 pH計（上海儀電科學儀器）；掌上離心機（大龍興創(chuàng)實驗儀器）；Mini-PROTEAN Tetra手灌膠系統(tǒng)、Mini-PROTEAN Tetra電泳和轉印系統(tǒng)（Bio-Rad）；全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海天能）；水平搖床（海門市其林貝爾儀器）；切片掃描儀（濱松）；冰凍切片機（Leica）。

β-淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）粉末（Sigma-Aldrich）；單克隆抗體Aβ、Tau和P-Tau（Ser396）（Santa Cruz），PSD95、β-actin、白細胞介素（IL）-1β、腫瘤壞死因子（TNF）-α（Proteintech），STAT3、P-STAT3（Tyr705）、HRP標記山羊抗兔IgG、HRP標記山羊抗小鼠IgG抗體（Proteintech）；SOD、MDA檢測試劑盒（南京建成）；GSH試劑盒（Boxbio）；ECL試劑盒（上海雅酶）；HE染色試劑盒（Solarbio）。氯硝柳胺（MedChemExpress，批號：15718）。

2 方法

2.1 實驗動物及分組

8周齡SPF級C57BL/6J雄性小鼠，體重22～25 g [上海必凱科翼生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK（滬）2018-0006]。飼料和墊料來自中國藥科大學江寧校區(qū)藥學動物實驗中心，溫度22～25℃，相對濕度50%～70%，自然光線，自由飲水和進食。小鼠先適應性喂養(yǎng)7 d，再進行后續(xù)具體實驗。

36只C57BL/6J雄性小鼠按體重隨機分為3組，每組12只，分別為模型組（model）、氯硝柳胺給藥組[NIC，25 mg/（kg·d）[14]]、對照組（control）。模型組和給藥組在適應性飼養(yǎng)結束后進行雙側海馬注射Aβ溶液，對照組注射相同體積的生理鹽水。給藥組灌胃給予氯硝柳胺溶液（溶媒為1%DMSO、4%聚乙二醇、95%生理鹽水），劑量為25 mg/（kg·d）[14]，持續(xù)7 d，對照組和模型組灌胃相同體積的溶媒。

2.2 小鼠AD模型的建立

2.2.1 Aβ1-42溶液的配制 將凍存的Aβ1-42粉末從冰箱中取出，梯度升溫至室溫，加入適量生理鹽水溶解并超聲10 min，使其終濃度為82 pmol·μL-1，37℃孵育7 d。之后分裝老化好的Aβ1-42寡聚體，于-20℃冰箱中凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 小鼠雙側海馬腦立體定位注射Aβ剪除小鼠后眼角到兩耳間的毛發(fā)，使用75%乙醇消毒表皮后剪開頭皮暴露顱骨，棉簽蘸取少量30%過氧化氫溶液擦拭創(chuàng)面，使得顱骨縫清晰可見。定位坐標由小鼠腦立體定位圖譜確定，使用小動物顱骨鉆鉆穿顱骨；將打孔后的小鼠于腦立體定位儀上固定，微量進樣器與小鼠顱骨鉆孔平面垂直，緩慢勻速進針。使用自動進樣泵緩慢勻速推入5 μL生理鹽水或Aβ1-42溶液。結束注射后留針90 s，再緩慢完成出針；注射完成后，縫合頭皮，消毒創(chuàng)口。

2.3 行為學實驗方法

2.3.1 曠場實驗 將小鼠活動區(qū)域（50 cm×50 cm×40 cm的敞口箱體）劃分為中央?yún)^(qū)域和四周區(qū)域，將小鼠置于曠場裝置中央，記錄5 min內小鼠自由探索活動軌跡，評價指標為活動距離和中央?yún)^(qū)停留時間。

2.3.2 新物體識別實驗 實驗分為適應日、訓練日和測試日。第1日為適應日，將小鼠放入未放置物體的敞口箱中令其自由活動10 min以減少環(huán)境壓力。第2日為訓練日，在敞口箱內放置兩個相同物體，置入小鼠令其探索5 min。第3日為測試日，與第2日過程相同，只是將其中一個物體替換成不同的物體。記錄測試日小鼠對兩個物體的探索時間，即對舊物體探索時間（familiar）和對新物體探索時間（novel），可由此計算偏好指數(shù)＝novel/（familiar＋novel），評價小鼠對新物體的好奇程度，大于0.5則視為小鼠更樂于探索新物體。

2.3.3 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮實驗周期為6 d，分為空間記憶采集實驗和空間搜索實驗?？臻g記憶采集實驗：每只小鼠依次從四個入水點背對池壁置入水池，每次時間為90 s，全程錄像并記錄游泳軌跡；若小鼠成功站上臺面超過10 s則自動停止采集，并將第一次碰到臺面的時間記為潛伏期。如在90 s內未成功登上臺面10 s，則需人為牽引小鼠至平臺并使其在平臺逗留30 s，此時潛伏期記為90 s。平臺低于水面1 cm為不可見平臺?？臻g探索實驗：第6日撤去平臺，選取目標象限對角象限的入水點將小鼠置于水中，每只小鼠均需完成90 s的游泳并全程記錄軌跡。

2.4 Western blot實驗

將從小鼠海馬和皮層獲得的組織放在含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液中。按照試劑盒說明書從新鮮組織中提取細胞蛋白質和核蛋白。蛋白樣品用SDS-PAGE凝膠分離，轉移到PVDF膜上。用封閉液在室溫下封閉3 h，并與單克隆抗體Aβ1-42，Tau和P-Tau（Ser396），PSD95，β-actin，IL-1β，TNF-α，STAT3，P-STAT3（Tyr705）孵育過夜，然后將膜與HRP的山羊抗兔抗體和抗小鼠IgG抗體分別在室溫下孵育60 min。使用ECL試劑盒曝光蛋白質條帶，并使用化學發(fā)光檢測系統(tǒng)掃描。通過灰度分析（ImageJ軟件）定量相對蛋白表達水平，并使用β-actin灰度進行歸一化分析。

2.5 血清SOD、GSH和MDA水平檢測

每只小鼠眼眶取血，置于1.5 mL離心管中，室溫條件靜置30 min后，3000 r·min-1離心 10 min獲得血清，根據(jù)相應試劑盒操作說明書分別測定SOD、MDA和GSH含量。

2.6 蘇木精-伊紅染色法（HE染色）

新鮮取材，經固定、石蠟包埋，切片5 μm。蘇木素染液染色2～20 min，蒸餾水洗去浮色。分化液分化10～60 s，純水滴加或浸洗2次，每次3～5 min。置伊紅染液60 s，傾去多余染色液后快速脫水。經透明和封片后用掃描儀觀察。

2.7 數(shù)據(jù)分析

Western blot結果采用ImageJ軟件進行灰度值分析，所有實驗數(shù)據(jù)經GraphPad Prism 7.0軟件分析后以平均值±標準誤（Mean±SEM）表示，進行單因素方差分析和多重比較檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計結果采用GraphPad Prism 7.0軟件繪圖。

3 結果

3.1 抑制STAT3改善AD小鼠認知功能障礙

3.1.1 抑制STAT3對AD小鼠自發(fā)活動和探索能力的影響 如圖1所示，與對照組相比，模型組小鼠的總活動距離無顯著性差異（P＞0.05），但中央?yún)^(qū)停留時間顯著減少（P＜0.001），表明小鼠呈現(xiàn)明顯的焦慮情緒，且空間探索欲望能力顯著降低。與模型組相比，氯硝柳胺給藥組小鼠的中央?yún)^(qū)停留時間顯著增加（P＜0.01）。以上研究表明抑制STAT3可以顯著改善AD小鼠的焦慮癥狀，提高其空間探索能力。

圖1 抑制STAT3對曠場實驗中AD小鼠的自發(fā)活動和探索能力的影響Fig 1 Effect of STAT3 inhibition on spontaneous activity and exploratory ability of mice with Alzheimer’s disease in open field experiment

3.1.2 抑制STAT3對新物體識別實驗中識別記憶能力的影響 如圖2A所示，與對照組相比，模型組小鼠對舊物體的探索時間顯著增多（P＜0.01），對新物體的探索時間顯著減少（P＜0.01）。同時如圖 2B所示，模型組小鼠對新物體的識別指數(shù)顯著降低（P＜0.01），表明AD模型小鼠存在物體識別記憶能力缺陷。與模型組相比，氯硝柳胺給藥組小鼠的新物體識別指數(shù)顯著增高（P＜0.01），以上研究表明抑制STAT3可以顯著改善AD小鼠的物體識別和記憶能力。

圖2 抑制STAT3對新物體識別實驗中識別記憶能力的影響Fig 2 Effect of STAT3 inhibition on recognition and memory ability in New object recognition experiment

3.1.3 抑制STAT3對小鼠空間學習記憶能力的影響 Morris水迷宮的第1～5日為不可見平臺訓練期。如圖3A所示，在共計5 d的定位航行實驗中，各組小鼠游泳速度無顯著差異（P＞0.05），說明各組小鼠的視力和游泳能力基本一致。圖3B結果顯示，定位航行1～5 d各組小鼠逃避潛伏期隨著訓練時間的增加而呈現(xiàn)不同程度的縮短。與同時期對照組小鼠相比，模型組小鼠潛伏期顯著升高（P＜0.01），而氯硝柳胺給藥組小鼠的逃避潛伏期相對于模型組顯著降低（P＜0.01），說明模型組小鼠存在明顯的空間學習記憶障礙，且與STAT3的激活相關，抑制STAT3后可在一定程度上改善AD小鼠的空間學習記憶障礙。

圖3 抑制STAT3對 Morris 水迷宮實驗中空間學習記憶能力的影響Fig 3 Effect of STAT3 inhibition on spatial learning and memory in Morris water maze test

水迷宮實驗第6日，通過穿臺次數(shù)以及目標象限停留時間考察了各組小鼠的空間記憶能力，結果如圖3C及3D所示。與對照組相比，模型組小鼠的穿臺次數(shù)和目標象限停留時間顯著減少（P＜0.001），表明模型組小鼠出現(xiàn)了明顯的空間記憶損害。與模型組相比，氯硝柳胺給藥組小鼠穿臺次數(shù)和目標象限停留時間均顯著增加（P＜0.01，P＜0.001），說明抑制STAT3后可在一定程度上改善AD小鼠的空間記憶能力。

3.1.4 抑制STAT3對AD小鼠皮層和海馬區(qū)中病理及功能性蛋白表達影響 如圖4所示，與對照組相比，模型組小鼠海馬和皮層中Aβ1-42和P-Tau的表達水平顯著升高（P＜0.01，P＜0.001），而PSD95表達水平顯著降低（P＜0.001）。與模型組相比，氯硝柳胺給藥組小鼠海馬和皮層中的P-Tau和Aβ1-42表達量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），而PSD95表達水平顯著升高（P＜0.01）。結果提示AD的發(fā)生與STAT3的激活有關，且抑制STAT3能改善AD病理標志物的表達和神經元的損傷。

圖4 抑制STAT3對阿爾茨海默病小鼠皮層和海馬區(qū)中病理及功能性蛋白表達影響Fig 4 Effect of STAT3 inhibition on pathological and functional protein expression in cortex and hippocampus of mice with Alzheimer’s disease

3.2 抑制STAT3減輕AD小鼠神經炎癥

如圖5所示，與對照組相比，模型組小鼠海馬和皮層中P-STAT3、IL-1β和TNF-α的表達水平顯著升高（P＜0.01，P＜0.001），而STAT3的表達水平沒有顯著差異（P＞0.05），表明STAT3在Tyr705的磷酸化水平顯著提高，STAT3被激活后炎癥因子水平顯著提高則表明神經炎癥發(fā)生發(fā)展。與模型組相比，氯硝柳胺給藥組小鼠海馬和皮層中的P-STAT3、IL-1β和TNF-α的表達水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），表明STAT3在Tyr705位點的磷酸化水平顯著降低，STAT3被抑制后炎癥因子水平顯著降低則表明神經炎癥的發(fā)生發(fā)展被抑制。結果提示神經炎癥的發(fā)生發(fā)展與STAT3的激活有關，且抑制STAT3能減輕神經炎癥，最終改善AD小鼠的認知障礙。

圖5 抑制STAT3對阿爾茨海默病小鼠皮層和海馬區(qū)中炎癥因子表達的影響Fig 5 Effect of STAT3 inhibition on the expression of inflammatory factors in cortex and hippocampus of mice with Alzheimer’s disease

3.3 抑制STAT3減輕AD小鼠氧化應激

如圖6所示，與對照組相比，模型組小鼠血清中GSH和SOD含量均顯著降低，MDA含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，氯硝柳胺給藥組小鼠血清中GSH和SOD含量均顯著升高，MDA含量顯著降低（P＜0.01）。結果顯示抑制STAT3能夠增加小鼠體內抗氧化物質的產生。

圖6 抑制STAT3對阿爾茨海默病小鼠血清中氧化應激相關因子表達的影響Fig 6 Effect of STAT3 inhibition on the expression of oxidative stress related factors in serum of mice with Alzheimer’s disease

3.4 抑制STAT3治療AD小鼠腦結構損傷且抑制劑氯硝柳胺無明顯毒性

AD患者的海馬神經元結構會隨著疾病發(fā)展出現(xiàn)不同程度的損傷，而病理組織切片可以觀察到這一現(xiàn)象[15]。圖7A顯示，模型組小鼠海馬細胞數(shù)量減少，并出現(xiàn)形態(tài)學損傷，但氯硝柳胺給藥組細胞數(shù)量和形態(tài)均有不同程度恢復。給藥后錐體細胞排列整齊結構完整，細胞無明顯腫脹以及數(shù)量增加。這表明抑制STAT3會改善海馬神經結構受損。另外圖7D顯示，氯硝柳胺給藥7 d對小鼠的心、肝、肺、脾、腎的正常組織結構無明顯影響，說明其安全性較好。

圖7 抑制STAT3對改善小鼠腦結構的作用及毒性Fig 7 Effect of STAT3 inhibition on improving brain structure and biocompatibility in mice

4 討論

現(xiàn)代社會，隨著人口老齡化的增加以及人們生活水平的提高，AD發(fā)病率日益升高[2]。由于認知功能障礙發(fā)生的生理機制復雜，尋求多靶點治療方案具有相當重要的意義。既往研究著眼于SP和Tau蛋白過度磷酸化兩大假說，但接連面臨的難關驅使人們尋求更新的治療靶點[16]。神經炎癥被證明在AD發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，同時有研究表明STAT3通路的激活顯著加劇膠質細胞介導的神經炎癥[17]。這提示以STAT3通路為靶點的藥物可能對AD有改善作用。STAT3通路的重要作用在于其影響膠質細胞分裂及活化的能力，小膠質細胞的過度激活和星形膠質細胞的反應性增生都會加劇顱內神經炎癥，使得疾病進一步惡化[18]。STAT3的主要激活過程是胞外信號刺激受體使得偶聯(lián)的JAKs磷酸化，激活的JAKs招募游離的非活性STAT3并使其磷酸化，磷酸化后的STAT3經二聚化后轉移至細胞核發(fā)揮作用[19]。抑制STAT3磷酸化能緩解神經炎癥，對神經細胞起到保護作用，這在神經疾病研究領域是一個有希望的方向，但報道尚少見[20]。

本實驗選取的工具藥氯硝柳胺是臨床上常用于治療腸道寄生蟲病的小分子化學藥物，近年來研究表明其具有相當?shù)陌踩?、良好的血腦屏障穿透能力以及非糖蛋白P底物的特性，且具有突出的抗炎能力，這讓氯硝柳胺在帕金森病[21]、肌萎縮側索硬化[20]、腦缺血[14]等中樞神經疾病領域展現(xiàn)出不俗的治療潛力[22]，但在AD中鮮有應用。此外有報道氯硝柳胺是通過抑制STAT3來控制膠質細胞的過度激活，延緩神經炎癥的發(fā)生，促進神經修復[20]。因此，本文采用雙側海馬立體定位注射Aβ1-42建立AD模型小鼠，給予STAT3抑制劑氯硝柳胺，探討STAT3在認知障礙發(fā)生發(fā)展中的作用。

首先，在曠場實驗中，可以觀察到抑制STAT3能提高AD小鼠中央?yún)^(qū)停留時間，這符合正常小鼠探索空曠地帶的天性，表明小鼠的焦慮癥狀和空間探索能力都有所改善；在新物體識別實驗中，觀察到抑制STAT3能讓AD小鼠對新物體的探索次數(shù)增加，這提示小鼠的識別能力和記憶能力都有所恢復；在Morris水迷宮實驗中，抑制STAT3能降低訓練期AD小鼠的逃避潛伏期，提高測試期AD小鼠的目標象限停留時間和穿臺次數(shù)，這說明小鼠空間記憶能力的改善。通過動物行為學實驗初步證明了抑制STAT3能改善AD小鼠的學習記憶能力。

AD的發(fā)生發(fā)展主要累及腦組織中的海馬及皮層區(qū)域，形成神經原纖維纏結和Aβ斑塊，造成神經元損傷，突觸丟失和功能下降，進而引起認知記憶障礙[23]。PSD95是一種支架蛋白，該蛋白的表達水平可以用來衡量突觸的數(shù)量以及功能[24]。通過對各組小鼠皮層及海馬區(qū)組織的分析檢測我們發(fā)現(xiàn)抑制STAT3能降低Aβ1-42和P-Tau的表達水平，提高PSD95的表達水平，這初步證明了抑制STAT3能從蛋白分子層面降低AD小鼠的病理標志物，改善突觸功能。

與神經炎癥密切相關的多種細胞參與了AD的發(fā)展，包括小膠質細胞、星形膠質細胞和一些外周炎癥細胞，IL-1β和TNF-α是由這些細胞分泌的炎癥因子[25]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，STAT3信號通路與神經疾病病理狀態(tài)下膠質細胞的激活和分裂密切相關，是影響膠質細胞介導神經炎癥的關鍵因素[26]。因此我們進一步利用Western blot對各組小鼠皮層及海馬組織中IL-1β、TNF-α進行檢測分析。結果表明，抑制STAT3能使這兩種炎癥指標下調，這表明抑制STAT3能減輕AD小鼠海馬和皮層的神經炎癥。

AD患者腦組織由于長期處于Aβ斑塊等的刺激，氧化應激誘導物質ROS在AD發(fā)病過程中會顯著增多并因此激活抗氧化系統(tǒng)[27]。內源性抗氧化物是抗氧化系統(tǒng)重要的一環(huán)，其中SOD是其中重要的酶類抗氧化物；MDA是體內脂質過氧化的產物，其含量能反映體內氧化應激水平；GSH是重要的抗氧化劑，其隨著年齡增加出現(xiàn)全身性的表達下調，在AD中該變化更為顯著[27]。在臨床治療中，血液指標的變化也可以作為AD病癥發(fā)展程度的參考依據(jù)[28]。因此我們利用試劑盒對各組小鼠血清進行了檢測分析。結果表明，抑制STAT3能降低MDA的表達，并且提高SOD和GSH的表達，這提示抑制STAT3能減輕AD小鼠體內的氧化應激水平。

以上實驗結合組織切片結果證明，抑制STAT3蛋白的磷酸化，可使STAT3蛋白激活受阻，減緩神經炎癥反應和氧化應激反應的發(fā)生，保護神經細胞，最終改善AD小鼠的認知障礙，但是深入的機制還需要后續(xù)進一步的探索以及驗證。目前關于通過抑制JAK-STAT3通路從而延緩AD病情進展的研究較少，并且臨床上也沒有類似的藥物。本研究表明STAT3有可能成為藥物開發(fā)的新靶點，并為AD的藥物研發(fā)以及在臨床上的應用提供新的思路。