蘇 昊，李維新*，林曉姿，何志剛，梁璋成，任香蕓

（1 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 福州350003 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部亞熱帶特色果蔬菌加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州350003 3 福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州 350003）

黃酒的風(fēng)味在黃酒質(zhì)量評(píng)價(jià)中雖占有重要地位，但其風(fēng)味的形成受酒中的各種化學(xué)成分的影響。同時(shí)因黃酒中的化學(xué)成分非常復(fù)雜，通過感官評(píng)定或個(gè)別成分的分析來評(píng)價(jià)其風(fēng)味及質(zhì)量品質(zhì)，易受人為等外界因素的影響[1-2]。雖然個(gè)別成分的分析不能反映黃酒的整體品質(zhì)，但是GC-MS 指紋圖譜技術(shù)的應(yīng)用可以解決這些問題[3]，使黃酒的品質(zhì)評(píng)價(jià)更加的準(zhǔn)確，并可為黃酒基酒的酒齡鑒別提供支撐。酒類指紋圖譜是借用中藥指紋圖譜的發(fā)展和應(yīng)用而來的，最先發(fā)展起來的是基于高效液相色譜（HPLC）和氣相色譜（GC）技術(shù)的酒類化學(xué)成分色譜指紋圖譜[4]。朱潘煒等[5]以乙酸乙酯、3-甲基丁醇、β-苯乙醇等5 種特征成分峰為指紋峰，利用平均值法構(gòu)建1～10 年陳浙江古越龍山紹興黃酒基酒的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜用于黃酒的品質(zhì)和酒齡分析，并證實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜的可靠性。

福建烏衣紅曲黃酒是具有地區(qū)特色的黃酒品種，是以糯米、秈米、粳米等為原料，以烏衣紅曲為糖化發(fā)酵劑釀造而成的低酒度、高營養(yǎng)的飲料酒[6]。烏衣紅曲黃酒的陳釀時(shí)間是其品質(zhì)的重要指標(biāo)[7]，其對(duì)黃酒品質(zhì)的影響最終體現(xiàn)在風(fēng)味上[8]。因釀造用曲和釀造工藝的不同導(dǎo)致烏衣紅曲黃酒的揮發(fā)性物質(zhì)差異，進(jìn)而影響黃酒的風(fēng)味品質(zhì)[9]。目前對(duì)烏衣紅曲黃酒的酒齡和品質(zhì)的評(píng)定尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，也無揮發(fā)性指紋圖譜的相關(guān)研究報(bào)道。建立一套科學(xué)的產(chǎn)品質(zhì)量評(píng)價(jià)方法，是促進(jìn)紅曲黃酒行業(yè)健康蓬勃發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。烏衣紅曲黃酒揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜和感官評(píng)價(jià)作為檢測(cè)和反映烏衣黃酒品質(zhì)的重要手段[10]，是其質(zhì)量評(píng)價(jià)體系的重要組成部分。該指紋圖譜的建立，有利于全程監(jiān)控黃酒產(chǎn)品質(zhì)量，為福建烏衣紅曲黃酒基酒產(chǎn)品陳釀質(zhì)量的評(píng)價(jià)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣為陳釀時(shí)間為2，4，5，6，7，8，9，10，12 年和15 年的烏衣紅曲黃酒基酒，每年份各取3 個(gè)批次，由福建山里陳酒業(yè)有限公司提供。

標(biāo)準(zhǔn)品：2-辛醇，sigma 公司。

1.2 儀器

島津GCMS-TQ8040 三重四極桿型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；SPME 手動(dòng)進(jìn)樣裝置，50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取頭，美國SUPELCO 公司；頂空瓶15 mL，Agilent 公司；恒溫水浴鍋，上海市實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 萃取頭老化 將萃取頭于270 ℃下老化1 h，至無干擾峰出現(xiàn)。

1.3.2 色譜條件 采用色譜柱HP-INNOWAX（30 m×0.25 μm×0.25 μm）。初始柱溫40 ℃保持3 min，后以6 ℃/min 升溫至100 ℃，以10 ℃/min 升溫至230 ℃，保持7 min。進(jìn)樣口溫度均為250 ℃，不分流模式進(jìn)樣。

接口溫度280 ℃，EI 電子原，掃描范圍（m/z）33～550 u，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，采集方式為全掃描模式。

1.3.3 樣品分析 稱取1 g 酒樣，吸取5 μL 質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 2-辛醇溶液，加入15 mL 頂空瓶中，加蓋后放入恒溫水浴鍋中50 ℃預(yù)熱10 min，將老化后的萃取頭插入頂空瓶，推出纖維頭，使其暴露于樣品液面上方，放入恒溫水浴鍋中50℃吸附50 min。當(dāng)樣品萃取時(shí)間結(jié)束時(shí)，立即將萃取頭插入氣相色譜儀的進(jìn)樣口，熱解吸5 min 后啟動(dòng)氣相色譜儀采集數(shù)據(jù)。

1.4 揮發(fā)性物質(zhì)的定性和定量

采用氣相氣質(zhì)色譜儀器配置的NIST14 揮發(fā)性物質(zhì)數(shù)據(jù)庫對(duì)化合物進(jìn)行定性。以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)，對(duì)黃酒中會(huì)揮發(fā)性化合物含量進(jìn)行定量。

1.5 揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜的建立與驗(yàn)證

以基酒中已定性的揮發(fā)性物質(zhì)為研究對(duì)象，采用正交偏最小二乘判別分析及Spearman 相關(guān)性分析方法，篩選出與陳釀時(shí)間密切相關(guān)的關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)，再以這些關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)作為特征指紋峰構(gòu)建年份特征揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)照指紋圖譜，這些揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)方法穩(wěn)定性參照指紋圖譜構(gòu)建的要求進(jìn)行方法學(xué)考察[11]；指紋圖譜的可靠性驗(yàn)證，是通過第2 次在原基酒廠取樣，以年份特征揮發(fā)性物質(zhì)為指標(biāo)，比較基酒樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似程度，并加以評(píng)估。

1.6 數(shù)據(jù)分析

基酒相似度計(jì)算采用夾角余弦法[5]，使用EXCEL 2019 軟件完成；圖譜繪制采用Origin 2018軟件；主成分分析采用SIMCA14 軟件；Spearman相關(guān)性分析采用R 語言。

2 結(jié)果與分析

2.1 福建烏衣紅曲黃酒基酒揮發(fā)性物質(zhì)解析

揮發(fā)性成分是影響黃酒風(fēng)味的重要因素，它的組成、氣味閾值和相互作用對(duì)酒體整體的風(fēng)味感知具有重要影響。隨著陳釀時(shí)間的延長，紅曲黃酒的揮發(fā)性成分也相應(yīng)發(fā)生變化，某些具有特征意義的揮發(fā)性成分，與陳釀年份具有一定的相關(guān)性。采用HS-SPME-GC-MS 技術(shù)，對(duì)收集到的不同年份烏衣紅曲黃酒樣品分別進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)其中的122 種揮發(fā)性成分進(jìn)行了定性和定量，其中包含酯類49 種、醇類17 種、酸類11 種、醛類8 種、烷烴類6 種、苯環(huán)芳香烴類10 種（表1）。

表1 烏衣紅曲黃酒基酒中揮發(fā)性成分Table 1 Volatile components in red koji yellow rice wine base wine

2.2 烏衣紅曲黃酒基酒年份特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的確定

基于不同年份烏衣紅曲黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的分析結(jié)果，對(duì)其中檢測(cè)到的122 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，采用OPLS-DA 分析，不同陳釀時(shí)間不同批次的分析歸類結(jié)果（P＜0.05）見圖1。根據(jù)聚類分析，將不同年份的烏衣紅曲黃酒基酒劃分為3 類：2～4 年陳，5～9 年陳，10～15 年陳，表明烏衣紅曲黃酒基酒陳陳釀可以分為3 個(gè)較為穩(wěn)定的階段，在某一階段內(nèi)，其揮發(fā)性物質(zhì)種類和含量變化雖較小，但不同階段則變化較大。

圖1 OPLS-DA 主成分分析Fig. 1 Principal component analysis of OPLS-DA

對(duì)上述檢測(cè)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，繼續(xù)采用OPLS-DA 分析進(jìn)行變量投影重要性預(yù)測(cè)VIP 值解析（圖2），初篩出對(duì)風(fēng)味起較大貢獻(xiàn)的風(fēng)味物質(zhì)（VIP 值＞1）共45 種。進(jìn)一步采用Spearman 相關(guān)性分析法解析烏衣紅曲黃酒基酒年份特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)（P＜0.05 且相關(guān)性|r|＞0.5）共20 種，結(jié)果見圖3，其中與陳釀時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系的成分有8種：N-苯甲酰甘氨酸乙酯、6-庚烯酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、3-（2-呋喃基）-2-丙烯醛、苯乙酸乙酯、2-十五烷基-1，3-二氧雜環(huán)庚烷、苯甲醛、苯并噻唑；與陳釀時(shí)間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系的成分有12 種：庚酸乙酯、辛酸、2-呋喃甲醇、辛酸乙酯、1-辛烯-3-醇、1-辛醇、α-亞乙基-苯乙醛、2-乙氧基四氫-2H-吡喃、二氫-5-甲基-2（3H）-呋喃酮、丙酸-2-甲基-3-羥基-2，2，4-三甲基戊酯、十九酸乙酯、2，4-二叔丁基苯酚。

圖2 OPLS-DA 分析變量投影重要性預(yù)測(cè)值（VIP 值）Fig. 2 Predicted value of projection importance of OPLS DA analysis variables（VIP value）

2.3 烏衣紅曲黃酒年份基酒相似度分析

以篩選出的與年份基酒年份緊密相關(guān)的20種揮發(fā)性物質(zhì)為對(duì)象，計(jì)算不同年份基酒之間的相似度（表2）。結(jié)果表明，2，4 年陳烏衣紅曲黃酒與2，4 年陳烏衣紅曲黃酒間的相似度在1.000～0.9720 之間，與5，6，7，8，9 年陳黃酒間的相似度在0.9622～0.9420 之間，與10，12，15 年陳黃酒間的相似度在0.9369～0.9342 之間。同樣，結(jié)合前面分析的結(jié)果，同一陳釀區(qū)間的相似度較高，不同陳釀區(qū)間相似度則較低，因而根據(jù)年份特征性揮發(fā)性成分的相似度，也可將烏衣紅曲黃酒基酒劃分為2～4，5～9 年和10～15 年3 個(gè)不同陳釀階段，分別命名為：青陳酒、中陳酒和老陳酒。

2.4 烏衣紅曲黃酒年份基酒揮發(fā)性物質(zhì)特征指紋圖譜構(gòu)建

以年份相關(guān)性|r|＞0.5 成分為特征峰，保留時(shí)間為X 軸，吸收峰強(qiáng)度為Y 軸，繪制青、中、老不同陳釀區(qū)間的紅曲黃酒年份特征揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)照指紋圖譜（圖4），圖譜中特征峰吸收強(qiáng)度分別為2～4，5～9，10～15 年特征峰強(qiáng)度的平均值，其余非特征揮發(fā)性物質(zhì)峰未在圖譜中顯示。其中，在青陳酒中，N-苯甲酰甘氨酸乙酯未發(fā)現(xiàn)，隨著陳釀時(shí)間的延長，在5～15 年陳釀階段含量逐漸增加，其指紋圖譜應(yīng)由除N-苯甲酰甘氨酸乙酯外的19 種特征揮發(fā)性物質(zhì)組成；在老陳酒中，2-呋喃甲醇、α-亞乙基-苯乙醛和2，4-二叔丁基苯酚在2～4 年陳釀階段含量最高，隨著陳釀時(shí)間的延長逐漸減少，在10～15 年基酒中未檢測(cè)到，因而其指紋圖譜由除以上3 種成分外的17 種特征揮發(fā)性物質(zhì)構(gòu)成；中陳酒特征揮發(fā)性物質(zhì)組成介于青、老陳酒之間，其指紋圖譜由對(duì)照?qǐng)D譜中標(biāo)示的20 種揮發(fā)性物質(zhì)作為特征峰構(gòu)建而成。

圖4 青、中、老陳紅曲黃酒對(duì)照指紋圖譜Fig. 4 Comparison fingerprints of youth age，middle age and old age Hongqu Huangjiu

2.5 揮發(fā)性物質(zhì)特征指紋圖譜驗(yàn)證

為驗(yàn)證建立的指紋圖譜的可靠性，距第1 次取樣間隔約2 年后從基酒原廠再次取樣，樣品陳釀時(shí)間分別為6 年和11 年?；邳S酒基酒年份特征成分的OPLS-DA 分析（圖5）及基酒與對(duì)照?qǐng)D譜相似度比較（表3）的結(jié)果顯示，6 年基酒與中陳酒（5～9 年）更接近，11 年基酒與老陳酒（10～15年）更接近，結(jié)果得到了互相驗(yàn)證，表明所構(gòu)建的揮發(fā)性物質(zhì)特征指紋圖譜能夠較好地區(qū)分不同陳釀時(shí)期的烏衣紅曲黃酒基酒。

圖5 基于基酒年份特征成分的OPLS-DA 分析Fig. 5 OPLS-DA analysis based on the age characteristics of base liquor

表3 6 年和11 年陳基酒與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度Table 3 Similarity between 6-year and 11-year old base liquor with comparison fingerprints

3 討論與結(jié)論

黃酒在其生命期內(nèi)，品質(zhì)也會(huì)隨著貯藏時(shí)間的延長在不斷地發(fā)生變化。新釀制出來的基酒通過“陳化”可以有效促進(jìn)酒精分子之間以及酒精分子與水分子之間的締合，促進(jìn)醇與酸之間的酯化，使酒香味馥郁，口味甘順、柔和[12]。黃酒的揮發(fā)性物質(zhì)成分是決定黃酒質(zhì)量的重要因素之一，影響黃酒的感官評(píng)價(jià)質(zhì)量與風(fēng)格確定。黃酒的風(fēng)味主要來源于原料、發(fā)酵過程中的微生物活動(dòng)與陳化等[18-19]。酒類香氣成分分析技術(shù)日益成熟且研究較多，常見的預(yù)處理技術(shù)有液液萃取、蒸餾萃取、動(dòng)態(tài)或靜態(tài)頂空法、固相萃取和固相微萃取等[20-21]。其中固相微萃取結(jié)合頂空分析建立起來的樣品預(yù)處理技術(shù)集采樣、萃取、濃縮于一體，綠色環(huán)保、方便快捷、成本低、重現(xiàn)性好，已成為酒類揮發(fā)性成分分析主流的技術(shù)之一[22-23]。

在本研究中烏衣紅曲黃酒基酒中揮發(fā)性物質(zhì)以酯類為主，其含量達(dá)到約一半，其次是醇類，其中篩選出的年份特征成分中除了1-辛烯-3-醇、苯甲醛等在黃酒風(fēng)味物質(zhì)的報(bào)道中已有報(bào)道[13-15]，還有一些少有報(bào)道6-庚烯酸乙酯、乙酸-2-乙基苯酯、3-（2-呋喃基）-2-丙烯醛等成分，可見不同產(chǎn)地、釀造工藝生產(chǎn)的黃酒[16-17]，對(duì)黃酒成分尤其微量成分的組成影響較大，而這些成分隨著陳釀時(shí)間的變遷而消長，其成為陳釀品質(zhì)的重要標(biāo)志之一。N-苯甲酰甘氨酸乙酯在2～4 年陳酒中未發(fā)現(xiàn)，5～9 年酒中開始出現(xiàn)，10～15 年酒中顯著增加，而2-呋喃甲醇、α-亞乙基-苯乙醛和2，4-二叔丁基苯酚則隨著陳釀時(shí)間的延長逐漸減少，在10 年及以上基酒中未檢出，因而成為烏衣紅曲黃酒基酒陳釀時(shí)間的重要特征成分。

指紋圖譜能從整體反映出酒類產(chǎn)品的質(zhì)量，故近年來對(duì)酒類指紋圖譜技術(shù)研究越來越廣泛，因釀造用曲和工藝的不同導(dǎo)致紅曲黃酒的揮發(fā)性物質(zhì)差異，從而使不同的紅曲黃酒的指紋圖譜不同。本研究中構(gòu)建的烏衣紅曲黃酒基酒特征揮發(fā)性物質(zhì)指紋圖譜，將2～15 年陳黃酒區(qū)分為3 個(gè)陳釀階段，這可能是由于烏衣紅曲黃酒基酒的陳釀是一個(gè)循序漸進(jìn)的過程，陳釀間隔期短，其中的揮發(fā)性物質(zhì)變化并不顯著，導(dǎo)致區(qū)間內(nèi)基酒間相似度高，不足以將各年份嚴(yán)格地區(qū)分開來，并準(zhǔn)確的判定基酒的陳釀時(shí)間。因此，將烏衣紅曲黃酒基酒根據(jù)陳釀的不同階段加以區(qū)分，而不是某一年，更為貼近黃酒生產(chǎn)中的實(shí)際情況。

本研究基于篩選年份特征揮發(fā)性物質(zhì)，構(gòu)建烏衣紅曲黃酒基酒年份基酒指紋圖譜，可用于山里陳紅曲黃酒陳釀期判別，該結(jié)果為烏衣紅曲黃酒基酒的質(zhì)量控制以及年份鑒別提供了技術(shù)參考。