劉 紅，陳一瑜，劉慶梅，張凌晶，曹敏杰，劉光明*

（1 集美大學(xué)海洋食品與生物工程學(xué)院 廈門市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心 福建廈門361021 2 華僑大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院 福建廈門 361009）

水產(chǎn)品因鮮美的味道和豐富的營養(yǎng)而深受消費(fèi)者青睞。其中，魚和甲殼類水產(chǎn)品屬于聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織認(rèn)定的過敏食物[1]。流行病學(xué)及食物過敏調(diào)查發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)品是我國過敏人群的主要致敏物[2-4]。近年來我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和水產(chǎn)食品加工業(yè)發(fā)展迅猛，2021 年我國水產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)到6 693 萬t，食用消費(fèi)量2 965 萬t，加工消費(fèi)達(dá)到2 783 萬t，消費(fèi)總量6 888 萬t[5]。隨著水產(chǎn)品消費(fèi)量出現(xiàn)的大幅度增長，隨之引發(fā)的水產(chǎn)品過敏問題也日益嚴(yán)峻。除了水產(chǎn)品本身外，其作為原料或配料被廣泛添加到各類食品中，由此擴(kuò)大了含有水產(chǎn)品致敏成分的食物種類，導(dǎo)致出現(xiàn)許多潛在的水產(chǎn)品過敏原組分[6-7]。截至2021 年3 月，世界衛(wèi)生組織和國際免疫學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)過敏原命名小組已命名1 036 種過敏原[8]，同時(shí)指出應(yīng)在產(chǎn)品標(biāo)簽中提示過敏原信息；我國也頒布預(yù)包裝食品標(biāo)簽通則，增加了致敏物質(zhì)的標(biāo)識(shí)[9]。事實(shí)上水產(chǎn)食品在加工、運(yùn)輸、貯藏過程中有可能受到外來過敏原的污染，標(biāo)簽中難以對(duì)交叉污染產(chǎn)生的過敏原進(jìn)行標(biāo)注。消費(fèi)者僅根據(jù)明確的標(biāo)簽標(biāo)識(shí)，難以預(yù)防對(duì)過敏原的攝入[10]。由此水產(chǎn)食物過敏引起的食品安全問題日益嚴(yán)峻，嚴(yán)重制約了行業(yè)的發(fā)展。明確水產(chǎn)食品中的過敏原，利用適當(dāng)?shù)臋z測(cè)技術(shù)對(duì)水產(chǎn)品及其加工、運(yùn)輸、貯藏過程中所含過敏原進(jìn)行檢測(cè)、監(jiān)控，有利于評(píng)估水產(chǎn)品過敏的潛在風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)防過敏疾病的發(fā)生。根據(jù)近年的研究報(bào)道，本文概述水產(chǎn)品過敏原及其檢測(cè)技術(shù)。

1 水產(chǎn)品過敏原概述

水產(chǎn)品過敏原，來自水產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)，能夠誘導(dǎo)人體產(chǎn)生特異性IgE 抗體應(yīng)答的抗原性物質(zhì)[11]，一般分子質(zhì)量為10～100 ku，且相對(duì)分子質(zhì)量越高，結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，其致敏性越強(qiáng)。其多為酸性糖蛋白，具有酸性等電點(diǎn)。由于過敏原的糖基化作用可能在一定程度上使其維持更為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，因此普遍具有較好的耐酸堿和熱穩(wěn)定性，耐胃腸液中消化。在食品加工處理和人體消化過程中過敏原不易被破壞，相關(guān)過敏人群一旦食用，極易引發(fā)水產(chǎn)食物過敏性疾病，發(fā)病癥狀也趨于復(fù)雜化和嚴(yán)重化，在皮膚、胃腸系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)方面會(huì)出現(xiàn)不同程度的過敏癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至昏厥、休克[12]。不同水產(chǎn)過敏原可能存在相同的抗原決定簇，從而發(fā)生免疫交叉反應(yīng)，使過敏患者在食用不同的水產(chǎn)品時(shí)均發(fā)生過敏反應(yīng)，且因個(gè)體差異，最低食用量各異，過敏癥狀通常伴隨終身[13-15]。

水產(chǎn)品富含蛋白質(zhì)，其中只有極少數(shù)蛋白質(zhì)能夠引發(fā)過敏反應(yīng)。通常將能誘發(fā)50%過敏患者產(chǎn)生過敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)稱為主要過敏原，而次要過敏原即其它引起過敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)。目前已發(fā)現(xiàn)并鑒定的魚類過敏原有小清蛋白（Parvalbumin，PV）、魚類膠原蛋白（Collagen，CO）、β-烯醇酶（β-Enolase）、醛縮酶A（Aldolase A）、魚卵中的β′-組分（β′-Component，β′-c）及魚精蛋白（Protamine）等；甲殼類水產(chǎn)品過敏原有原肌球蛋（Tropomyosin，TM）、精氨酸激酶（Arginine kinase，AK），肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白（Sarcoplasmic calcium-binding protein，SCP）、磷酸丙 糖異構(gòu) 酶（Triosephosphate isomerase，TIM）、肌球蛋白輕鏈（Myosin light chain，MLC）、細(xì)絲蛋白c（Filamin C，F(xiàn)LN c）、肌鈣蛋白C（Troponin C，TnC）和血藍(lán)蛋白（Hemocyanin，HMC）等[16]，其理化性質(zhì)和生物學(xué)功能詳見表1。目前，關(guān)于水產(chǎn)品過敏原的檢測(cè)類研究主要集中在魚類主要過敏原PV、甲殼類及軟體類動(dòng)物泛過敏原TM 中。

表1 水產(chǎn)品過敏原的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能Table 1 Physicochemical properties and biological functions of aquatic products allergens

2 水產(chǎn)品過敏原檢測(cè)技術(shù)

水產(chǎn)品過敏原的檢測(cè)技術(shù)是基于生物標(biāo)志物（DNA 或蛋白質(zhì)）開發(fā)的[50-51]，主要有基于基因水平的核酸檢測(cè)技術(shù)和基于蛋白水平的免疫檢測(cè)技術(shù)及質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)。核酸檢測(cè)技術(shù)是通過測(cè)定擴(kuò)增的過敏原DNA 片段來實(shí)現(xiàn)，主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)等。免疫檢測(cè)技術(shù)是通過抗原和抗體的特異性結(jié)合產(chǎn)生的變化來實(shí)現(xiàn)，主要包括酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）技術(shù)、免疫印跡技術(shù)、免疫層析技術(shù)、免疫傳感器技術(shù)等。質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)是通過測(cè)定過敏原完整蛋白或酶解肽段的離子質(zhì)荷化來實(shí)現(xiàn)，主要包括自上而下（Top-down）分析策略、自下而上（Bottom-up）分析策略。

2.1 基于基因水平的核酸檢測(cè)技術(shù)

2.1.1 PCR 技術(shù) 根據(jù)編碼過敏原的DNA 序列，設(shè)計(jì)特異性引物，使用DNA 聚合酶進(jìn)行變性-退火-延伸多次循環(huán)擴(kuò)增，利用擴(kuò)增后的核酸產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，從而實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品過敏原的定性分析。該技術(shù)的特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。Phan 等[52]設(shè)計(jì)了特異性引物Tropo-F 和Tropo-R，建立了用于檢測(cè)蝦源主要過敏原TM 基因的PCR 檢測(cè)方法，可以成功識(shí)別加工食品中的TM 基因。常規(guī)PCR 技術(shù)主要對(duì)單一過敏原進(jìn)行定性檢測(cè)，若在同一PCR 反應(yīng)體系中加上多對(duì)特異性引物，即可實(shí)現(xiàn)多重PCR 反應(yīng)，可對(duì)水產(chǎn)品中多種過敏原進(jìn)行定性檢測(cè)[53]。Suh 等[54]利用多重PCR 技術(shù)并與毛細(xì)管電泳技術(shù)相結(jié)合，對(duì)牡蠣、貽貝、鮑魚、蛤蜊TM 基因進(jìn)行測(cè)定，DNA 的檢測(cè)限（LOD）為16 pg/mL。然而，多重PCR 易受引物間競爭擴(kuò)增的影響，方法體系優(yōu)化相對(duì)復(fù)雜。PCR技術(shù)不會(huì)嚴(yán)格要求模板DNA 的純度及其完整性，所需PCR 儀造價(jià)較便宜，然而后續(xù)的基因分析還需借助電泳、熒光檢測(cè)或測(cè)序技術(shù)才能實(shí)現(xiàn)最終檢測(cè)任務(wù)，檢測(cè)流程繁瑣，不能準(zhǔn)確定量，而且極微量的污染即可造成假陽性。

2.1.2 實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù) 通過在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)累積的熒光強(qiáng)度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)水產(chǎn)品中過敏原的定性、定量分析。其中特異性的熒光探針Taqman探針法和非特異性的SYBR Green I 熒光染料法是常用的熒光標(biāo)記方法。Sun 等[55]建立了一種基于TaqMan 標(biāo)記探針技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)魚類主要過敏原PV 的方法，DNA 的靈敏度達(dá)5 pg/mL。Prado 等[56]建立了同時(shí)檢測(cè)鯖魚和金槍魚DNA 的實(shí)時(shí)熒光PCR 方法，靈敏度高達(dá)5 pg/mL。該技術(shù)把核酸擴(kuò)增、雜交、光譜分析和實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)了從定性到定量的飛躍，自動(dòng)化程度更高，避免了交叉污染，省去了后續(xù)染色及熒光檢測(cè)等步驟，節(jié)省人力，準(zhǔn)確度更高，然而需要實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，設(shè)備成本相對(duì)較高。

2.1.3 LAMP 技術(shù) LAMP 技術(shù)是一種新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，針對(duì)靶基因的6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 條特異性引物，等溫條件下在鏈置換型DNA 聚合酶作用下，可將目標(biāo)基因在15～60 min 內(nèi)擴(kuò)增9～10倍，根據(jù)產(chǎn)物渾濁度或綠色熒光等的指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中過敏原的定性、定量分析。Sheu 等[57]利用LAMP 技術(shù)30 min 內(nèi)可以檢測(cè)出含有0.01%的蝦類DNA，與螃蟹、龍蝦等其它甲殼類動(dòng)物的DNA無交叉反應(yīng)，可用于對(duì)食品中蝦類過敏原的鑒定。張懿翔等[58]利用LAMP 技術(shù)檢測(cè)出含牡蠣過敏成分0.1%，DNA 質(zhì)量濃度為0.01 pg/mL 的樣品。該技術(shù)縮短了檢測(cè)時(shí)間，可在微量體系下完成，對(duì)儀器、設(shè)備的要求降低，只需水浴鍋或恒溫箱就能實(shí)現(xiàn)反應(yīng)，產(chǎn)物易檢測(cè)，簡便、快捷，適合基層快速診斷，然而引物設(shè)計(jì)難度較大，較高的擴(kuò)增效率也易引起環(huán)引物間的非特異性配對(duì)，導(dǎo)致假陽性的結(jié)果。

2.2 基于蛋白水平的免疫技術(shù)

2.2.1 ELISA 技術(shù) ELISA 技術(shù)是將免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)。將已知的抗原或抗體吸附在聚苯乙烯微量反應(yīng)板表面，利用酶標(biāo)記抗體與之發(fā)生特異性結(jié)合，并以酶作用底物后的顯色深淺來實(shí)現(xiàn)對(duì)水產(chǎn)品中過敏原的定性、定量分析。主要有競爭法、雙抗體夾心法、間接法等。Cai 等[59]制備了鰱魚細(xì)小蛋白單克隆抗體，建立了一種競爭ELISA 法測(cè)定鰱魚體內(nèi)PV，LOD 為0.04 μg/mL。Koppelman 等[60]用大西洋蛤和海洋圓蛤混合蛋白免疫兔和綿羊，制得包被抗體和二抗，建立雙抗體夾心ELISA 檢測(cè)食品中蛤蜊過敏原，LOD 為2.5 mg/kg。雙抗體夾心ELISA法靈敏度和特異性更高，被廣泛用于水產(chǎn)品過敏原的篩選和常規(guī)檢測(cè)領(lǐng)城，然而所檢測(cè)的抗原必須擁有兩個(gè)以上的抗體結(jié)合部位，制備抗體比較困難。ELISA 技術(shù)目前只能針對(duì)一種過敏原的分析，無法進(jìn)行多殘留檢測(cè)，對(duì)具有抗原決定簇類似結(jié)構(gòu)的過敏原存在一定的交叉反應(yīng)。目前，快速和高通量的過敏原ELISA 檢測(cè)試劑盒已商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化[61]。只需1 臺(tái)酶標(biāo)儀即可大批量檢測(cè)樣品，方法簡便，易于推廣，然而受樣本基質(zhì)、試劑以及試驗(yàn)操作等因素影響較大。

2.2.2 免疫印跡（Western blot）技術(shù) 免疫印跡技術(shù)是將特異的固相免疫和高分辨率的凝膠電泳相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)，通過單向或二維凝膠電泳技術(shù)將需要測(cè)定的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜等固相載體上，利用抗原和抗體在固定相上發(fā)生免疫反應(yīng)，再與酶標(biāo)記的抗體反應(yīng)，并通過底物顯色完成水產(chǎn)品中過敏原的定性或半定量分析。汪寧等[62]應(yīng)用抗蛙PV 單克隆抗體，利用Western blot 分析5 種魚、2 種魚糜制品和3 種魚罐頭中PV，結(jié)果顯示該方法能有效確定魚類制品中的PV。該技術(shù)主要用于發(fā)現(xiàn)和鑒定新的過敏原，通常與斑點(diǎn)免疫印跡法（Dot blot）相結(jié)合進(jìn)行聯(lián)合確認(rèn)。Dotblot 樣品不需通過電泳轉(zhuǎn)膜，直接點(diǎn)在固相載體上，根據(jù)斑點(diǎn)的強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)食品中過敏原的半定量檢測(cè)。Han 等[36]對(duì)葡萄牙牡蠣SCP 的過敏原性研究，采用Western blot 及Dot blot 聯(lián)合分析SCP 的免疫結(jié)合活性。Western blot 技術(shù)先利用電泳的方式可分離不同分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)組分，再進(jìn)行過敏原的確認(rèn)，可有效避免蛋白質(zhì)抑制劑存在的影響。對(duì)于復(fù)雜的樣品，可采用雙向電泳實(shí)現(xiàn)更高程度的分離。免疫印跡技術(shù)對(duì)試劑需求量少，分析容量大，檢測(cè)流程繁瑣，分析時(shí)間長，易受水產(chǎn)品基質(zhì)的影響。

2.2.3 免疫層析技術(shù) 免疫層析技術(shù)是將免疫技術(shù)和色譜層析相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)，將抗體固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，把干燥的一端浸入待測(cè)物后，樣品沿膜向前運(yùn)動(dòng)達(dá)到檢測(cè)區(qū)，與標(biāo)記的抗體捕獲物特異結(jié)合而聚集顯色，從而實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中過敏原的定性分析。檢測(cè)的關(guān)鍵在于著色標(biāo)記物的靈敏度，常用免疫膠體金或免疫酶染色作為標(biāo)記物，一些新型材料如超順磁性納米微球具有較高的靈敏度。Zhang 等[63]以Fe3O4/Au 納米微球?yàn)闃?biāo)記物，制備的免疫層析試紙條可在15 min 內(nèi)檢測(cè)魚過敏原PV，具有良好的檢測(cè)特異性及穩(wěn)定性，LOD 為2 ng/mL。利用該技術(shù)制備的檢測(cè)試紙，對(duì)待測(cè)物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確顯色，不需要其它儀器、設(shè)備和專業(yè)臨檢人員，用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，操作簡單，攜帶方便，基層可以開展，然而檢測(cè)結(jié)果靠肉眼判斷，存在靈敏度較低，難于定量化的局限，同時(shí)標(biāo)記物制作成本較高。

2.2.4 免疫傳感器技術(shù) 免疫傳感器技術(shù)是將免疫反應(yīng)的特異性與傳感技術(shù)的高靈敏度相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)，將抗體作為識(shí)別元件，利用抗原-抗體發(fā)生的特異性結(jié)合所產(chǎn)生的物理、化學(xué)信號(hào)的變化來實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中過敏原的定性或定量分析[64]。Angulo 等[65]將絲網(wǎng)印刷電極結(jié)合羧甲基化磁珠作為抗體固相，將辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗構(gòu)建在磁珠上，并與電化學(xué)傳感系統(tǒng)耦合，研制出一種用于微量檢測(cè)蝦TM 電化學(xué)免疫傳感器，3 h 內(nèi)的LOD 為47 pg/mL，磁珠的使用提高了捕獲抗原的效率，利用磁珠修飾絲網(wǎng)印刷電極提高了電極的導(dǎo)電率。Zhou 等[66]將抗TM 單克隆抗體固定在納米金薄膜傳感器芯片表面，建立表面等離子共振免疫傳感器技術(shù)，實(shí)現(xiàn)貝類樣品中TM 的實(shí)時(shí)檢測(cè)，LOD 為1.0 μg/mL。免疫傳感器技術(shù)利用傳感器記錄、檢測(cè)和分析抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果，簡化了分析過程，減少了分析時(shí)間，降低了檢測(cè)下限，提高了靈敏度，具有設(shè)備小型化，測(cè)量過程自動(dòng)化的特點(diǎn)，然而生物傳感器制作較為復(fù)雜，費(fèi)用較高。

2.3 基于蛋白水平的質(zhì)譜技術(shù)

2.3.1 Top-down 分析策略 Top-down 分析策略是將完整蛋白碎裂后進(jìn)行全局分析。該分析策略樣品制備相對(duì)簡單，無需進(jìn)行蛋白質(zhì)酶解，也不依賴抗原抗體的制備，試驗(yàn)耗時(shí)減少，具有高分辨率、高靈敏度、蛋白序列覆蓋率高等優(yōu)點(diǎn)。該策略主要用于完整過敏原蛋白的定性確認(rèn)，定量分析應(yīng)用較少。Top-down 定性確認(rèn)策略通常將完整的過敏原離子化后引入到質(zhì)譜，通過碎片裂解技術(shù)最終得到完整蛋白和碎片離子的質(zhì)荷比信息，最后采用生物信息檢索推演多肽序列和修飾位點(diǎn)，可以鑒定出相關(guān)的蛋白質(zhì)亞型和翻譯后修飾位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中過敏原的定性鑒定。一般利用分離技術(shù)（如液相色譜或2-D 凝膠電泳）從復(fù)雜樣品中分離出完整的過敏蛋白，選擇高分辨率和精確質(zhì)量的質(zhì)譜儀進(jìn)行分析，如傅里葉變化離子回旋共振質(zhì)譜儀（FTICR-MS）或靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜儀（Orbitrap-MS）。常見的離子化技術(shù)有：電噴霧電離（ESI）、基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）等。常見的碎片離子裂解技術(shù)主要有：碰撞誘導(dǎo)解離（CID）、電子捕獲解離、高能碰撞引入解離、紫外光解離等[67]。Carrera 等[68]通過ESI-FTICR-MS 對(duì)鱈魚過敏原小清蛋白PV 直接測(cè)定，多重電荷態(tài)分布顯示了具有不同的PV 亞型，并對(duì)所有PV 亞型進(jìn)行準(zhǔn)確分子量測(cè)定。Top-down 定性確認(rèn)可獲得蛋白質(zhì)的完整形態(tài)特征，檢測(cè)具有二硫鍵的四級(jí)結(jié)構(gòu)，以及蛋白質(zhì)翻譯后修飾位點(diǎn)和修飾模式之間的關(guān)系數(shù)據(jù)。然而該策略存在得到的信息相對(duì)有限、分析通量相對(duì)較低等缺點(diǎn)，樣品需高度純化，且較難分析大分子量的蛋白質(zhì)，靈敏度通常因?yàn)榈鞍踪|(zhì)帶電量不同而受限。

2.3.2 Bottom-up 分析策略 Bottom-up 分析策略是通過分析酶解肽段來解析蛋白序列，該分析策略具有高自動(dòng)化、高分辨率、高靈敏度、樣品用量少、分析速度快、高特異性、高通量、分離和鑒定同時(shí)進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)，也是目前蛋白質(zhì)組學(xué)分析最常用的分析方法。該策略可用于過敏原酶解肽段的定性確認(rèn)和特征肽段的定量檢測(cè)。

Bottom-up 定性確認(rèn)策略利用特異性酶將過敏原酶解成多肽片段的混合物，根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜或串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)到的各種多肽的準(zhǔn)分子、離子或碎片離子信息，與已知蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索匹配，結(jié)合匹配度打分及錯(cuò)配過濾，利用得到肽段的確切序列拼接出各蛋白的完整序列，從而實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中過敏原的定性鑒定。定性鑒定方法常采用肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）和肽片段指紋圖譜（PFF）。PMF是肽段進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析后與數(shù)據(jù)庫匹配的最佳結(jié)果，適用于單一蛋白質(zhì)分析?；旌系鞍踪|(zhì)酶解后可能存在相同的肽段，會(huì)增加分析的復(fù)雜性，質(zhì)量相似的肽段亦會(huì)增加匹配的難度。PMF 分析常使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS），如Liu 等[69]對(duì)淡水魚團(tuán)頭魴中主要存在的過敏原進(jìn)行分離后，通過雙向電泳膠內(nèi)酶切結(jié)合MALD 鑒定出過敏原AK 和烯醇酶。PFF是肽段進(jìn)行二級(jí)碎裂質(zhì)譜分析后與數(shù)據(jù)庫匹配的最佳結(jié)果，通過串聯(lián)質(zhì)譜碎裂分析可以獲得豐富的肽段碎片離子信息，可用于表征多個(gè)蛋白酶解的混合物，對(duì)于質(zhì)量相似的肽段確認(rèn)更準(zhǔn)確，極大地增加了數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果的可靠性。PFF 多使用具備CID 功能的質(zhì)譜，如潘曉東等[70]采用超高效液相色譜-四極桿靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜儀（UPLC-Q-Orbitrap-MS）鑒定了沼蝦中的4 種過敏原，分別為TM、AK、SCP 和HMC，肽段覆蓋率分別為53%，36%，12%和12%。由于樣品經(jīng)過酶解，Bottom-up 定性確認(rèn)不僅增加了檢測(cè)時(shí)間，還會(huì)破壞蛋白質(zhì)不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致無法識(shí)別蛋白質(zhì)變異，無法正確分析蛋白質(zhì)翻譯后修飾之間的關(guān)系，蛋白序列覆蓋率相對(duì)較低。

Bottom-up 定量分析策略常使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記法，根據(jù)定性檢測(cè)結(jié)果結(jié)合相關(guān)蛋白質(zhì)組學(xué)軟件挑選1 條或多條特征肽段，將同位素標(biāo)記的特征肽段作為內(nèi)標(biāo)，酶解肽段混合物經(jīng)超高效液相色譜（UPLC）分離，利用串聯(lián)質(zhì)譜的選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)/多反應(yīng)監(jiān)測(cè)/平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM/MRM/PRM）模式對(duì)目標(biāo)特征肽指定離子對(duì)強(qiáng)度進(jìn)行監(jiān)測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中多種過敏原的同時(shí)定量分析[71]。Stella 等[72]篩選TM 兩個(gè)特征肽，分別為限定肽和量化肽，采用UPLC-Q-Orbitrap-MS 在PRM 模式下檢測(cè)甲殼類水產(chǎn)品的TM，LOD 為5 μg/mL。Fan等[73]選擇靈敏度高的ANIQLVEK 作為定量標(biāo)記肽，利用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜（UPLCQqQ-MS）在MRM 模式下檢測(cè)蝦、蟹中TM 的LOD 為0.1 μg/mL。孟佳等[74]利用UPLC-Q-Orbitrap-MS 實(shí)現(xiàn)了南美白對(duì)蝦、大閘蟹、青蟹、金槍魚、大西洋鮭魚的7 種過敏原蛋白的快速篩查，并選取30 個(gè)特征肽，利用UPLC-QqQ-MS 建立MRM 定量檢測(cè)方法，LOD 為2.0～3.5 μg/mL。Bottom-up 定量分析利用液相色譜的高效分離和質(zhì)譜的高分辨率，通過對(duì)所選的特征肽段進(jìn)行檢測(cè)，有效避免其它肽段的干擾，提高重現(xiàn)性、靈敏度和特異性。使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的特征肽可解決基質(zhì)效應(yīng)，建立的方法更加準(zhǔn)確可靠。

2.4 水產(chǎn)品過敏原檢測(cè)技術(shù)的比較

過敏原檢測(cè)手段多樣，各種檢測(cè)技術(shù)的分析要求、所需設(shè)備、優(yōu)缺點(diǎn)各異[75]，詳見表2。基于基因水平的核酸檢測(cè)技術(shù)不易受熱處理和壓力等作用的影響，更加靈敏可靠，且對(duì)于缺乏特異性單抗的過敏原，可利用已知過敏原的基因序列進(jìn)行檢測(cè)。由于核酸檢測(cè)技術(shù)屬于間接性檢測(cè)，檢測(cè)對(duì)象是DNA 非致敏蛋白，因此不能真正反映水產(chǎn)品過敏原的致敏性?；诘鞍姿降拿庖邫z測(cè)技術(shù)特異性高、操作簡便、無需復(fù)雜的試驗(yàn)操作，然而制備抗體比較困難，且水產(chǎn)品在實(shí)際加工生產(chǎn)中，各種加工處理會(huì)破壞致敏蛋白的結(jié)構(gòu)，從而破壞其抗原決定簇，導(dǎo)致分析準(zhǔn)確度降低，并且因樣本、試劑及操作等因素而造成檢測(cè)結(jié)果的偏差，穩(wěn)定性較差[76]?；诘鞍姿降馁|(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)具有高自動(dòng)化、高分辨率、高靈敏度、高特異性、高通量、樣品用量少、分析速度快、分離和鑒定同時(shí)進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)，是分析水產(chǎn)品過敏原的有力工具，既克服了核酸檢測(cè)技術(shù)不能直接分析致敏蛋白的缺點(diǎn)，又改善了免疫檢測(cè)技術(shù)存在的檢測(cè)低通量和交叉干擾的弊端。質(zhì)譜檢測(cè)在鑒定過敏原蛋白中起重要作用，無需制備抗原抗體，尤其在復(fù)雜基質(zhì)中多種過敏原的定量檢測(cè)方面具有很大的優(yōu)勢(shì)，依賴的特征肽段幾乎不受加工影響，穩(wěn)定性高，可以滿足直接檢測(cè)目標(biāo)蛋白和變性蛋白的要求[77-78]。然而，質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)技能，限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

表2 水產(chǎn)品過敏原檢測(cè)方法比較Table 2 Comparison of allergen detection methods for aquatic products

3 結(jié)語

水產(chǎn)品過敏原種類眾多，過敏原檢測(cè)手段多樣，單一檢測(cè)方法很難做到普遍適用性。利用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)來對(duì)水產(chǎn)過敏原進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)、監(jiān)控，結(jié)合試驗(yàn)條件和成本，選用經(jīng)濟(jì)、可靠又快速、明確的識(shí)別與定量的方法，準(zhǔn)確檢測(cè)水產(chǎn)食品中隱藏的過敏原，降低生產(chǎn)過程中的交叉污染，有利于評(píng)估水產(chǎn)品過敏的潛在風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)防水產(chǎn)食物過敏疾病的發(fā)生。

現(xiàn)有過敏原的檢測(cè)集中在少數(shù)主要過敏原中，針對(duì)新型或次要過敏原的檢測(cè)有待進(jìn)一步探究。未來水產(chǎn)品中過敏原檢測(cè)將向更加準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)、普遍適用、高自動(dòng)化、高通量、高靈敏性的方向發(fā)展。同時(shí)，多種方法聯(lián)用將在水產(chǎn)品中的過敏原甚至是潛在過敏原的高效檢測(cè)中發(fā)揮更重要的作用，以更好的保障過敏人群的生命健康。