尹雪蓮，鄭飛洋，戴志遠，2*

（1 浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州310012 2 浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點實驗室 杭州 310012）

棕櫚油酸（C16∶1，POA）屬于ω-7 系單不飽和脂肪酸，在?；湹募谆藬?shù)第7 個碳原子上有1 個雙鍵，屬于中長鏈脂肪酸，難溶于水，易溶于乙醚、正己烷、甲醇等有機溶劑[1-2]。ω-7 單不飽和脂肪酸作為近些年研究的熱點，已被發(fā)現(xiàn)在食品、工業(yè)、醫(yī)療等方面具有廣闊的前景[3]。POA 作為ω-7 單不飽和脂肪酸的代表之一，其在人體健康方面的有益作用也被逐漸發(fā)掘。有試驗表明，POA對2 型糖尿病（T2D）和動脈粥樣硬化性心血管疾病具有一定功效[4]，其次，POA 還可以改善肥胖，調(diào)節(jié)黑色素生成，減少炎癥因子，提高胰島素敏感性，改善血脂異常，調(diào)節(jié)脂肪生成和調(diào)節(jié)全身代謝[5-8]，甚至在代謝的研究前提下被認為是代謝及健康的生物標(biāo)志[9-10]。POA 可以抑制金黃色葡萄球菌、核梭狀厭氧桿菌以及淋病奈瑟菌的活性，具有殺菌特性[11]。作為多不飽和脂肪酸的前體，研究還發(fā)現(xiàn)POA 具有作為生物燃料的潛在可能性[12]。

人在日常飲食中獲取的POA 容易在吸收后被氧化，因此人體需要從外界主動獲取POA 來進行補充[13]。然而，POA 的來源比較稀缺[14]，最常見的分布為深海魚油、澳洲堅果油、沙棘果油以及海洋植物，其中澳洲堅果油和沙棘果油中POA 的含量較高，約為19%～28%[15]。正因如此，我國研究人員大多選用沙棘果油作為富集提純POA 的原料。然而，沙棘的種植受地理位置、氣候和天氣等多種自然條件限制，這些不確定因素也會影響油的質(zhì)量。作為一種非商業(yè)化植物，沙棘主要用來固土防沙，以此來作為富集POA 的原料經(jīng)濟成本太高，不是最佳選擇[16]。我國是一個臨海大國，漁業(yè)資源豐富，漁業(yè)副產(chǎn)物常用于提取油脂。因此，以深海魚油為原料提純POA 或更具經(jīng)濟效益[17]。

棕櫚油酸成本上漲，而市場需求在不斷擴大。在天然來源中POA 含量普遍較低，因此需要尋找更多的途徑，從低成本的原料中富集POA[18]。脂肪酸富集的常用方法有低溫結(jié)晶、尿素包合、分子蒸餾、CO2超臨界萃取、酶法以及色譜法[19-21]。結(jié)晶分離的依據(jù)是不同的脂肪酸熔點不同，而油脂的黏度較高，導(dǎo)致最終分離效果不好，因此可在結(jié)晶過程中加入一定的有機溶劑，不同脂肪酸在溶劑中的溶解度不同，最終能實現(xiàn)較好地分離效果[22]。一般來說，脂肪酸在有機溶劑中的溶解度與鏈長和雙鍵數(shù)目有關(guān)，鏈長越短，雙鍵數(shù)目越多，溶解度越大[22]。與其它富集方法相比，低溫結(jié)晶法所需溶劑量少，不論是時間成本還是經(jīng)濟成本都較低，非常適合用來進行POA 的初步提純。在整個反應(yīng)體系中，溶劑種類、脂肪酸與溶劑的比例、結(jié)晶溫度、結(jié)晶時間是影響富集效果最主要的因素。在以上基礎(chǔ)上，本研究選用深海魚油作原料，用低溫結(jié)晶法富集POA，并探究復(fù)合溶劑的作用以及最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳀魚油（乙酯型），浙江海力生集團有限公司；丙酮、甲醇、正己烷、無水乙醇均為分析純級，國藥試劑有限公司；無水硫酸鈉、乙腈均為分析純級，常青化工有限公司。

1.2 設(shè)備與儀器

7890B 氣相色譜儀，美國Agilent 公司；RE-3000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；HH-2 恒溫水浴鍋，上海奧旗儀器設(shè)備有限公司；AL204 電子天平，梅特勒－托利多有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；MSH380-Pro 磁力攪拌器，浙江簡然儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 魚油脂肪酸組分分析 每個樣品魚油定量為（50±1）mg，分別取至5 mL 具塞試管中，加2 mL 正己烷混勻，加適量無水硫酸鈉吸走殘留水分，取1 mL 用0.22 μL 的有機濾膜過濾到樣品瓶中，進行氣相色譜分析。

色譜條件：HP-88 毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.2 μm）；柱箱溫度70 ℃，前進樣口溫度250℃，前檢測器溫度220 ℃；進樣量1 μL；尾吹氣為高純氮氣，燃氣為高純氫氣，助燃氣為空氣。初始溫度為70 ℃，以4 ℃/min 升至220 ℃，穩(wěn)定20～30 min。

1.3.2 低溫結(jié)晶富集 取一定量的魚油與溶劑，室溫下攪拌10 min 使其混合均勻，再將其置于特定溫度下進行結(jié)晶，一段時間后取出立即在低溫下完成抽濾使兩相分離，非結(jié)晶相50 ℃下真空旋蒸去除溶劑，將得到的脂肪酸用85 ℃以上的熱水多次沖洗至下層澄清。

1.3.3 計算POA 的得率

式中，YPOA——POA 得率，%；m——結(jié)晶完成后得到的脂肪酸質(zhì)量，g；CPOA——結(jié)晶完成后所得到的脂肪酸中POA 的含量，%；m0——初始魚油質(zhì)量，g；C0POA——原料魚油中POA 的含量，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 原油中的主要脂肪酸及含量

由表1 可以看出，原油中飽和脂肪酸的含量偏高，其中肉豆蔻酸（C14∶0）和棕櫚酸（C16∶0）的含量超過了POA，分別為（20.02±0.04）%和（34.74±0.04）%。氣相色譜法分析脂肪酸含量，飽和脂肪酸總含量為61.80%，不飽和脂肪酸總含量為38.20%。一般來說，單不飽和脂肪酸（MUFA）和多不飽和脂肪酸（PUFA）比飽和脂肪酸（SFA）的極性大，因此溶解度也更高[23]。在低溫條件下，飽和脂肪酸會因不能溶解在有機溶劑中而被結(jié)晶出來，所以用低溫結(jié)晶法來富集POA 是可行的。

表1 原油的主要脂肪酸組成Table 1 The main fatty acid composition of crude oil

2.2 低溫結(jié)晶法富集魚油中的POA

2.2.1 溶劑種類對富集效果的影響 鄭飛洋等[24]在不加任何有機溶劑的條件下對魚油進行低溫結(jié)晶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在低溫狀態(tài)下魚油幾乎全部凝結(jié)為固態(tài)，后續(xù)難以實現(xiàn)固相和液相的分離，這證明了低溫結(jié)晶過程中添加有機溶劑的必要性。溶劑的選擇需要考慮溶劑的極性和要富集的目標(biāo)脂肪酸的極性。根據(jù)團隊前期研究及理論基礎(chǔ)[24]，最終選取了乙醇、乙腈、正己烷、甲醇、丙酮、正庚烷、三氯甲烷、石油醚這8 種最常用的和可能有用的有機溶劑，首先進行了單一溶劑種類對富集效果的影響（圖1）。加入溶劑與魚油的質(zhì)量比為1∶4，結(jié)晶溫度為-20 ℃，結(jié)晶時間為3 h。

圖1 不同溶劑對POA 含量的影響Fig. 1 Effect of different solvents on POA content

由圖1 可以看出，添加乙腈、甲醇、乙醇、丙酮之后POA 的含量提升較明顯，含量分別為（21.78±1.20）%，（21.64±0.76）%，（17.83±0.44）%，（16.73±0.09）%，這與Zhang 等[25]和Japir 等[23]的研究結(jié)果類似。三氯甲烷、正庚烷以及石油醚的效果不明顯，不考慮將其作為復(fù)合溶劑種類篩選的對象。在許多富集不飽和脂肪酸的研究中，正己烷是一種良好的溶劑，而在本研究中并未達到理想的效果，在加入正己烷之后POA 的含量僅為（14.26±0.31）%，這可能是因為正己烷的極性過小，不能很好地將魚油中的飽和脂肪酸分離出來[26]。試驗中乙腈和甲醇的富集效果最好，這在一項以甲醇為溶劑分離飽和脂肪酸的研究中可以找到原因[27]，原料油中飽和脂肪酸棕櫚酸（C16∶0）的含量較高，而高飽和脂肪酸在甲醇這類溶劑中的可溶性比相應(yīng)的不飽和脂肪酸低得多，因此在低溫條件下可形成結(jié)晶從而被分離出來，從而實現(xiàn)最終POA 含量的升高。

2.2.2 復(fù)合溶劑對富集效果的影響 在第一步溶劑的篩選之后，選出了效果比較明顯的乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、正己烷5 種溶劑來進一步研究復(fù)合溶劑對富集效果的影響，最終結(jié)果與單一溶劑進行比較。在這5 種溶劑中，丙酮雖常作為低溫結(jié)晶的溶劑，但其富集消耗的時間較長，導(dǎo)致富集效率低[28]，并且在上一步中丙酮的富集效果處于中級水平，因此選用丙酮來進行溶劑的混合，其它4種作為變量考察。在魚油與溶劑質(zhì)量比為1∶4，結(jié)晶溫度為-20 ℃，結(jié)晶時間為3 h 條件下，丙酮與不同溶劑（乙醇、乙腈、正己烷、甲醇）按體積比1∶4混合，最終POA 的含量及得率如圖2 所示。

圖2 復(fù)合溶劑對POA 含量和得率的影響Fig. 2 Effects of compound solvents on POA content and yield

將溶劑換成復(fù)合溶劑之后，POA 的含量均發(fā)生了變化，總體表現(xiàn)為上升趨勢，其中丙酮-乙腈組、丙酮-乙醇組POA 含量分別達到了（23.84±2.22）%和（18.06±0.19）%，比2.2.1 節(jié)中作為單一溶劑加入時分別增長了2.06%和0.23%。丙酮-甲醇組雖然最終得到的POA 含量也較高 【（20.81±0.95）%】，但與作為單一溶劑時的效果差距不明顯，復(fù)合溶劑的作用沒有表現(xiàn)出來。雖然丙酮-正己烷組的得率最高，其含量明顯低于其它3 組，這可能與本研究中所要分離的脂肪酸種類有關(guān)。綜合兩組結(jié)果可知，復(fù)合溶劑的富集效果更好，并且復(fù)合溶劑還可降低經(jīng)濟成本。如雍梁敏等[29]曾用丙酮-乙腈來富集橡膠籽油中的α-亞麻酸，使其含量提高了15.20%。試驗最終選擇丙酮與乙腈復(fù)配來進行后續(xù)操作，而從圖2 可以看出丙酮-乙腈組的得率較低，僅為（30.56±2.84）%，因此還需對復(fù)合溶劑的富集工藝進一步優(yōu)化。

2.2.3 復(fù)合溶劑的體積比對富集效果的影響 溶劑的體積比是影響富集的重要因素。兩種溶劑比例的改變會改變復(fù)合溶劑的極性，當(dāng)二者處在一個合適的體積比時，會形成一種亞穩(wěn)溶液，有利于晶體的形成[30]。在魚油-溶劑質(zhì)量比為1∶4，結(jié)晶溫度為-20 ℃，結(jié)晶時間為3 h 的條件下，選擇乙腈與丙酮混合，考察了丙酮與乙腈體積比為1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，1∶12 5 種比例對POA 富集含量及得率的影響（圖3）。由圖3 可以看出當(dāng)丙酮與乙腈體積比為1∶12 時，POA 的含量及得率均最低，分別為（23.24±0.14）%，（23.84±0.14）%。當(dāng)丙酮與乙腈體積比為1∶4，1∶6，1∶8 時，三者得到的POA 含量無顯著差異（P>0.05），分別為（24.61±1.07）%，（24.83±0.78）%，（24.97±1.59）%。然而，這3 組的得率卻隨乙腈體積占比的增大而下降，分別為（37.86±1.65）%，（31.83±0.99）%，（32.02±2.03）%。原因可能是丙酮在混合溶劑中的比重增加導(dǎo)致溶劑總體的極性下降，一些目標(biāo)物之外的其它脂肪酸也溶解到混合體系中，最終非結(jié)晶相收集到的油重增加，再結(jié)合式（1）計算，導(dǎo)致添加丙酮的比例最大時其得率高于其它組。圖3 可以明顯看出，當(dāng)丙酮與乙腈體積比為1∶10 時，不管是POA 的含量還是得率都顯著優(yōu)于其它組，分別為（26.45±0.32）%，（33.91±0.41）%。相比原油，POA 的含量共增加了13.48%，并且得率也比使用單一溶劑丙酮時的20%的高得多[31]。因此選擇丙酮與乙腈體積比1∶10 來進行后續(xù)研究。

圖3 丙酮-乙腈體積比對POA 含量及得率的影響Fig. 3 Influence of volume ratio of acetone to acetonitrile on POA content and yield

2.2.4 魚油-溶劑質(zhì)量比對富集效果的影響 魚油與溶劑的質(zhì)量比是影響體系平衡的重要因素。魚油質(zhì)量占比增加會導(dǎo)致混合液的黏度增大，導(dǎo)致部分不飽和脂肪酸留在晶體空穴內(nèi)，無法實現(xiàn)更好的分離[32]；若溶劑質(zhì)量占比過大，不僅會溶解部分飽和脂肪酸，還導(dǎo)致溶劑的浪費，后續(xù)回收也會更加困難[33]。因此需要確定合適的魚油-溶劑質(zhì)量比進行富集。首先將魚油與溶劑質(zhì)量比設(shè)為1∶2，1 ∶4，1 ∶6，1 ∶8，1 ∶10，丙酮與乙腈體積比為1 ∶10，結(jié)晶溫度為-20 ℃，結(jié)晶時間為3 h，最終得到的POA 含量及得率如圖4 所示。在魚油-溶劑質(zhì)量比從1∶2 降至1∶10 的過程中，POA 含量呈先上升后下降的趨勢，而得率則是不斷升高。當(dāng)魚油-溶劑質(zhì)量比為1∶2 時，不管是含量還是得率均為最低，分別為（23.47±0.36）%，（12.04±0.19）%。原因為此時油溶比過高，溶液處于過飽和狀態(tài)，雖然這有利于晶體的形成，但也導(dǎo)致非結(jié)晶相丟失了大量的不飽和脂肪酸[30]。當(dāng)魚油-溶劑質(zhì)量比小于1∶6 時，POA 含量下降速率變緩，魚油-溶劑質(zhì)量比為1 ∶8 和1 ∶10 時POA 的含量分別為（26.00±0.42）%，（25.46±0.70）%。然而，當(dāng)魚油-溶劑質(zhì)量比為1∶6 時，POA 的含量最高，為（26.45±0.18）%，此時的得率為（54.26±0.37）%。盡管魚油-溶劑質(zhì)量比降低對POA 得率提高的效果明顯，但溶劑比例太大會造成溶劑的大量消耗，不適用于大量富集。因此綜合考慮，以含量指標(biāo)為第一要素選擇魚油-溶劑質(zhì)量比為1∶6 進行后續(xù)研究。

圖4 魚油-溶劑質(zhì)量比對POA 含量及得率的影響Fig. 4 Influence of mass ratio of fish oil to solvent on POA content and yield

2.2.5 結(jié)晶溫度對富集效果的影響 溫度關(guān)系著晶體的生長，是低溫結(jié)晶過程中的重要參數(shù)之一。一般來說，在其它條件不變的情況下，溫度越低，飽和脂肪酸形成結(jié)晶的趨勢越強[34]。當(dāng)溶液處于較低溫度時，體系黏度較小，有利于分子擴散，同時也增加了分子附著到生長晶體表面的可能性[35]。本研究在丙酮-乙腈體積比為1∶10、魚油-溶劑質(zhì)量比為1 ∶6 的條件下，依次將樣品放在-5，-20，-30，-40，-60 ℃以及-80 ℃溫度下冷凍結(jié)晶3 h，考察結(jié)晶溫度對POA 含量和得率的影響。如圖5 所示，除-5 ℃外，其它5 組的POA 含量沒有過于明顯的變化。當(dāng)結(jié)晶溫度為-5 ℃時，POA 的含量最低，此時得率最高，含量與得率分別為（21.52±1.39）%，（60.68±3.91）%。這是由于結(jié)晶溫度過高，不能使飽和脂肪酸完全結(jié)晶，部分飽和脂肪酸在抽濾分離時被帶入非結(jié)晶相，導(dǎo)致最終檢測的POA 含量降低。隨著結(jié)晶溫度的降低，其它5組的POA 含量分別為（26.46±0.93）%，（26.97±0.42）%，（27.92±0.20）%，（28.67±0.37）%以 及（27.66±0.54）%，得率分別為（41.49±1.67）%，（48.41±0.75）%，（42.95±0.31）%，（22.05±0.28）%以及（21.28±0.42）%。其中當(dāng)結(jié)晶溫度為-60 ℃時，POA 的含量雖最高，但其得率卻很低，并且當(dāng)溫度再次降低時，得率也再次下降。原因可能是過低的溫度使結(jié)晶產(chǎn)生量增大，而結(jié)晶為固態(tài)，本身具有很高的黏度，導(dǎo)致抽濾分離時一部分濾液被與結(jié)晶無法分離，最終導(dǎo)致收集到的濾液過少，從而得率降低。雖然-20，-30 ℃以及-40 ℃時POA 的得率較高，但非結(jié)晶相飽和脂肪酸的去除并不徹底?？紤]到-60 ℃條件下得率的降低可能跟魚油的添加量有關(guān)，后續(xù)做了放大試驗來改善這一點，因此，選擇結(jié)晶溫度為-60 ℃繼續(xù)研究。

圖5 結(jié)晶溫度對POA 含量及得率的影響Fig. 5 Influence of crystallization temperature on POA content and yield

2.2.6 結(jié)晶時間對富集效果的影響 考察了3，6，9，12，15 h 這5 個不同時間對富集效果的影響，其中魚油-溶劑質(zhì)量比為1∶6，丙酮-乙腈體積比為1∶10，結(jié)晶溫度為-60 ℃。由圖6 可以看出，結(jié)晶時間的變化對POA 含量的影響沒有其它因素明顯。當(dāng)結(jié)晶時間為3 h 時，POA 得率顯著高于其它組，而此時POA 含量最低，含量與得率分別為（28.67±0.42）%及（22.05±0.32）%。當(dāng)結(jié)晶時間過短，溶液難以達到平衡狀態(tài)，會導(dǎo)致結(jié)晶不能完全析出，也因此最終得到的濾液量較多，這也是3 h條件下POA 得率最高的原因，而這會影響POA的含量，因此后續(xù)不將3 h 作為最優(yōu)條件考慮。結(jié)晶過程分為晶核的形成和晶體的生長2 個階段，晶核形成之后，晶體則開始生長，而晶體的生長需要一定的時間，若結(jié)晶時間過短則系統(tǒng)很難達到平衡，若結(jié)晶時間過長則會導(dǎo)致不飽和脂肪酸也形成結(jié)晶[36]。當(dāng)結(jié)晶時間≥6 h 時，POA 得率雖稍有下降，但含量無明顯變化，原因可能是隨著結(jié)晶時間的增加，溶劑也發(fā)生了部分凍結(jié)，由于其包裹了部分不飽和脂肪酸，造成了濾液的損耗，導(dǎo)致得率下降。當(dāng)結(jié)晶時間為6 h 時，POA 的含量最高，為（29.75±0.53）%，此時得率為（15.26±0.27）%。當(dāng)結(jié)晶時間為9 h，12 h 和15 h 時，得率略有下降，分別為（14.95±0.14）%，（14.77±0.09）%，（14.71±0.17）%。綜合考慮，最終選擇結(jié)晶時間為6 h。

圖6 結(jié)晶時間對POA 含量及得率的影響Fig. 6 Influence of crystallization time on POA content and yield

2.3 放大試驗

為提高低溫結(jié)晶的整體得率，在得出最優(yōu)條件參數(shù)后進行了放大試驗，即丙酮-乙腈體積比為1∶10，魚油-溶劑質(zhì)量比為1∶6，結(jié)晶溫度為-60℃，結(jié)晶時間為6 h。分別將魚油添加量調(diào)整至原來的7 倍和17 倍，最終得到的主要脂肪酸含量如表2 所示?？梢钥闯?，原油中含量較高的C14∶0 和C16∶0 在低溫結(jié)晶和放大試驗后含量下降到了很低的水平，這2 種飽和脂肪酸已形成結(jié)晶與不飽和脂肪酸分離。同樣含有一個雙鍵的C18∶1 含量也有所上升，其存在限制了POA 含量的進一步增長，這是因為當(dāng)2 種脂肪酸雙鍵數(shù)目接近時，低溫結(jié)晶很難將二者分離[37]，可結(jié)合其它分離方法提高POA 的含量。由表可以看出，放大試驗并沒有對POA 的含量造成太大影響，并且POA 的得率大大提升。當(dāng)魚油添加量分別增加7 倍和17 倍時，POA 得率分別為（49.73±3.91）%和（53.66±5.99）%。這是因為試驗過程中大量脂肪酸附著在容器內(nèi)壁上，造成了不可避免的損耗，而添加量的增大使損耗率大大降低。因此，此工藝對于富集POA 是可行的。

表2 低溫結(jié)晶、放大試驗與原油的主要脂肪酸含量對比（%）Table 2 The content of main fatty acids in crude oil and the oil after low-temperature crystallization and scale up experiments（%）

3 結(jié)論

本研究用低溫結(jié)晶法富集鳀魚油中的POA，在單一溶劑的基礎(chǔ)上增加了復(fù)合溶劑的篩選，證明了復(fù)合溶劑的效果高于單一溶劑。最終確定了丙酮與乙腈以體積比1∶10 混合，魚油-溶劑質(zhì)量比為1 ∶6，結(jié)晶溫度為-60 ℃，結(jié)晶時間為6 h 的最優(yōu)工藝條件。最終得到了POA 含量為（29.75±0.53）%的混合脂肪酸，得率為（15.26±0.27）%。在此基礎(chǔ)上進行了放大試驗，在不影響POA 含量的前提下將其得率提升至50%左右，魚油的總不飽和脂肪酸含量達79%以上，提示低溫結(jié)晶法可有效富集POA，而其對于同樣含有一個雙鍵的其它不飽和脂肪酸不能實現(xiàn)有效地分離，在后續(xù)的研究中可結(jié)合其它分離方法進一步提高POA 的含量。