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        外源AHLs 培養(yǎng)下熒光假單胞菌qPCR 內(nèi)參基因的篩選

        2024-03-12 03:22:28崔方超王蕓婷王當(dāng)豐檀茜倩李秋瑩勵(lì)建榮李婷婷
        中國食品學(xué)報(bào) 2024年2期
        關(guān)鍵詞:分析

        崔方超,王蕓婷,王當(dāng)豐,檀茜倩,李秋瑩,勵(lì)建榮*,李婷婷

        (1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心中國輕工業(yè)海水魚加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 遼寧錦州121013 2 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧大連 116600)

        實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)因特異性強(qiáng)、靈敏度高、定量準(zhǔn)確、高通量、操作簡便等優(yōu)點(diǎn),而被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)的研究中[1]。qPCR 檢測基因表達(dá)水平的定量方法分為絕對定量和相對定量。相較于相對定量法,使用絕對定量法需要構(gòu)建不同梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算目的基因模板的起始量,操作更為繁瑣且增加了試驗(yàn)難度[2]。因此,在使用qPCR 檢測基因表達(dá)水平時(shí)大多采用相對定量法,通常需要引入一個(gè)在不同樣本內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定的基因作為內(nèi)參基因,從而校準(zhǔn)目的基因的表達(dá)量[3]。常用的內(nèi)參基因有GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、ACT(肌動(dòng)蛋白)、TUB(微管蛋白)、His(組蛋白)、16S rRNA(16S 核糖體RNA)等。大量研究表明,上述內(nèi)參基因有可能因物種、生長階段或發(fā)育條件的不同而表達(dá)不穩(wěn)定,因此,需要根據(jù)試驗(yàn)條件選擇能夠穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因來保證qPCR 結(jié)果準(zhǔn)確可靠[4-6]。

        熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)屬于革蘭氏陰性需氧桿菌,具有脂解和蛋白水解活性,是奶類[7]、水產(chǎn)品[8]、肉制品[9]等食品在冷藏條件下的優(yōu)勢腐敗菌。熒光假單胞菌能產(chǎn)生生物被膜、胞外蛋白酶、嗜鐵素等多種致腐因子,導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì),分泌酮類、醛類、醇類等多種揮發(fā)性有機(jī)化合物,散發(fā)令人不快的氣味[8,10-11]。作為常見的致病性嗜冷菌,熒光假單胞菌對環(huán)境適應(yīng)力強(qiáng),其產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶極其耐熱,這不僅縮短了食品的貨架期,還有可能危害到人體健康。研究表明,熒光假單胞菌的腐敗特性如生物被膜的形成、胞外蛋白酶的分泌等受群體感應(yīng)(Quorum sensing,QS)系統(tǒng)的調(diào)控[12]。QS 系統(tǒng)是一種細(xì)菌通訊機(jī)制,微生物通過信號分子監(jiān)測群體密度并激活相關(guān)基因表達(dá)來調(diào)節(jié)其生理行為以適應(yīng)環(huán)境變化[13]。近年來以熒光假單胞菌等腐敗菌的QS 系統(tǒng)為靶標(biāo)來調(diào)控其腐敗特性已成為研究熱點(diǎn)[14-16]。通過致腐因子的表征和腐敗基因的表達(dá)來探索食品腐敗機(jī)制,其中對腐敗基因表達(dá)水平的檢測大多采用qPCR 技術(shù),大部分都以16S rRNA 作為內(nèi)參基因。目前內(nèi)參基因的篩選分析多圍繞動(dòng)物與植物,對微生物內(nèi)參基因的研究較少,尚未有有關(guān)熒光假單胞菌在QS 方面內(nèi)參基因篩選方面的研究報(bào)道。

        本文以熒光假單胞菌PF-08 為試驗(yàn)菌株,根據(jù)文獻(xiàn)查找和前期基因組測序結(jié)果,選擇8 個(gè)候選內(nèi)參基因(dsbA、carA、rpsL、gyrB、atpD、rpoD、gltA、16S rRNA),通過qPCR 研究不同QS 信號分子培養(yǎng)下候選內(nèi)參基因的表達(dá)水平。利用geNorm[17]、Normfinder[18]、BestKeeper[19]和RefFinder[20]分析這8個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性,從而篩選出合適的內(nèi)參基因,為利用qPCR 技術(shù)研究熒光假單胞菌QS 相關(guān)的致腐基因表達(dá)提供科學(xué)依據(jù);也為其它腐敗菌在QS 方面的基因定量研究提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 菌株與試劑

        熒光假單胞菌PF-08(從腐敗大菱鲆中分離純化)保藏于渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院。

        C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL,美國Sigma 公司;LB 肉湯,青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;固相表面RNase 清除劑、EZ-10 總RNA 小量提取試劑盒、RNase-Free DNA 清除試劑盒、Taq PCR 預(yù)混液(2X,含紅染料)、DNA Marker、4S Green 核酸染色劑、瓊脂糖,生工生物工程(上海)股份有限公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒、TBPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒,寶生物工程(大連)有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        Imark 酶標(biāo)儀、GelDoc XR+全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng),美國Bio-Rad 公司;Legend Micro21R 臺式微量離心機(jī)、NanoDrop One 超微量紫外-可見分光光度計(jì)、Applied Biosyetems StepOne Plus 熒光定量PCR 儀,美國Thermo 公司;Eppendorf 5331梯度PCR 儀,德國Eppendorf 公司。

        1.3 方法

        1.3.1 菌種培養(yǎng)及外源AHLs 處理 將過夜活化后的熒光假單胞菌PF-08 按照體積比1∶100 的比例接種于10 mL 含有2 μg/mL 不同類型(C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL)外源信號分子的LB 肉湯中,以未添加外源AHLs 的LB 肉湯作為對照,28 ℃、160 r/min 搖床培養(yǎng)至OD595nm為1左右。

        1.3.2 總RNA 提取與cDNA 合成取1.3.1 節(jié)的7 個(gè)菌液樣本,使用EZ-10 總RNA 小量提取試劑盒及RNase-Free DNA 清除試劑盒提取總RNA;為了防止RNA 降解,需在低溫環(huán)境下快速操作,還需要用固相表面RNase 清除劑來清潔工作環(huán)境。提取的總RNA 經(jīng)過超微量分光光度計(jì)和1.0%瓊脂糖凝膠電泳聯(lián)合檢測,分析其純度和濃度是否達(dá)標(biāo)。以檢測合格的總RNA 為模板,使用PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒合成cDNA。

        1.3.3 候選內(nèi)參基因選擇和引物設(shè)計(jì)及特異性檢測根據(jù)文獻(xiàn)選取8 個(gè)常見的管家基因作為候選內(nèi)參基因(表1):dsbA、carA、rpsL、gyrB、atpD、rpoD、gltA、16S rRNA。它們要么在碳水化合物代謝中起關(guān)鍵作用,要么曾被用作系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記。

        根據(jù)前期基因組測序結(jié)果(GenBank 登錄號:CP032618)[27]獲得候選內(nèi)參基因的序列,基于qPCR 反應(yīng)對引物特異性的要求設(shè)計(jì)這8 個(gè)內(nèi)參基因的上下游引物(表2),由上海生工生物合成。

        以1.3.2 節(jié)獲得的cDNA 為模板,引物見表2,對這8 個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,檢測其特異性,反應(yīng)體系和程序參照Taq PCR 預(yù)混液(2X,含紅染料)的使用說明。通過2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增后的產(chǎn)物,觀察各基因在這7 個(gè)樣本的條帶大小是否與預(yù)期一致,以及是否有雜帶產(chǎn)生。

        1.4 數(shù)據(jù)分析

        StepOneTMSoftware v2.3 軟件自動(dòng)得出各樣本的Ct 值,利用geNorm、Normfinder、BestKeeper 3 個(gè)程序和 RefFinder 網(wǎng)站(http://blooge.cn/RefFinder/)對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,評估8 個(gè)候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性。geNorm 是Vandesompele 等[17]基于Microsoft Excel 編寫的一個(gè)Visual Basic 應(yīng)用程序(VBA),可以識別給定組織中表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因,并確定計(jì)算可靠歸一化因子所需的最少基因數(shù)即內(nèi)參基因最佳數(shù)量。NormFinder 程序植根于基因表達(dá)的數(shù)學(xué)模型,該模型不僅能估計(jì)候選基因的總體變化,而且能估計(jì)樣本組之間的變化[18]。與上述兩個(gè)程序不同,除了比較內(nèi)參基因間的穩(wěn)定性,BestKeeper 程序還可以同時(shí)比較目的基因的表達(dá)水平,一次最多能分析100 個(gè)樣本中10 個(gè)內(nèi)參基因和10 個(gè)目的基因的表達(dá)水平[19]。RefFinder 網(wǎng)站集成了以上3 個(gè)軟件的算法和比較delta-Ct 方法[28]來對候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行排序[20]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 總RNA 質(zhì)量檢測

        7 個(gè)樣本總RNA 的濃度和純度(A260nm/A280nm與A260nm/A230nm)通過超微量分光光度計(jì)檢測,結(jié)果見表3。根據(jù)cDNA 的反應(yīng)體系,RNA 的質(zhì)量濃度不能低于77.0 ng/μL。表3 中所有樣本總RNA的質(zhì)量濃度都較高,最低值為462.3 ng/μL,最高值為1 240.2 ng/μL。RNA 純度指示值中的A260nm、A280nm、A230nm分別代表了核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物的吸收峰。所有樣本總RNA 的A260nm/A280nm比值均在2.1~2.2 之間,沒有低于2.0,表示RNA 沒有受蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)污染;雖然略高于純RNA 的比值2.0,但沒有超過2.2,表示RNA 雖存在降解但程度不深。所有總RNA 的A260nm/A230nm均大于2.0,說明樣本沒受碳水化合物、胍鹽等污染,RNA的純度良好。從圖1 可以看到,1~7 泳道均有兩條明亮清晰的條帶分別代表28S rRNA 和18S rRNA,且沒有明顯的彌散現(xiàn)象,說明提取的總RNA 完整性較好,濃度較高且降解程度較低。總之,提取的總RNA 均質(zhì)量良好,可用于合成cDNA。

        圖1 外源AHLs 培養(yǎng)下熒光假單胞菌的總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of total RNA of Pseudomonas fluorescens under the culture of exogenous AHLs

        表3 外源AHLs 培養(yǎng)下熒光假單胞菌的總RNA 質(zhì)量檢測Table 3 Quality detection of total RNA of Pseudomonas fluorescens under the culture of exogenous AHLs

        2.2 引物特異性檢測

        以cDNA 為模板,通過PCR 反應(yīng)和2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測這8 個(gè)內(nèi)參基因的qPCR 引物是否具有特異性。從圖2 中可以看到這8 個(gè)候選內(nèi)參基因的PCR 產(chǎn)物大小與預(yù)期一致,且條帶清晰單一,并無引物二聚體產(chǎn)生。這8 個(gè)內(nèi)參基因的引物均具有良好的特異性,滿足qPCR 試驗(yàn)對引物的要求。

        圖2 候選內(nèi)參基因PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of PCR products of candidate reference genes

        2.3 qPCR 結(jié)果分析

        由圖3 可知,8 個(gè)候選內(nèi)參基因的溶解曲線均呈現(xiàn)特異的單一信號峰,沒有產(chǎn)生非特異性雜峰,不存在引物二聚體,進(jìn)一步驗(yàn)證這8 個(gè)候選內(nèi)參基因的引物均特異性良好。qPCR 試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠,Ct 值可以用于后續(xù)分析。

        圖3 候選內(nèi)參基因qPCR 溶解曲線Fig. 3 The qPCR melting curves of candidate reference genes

        Ct 值是指反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號在qPCR 擴(kuò)增過程中達(dá)到閾值(軟件自動(dòng)設(shè)定在從基線到指數(shù)增長的拐點(diǎn))時(shí)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。qPCR 國際化標(biāo)準(zhǔn)(MIQE 指南)[29]指出,Ct 值與該基因的起始模板濃度負(fù)相關(guān),Ct 值越小則該基因在樣本中的表達(dá)豐度越高。內(nèi)參基因的Ct 值應(yīng)在10~25 之間,表達(dá)豐度過高或過低都不利于定量目的基因的表達(dá)水平。因此,由圖4 可知,16S rRNA 的Ct 值偏低,其它基因的Ct 值均在16.02~21.58 之間。比較同一內(nèi)參基因在7 個(gè)樣本間的Ct 值變化程度,由小到大依次為:gltA、rpoD、atpD、rpsL、carA、16S rRNA、dsbA、gyrB。結(jié)果表明,gltA 的Ct 值變化程度最小,表達(dá)穩(wěn)定性最高,其次是rpoD。根據(jù)Ct 值直接判斷出最適內(nèi)參基因還不夠準(zhǔn)確,仍需要通過geNorm、Normfinder、BestKeeper 和RefFinder 進(jìn)一步分析并綜合評估。

        圖4 候選內(nèi)參基因qPCR 的Ct 值分布圖Fig. 4 The qPCR Ct value distribution of candidate reference genes

        2.4 候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

        評估內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的幾個(gè)程序各有不同的使用要點(diǎn)和分析側(cè)重點(diǎn),最常用的程序是geNorm、NormFinder 和BestKeeper[30]。

        內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性在geNorm 程序中表示為M 值,M 值是某一內(nèi)參基因與其它內(nèi)參基因表達(dá)水平的兩兩比值經(jīng)對數(shù)變換后的平均標(biāo)準(zhǔn)差。以1.5 為閾值,M 值超過1.5 就表示該基因表達(dá)不穩(wěn)定,不適合作內(nèi)參基因。從圖5a 中可知較穩(wěn)定的內(nèi)參基因?yàn)閍tpD 和rpoD,且8 個(gè)基因的M 值均低于1.5,可被列為候選內(nèi)參基因。geNorm還可以確定內(nèi)參基因的最適數(shù)目,通過對標(biāo)準(zhǔn)化因子進(jìn)行差異分析計(jì)算配對變異V 值,選擇出2個(gè)及以上的內(nèi)參基因。以0.15 為閾值,當(dāng)Vn/n+1低于0.15,就表示用n 個(gè)基因同時(shí)作為內(nèi)參基因,取均值后定量目的基因,可以得到更可靠的試驗(yàn)結(jié)果。圖5b 中的Vn/n+1值均低于0.15,則最少可選用2 個(gè)內(nèi)參基因。結(jié)合圖5a,atpD 和rpoD 作為內(nèi)參基因聯(lián)合使用,可以減少試驗(yàn)誤差,更準(zhǔn)確地分析基因表達(dá)量。

        圖5 geNorm 分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性(a)和最適內(nèi)參基因數(shù)目(b)Fig. 5 geNorm analyzes the expression stability of candidate reference genes(a)and the optimal number of reference genes(b)

        NormFinder 直接比較內(nèi)參基因在樣本組內(nèi)和組間的表達(dá)差異,結(jié)果用穩(wěn)定性值(SV)表示,根據(jù)SV 值大小對內(nèi)參基因進(jìn)行排序,SV 值最小的基因即為最適內(nèi)參基因。從圖6 可知,基因表達(dá)最穩(wěn)定的為gltA,其次是rpsL,最不穩(wěn)定的為16S rRNA。

        圖6 NormFinder 分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Fig. 6 NormFinder analyzes the expression stability of candidate reference genes

        與以上兩個(gè)程序不同,BestKeeper 直接分析各內(nèi)參基因的Ct 值,通過Ct 值計(jì)算表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)差(SD)來評估內(nèi)參基因的穩(wěn)定性,SD 值越小則基因表達(dá)越穩(wěn)定。因此,表4 中基因表達(dá)穩(wěn)定性由高到低依次為gltA>rpoD>rpsL>atpD>carA>16S rRNA>dsbA>gyrB。另外,為了評估所有候選內(nèi)參基因間的關(guān)系,BestKeeper 還進(jìn)行了成對的相關(guān)分析,皮爾遜相關(guān)系數(shù)r 和P 值見表4。rpsL 與其它基因的相關(guān)性最高,其次是carA 和16S rRNA,這3 個(gè)基因也達(dá)到顯著水平(P<0.05),gltA 的相關(guān)性最低。

        表4 BestKeeper 分析候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性Table 4 BestKeeper analyzes the expression stability of candidate reference genes

        RefFinder 網(wǎng)站通過以上3 個(gè)軟件的算法和比較delta-Ct 方法對候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行比較和排名,同時(shí)根據(jù)各程序的結(jié)果采用幾何平均值法進(jìn)行綜合排名。網(wǎng)站的操作很簡便,用戶只需要在窗口輸入各候選內(nèi)參基因的Ct 值,即可得出候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性排名。結(jié)果見表5,geNorm、Normfinder、BestKeeper 在網(wǎng)站中的排名和上面單獨(dú)使用程序得出的穩(wěn)定性排名,其結(jié)果相一致。從綜合排名來看,這8 個(gè)候選內(nèi)參基因中表達(dá)穩(wěn)定性較高的是rpoD 和gltA,穩(wěn)定性最低的是16S rRNA。因此,rpoD 和gltA 適宜選為熒光假單胞菌在外源AHLs 培養(yǎng)下基因表達(dá)的內(nèi)參基因。

        表5 候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性排名Table 5 Expression stability ranking of candidate reference genes

        3 討論與結(jié)論

        熒光假單胞菌是冷藏食品的優(yōu)勢腐敗菌,其致腐因子如生物被膜、蛋白酶和脂肪酶的合成都受到QS 信號分子的調(diào)控[12,31]。在探索QS 對食品腐敗調(diào)控機(jī)制的過程中,需要用到能夠穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因來準(zhǔn)確定量致腐基因的表達(dá)。因此,本文通過qPCR 技術(shù)研究了8 個(gè)常見的候選內(nèi)參基因(dsbA、carA、rpsL、gyrB、atpD、rpoD、gltA、16SrRNA)在熒光假單胞菌經(jīng)不同類型QS 信號分子培養(yǎng)后的表達(dá)情況,為確保表達(dá)穩(wěn)定性評價(jià)準(zhǔn)確使用了geNorm、Normfinder、BestKeeper 和RefFinder 4 個(gè)程序,綜合評估后從8 個(gè)候選內(nèi)參基因中篩選出最適內(nèi)參基因。結(jié)果表明,在外源AHLs 刺激下,熒光假單胞菌中rpoD 和gltA 的基因表達(dá)最穩(wěn)定,可用于后續(xù)熒光假單胞菌QS 調(diào)控機(jī)制的研究中。

        目前,通過qPCR 技術(shù)研究細(xì)菌功能基因在不同生長階段或者不同生長條件下的表達(dá)水平,多以16S rRNA 作為內(nèi)參基因。在大部分細(xì)菌中16S rRNA 都高度保守且具有特異性[32],常被用作內(nèi)參基因,然而在本文中,16S rRNA 的Ct 值在8.27~9.37,表達(dá)豐度過高且穩(wěn)定性最差,不是熒光假單胞菌內(nèi)參基因的最佳選擇,最適內(nèi)參基因?yàn)閞poD 和gltA。rpoD 編碼RNA 聚合酶sigma70 因子,序列保守性超過50%,常用于菌株的分類鑒定和進(jìn)化分析[33]。gltA 編碼檸檬酸合酶(三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶),最近也被用于多位點(diǎn)序列分析和系統(tǒng)發(fā)育分析[34]。Gomes 等[35]從11 個(gè)基因中篩選出recA、rho、rpoD 和proC 作為肺炎克雷伯菌在不同生長階段或環(huán)境脅迫下基因表達(dá)的最適內(nèi)參基因。鄭永欽等[36]發(fā)現(xiàn)rpoD 在柑橘黃龍病菌中表達(dá)穩(wěn)定性較差,進(jìn)一步證明不同物種的最適內(nèi)參基因不一定相同。此外,geNorm、Normfinder、Best-Keeper 這3 款程序的統(tǒng)計(jì)方法皆不相同,評估候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)結(jié)果不一致的情況,這就需要進(jìn)一步使用RefFinder 對這3款程序的結(jié)果進(jìn)行綜合評估,確保篩選結(jié)果更為可靠。

        綜上所述,本研究通過對候選內(nèi)參基因?qū)訉雍Y選與全面評估后,獲得了熒光假單胞菌在外源QS 信號分子培養(yǎng)下表達(dá)穩(wěn)定的2 個(gè)內(nèi)參基因rpoD 和gltA,為后續(xù)探究熒光假單胞菌致腐基因表達(dá)提供理論支持;也為其它腐敗菌提供內(nèi)參基因的參考,從而在研究QS 基因表達(dá)時(shí)獲得更可靠的相對定量結(jié)果。

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