吳 爽 張濤元 李 俏 曹三成 王增國 祝擷英

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上第六大最常見的癌癥,也是癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[1]。肝癌的分子機(jī)制還不完全清楚。由于缺乏有效的早期診斷和靶向治療,5年生存率僅為11%[2]。主流的檢測(cè)方法包括計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)、磁共振成像(MRI)和糖蛋白生物標(biāo)志物(如甲胎蛋白)[3]。然而,這些方法有各種限制:CT和MRI昂貴且難以廣泛應(yīng)用,而糖蛋白生物標(biāo)記物因缺乏對(duì)腫瘤區(qū)域特異性而受到限制。鑒于早期腫瘤檢測(cè)可顯著提高HCC患者生存率,探索新的標(biāo)志物非常重要。

Mediator是一種進(jìn)化上保守的多蛋白復(fù)合物,在人類中由33個(gè)亞基組成,是轉(zhuǎn)錄過程中不可或缺的調(diào)節(jié)因子[4]。研究表明,某些Mediator亞家族成員的表達(dá)在腫瘤中發(fā)生了較顯著的變化,例如中介體復(fù)合物亞基8(mediator complex subunit 8,MED8)在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中發(fā)生突變[5];此外,MED8在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)與存活時(shí)間短、TNM分期相關(guān),且MED8在轉(zhuǎn)移性腫瘤中的表達(dá)高于原發(fā)腫瘤[6]。然而,MED8與HCC之間的相關(guān)性尚未得到評(píng)估。

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)分析了MED8在HCC中的表達(dá)及預(yù)后價(jià)值。我們證實(shí),在HCC樣本中,MED8表達(dá)升高,并與較差的總生存率相關(guān),我們的研究為HCC提供了一種新的診斷和預(yù)后指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 MED8在泛癌及HCC中的表達(dá)差異驗(yàn)證

利用UCSC XENA(https://xenabrowser.net/datapages/)下載經(jīng)Toil流程統(tǒng)一處理的TCGA和GTEx的TPM(transcripts per million reads)格式的RNAseq數(shù)據(jù),Wilcoxon rank sum test法比較MED8在GTEx聯(lián)合TCGA的癌旁組織樣本和TCGA對(duì)應(yīng)的腫瘤樣本中的表達(dá)情況。同時(shí),從TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/) 下載HCC項(xiàng)目中l(wèi)evel 3 HTSeq-FPKM(Fregments Per Kilobase per Million)格式的RNAseq數(shù)據(jù)以及臨床數(shù)據(jù)。將FPKM格式的RNAseq數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成TPM格式后進(jìn)行HCC癌旁組織及其配對(duì)的癌組織樣本間的表達(dá)比較。

1.2 Western blot驗(yàn)證MED8在正常肝細(xì)胞QSG-7701及肝癌細(xì)胞HepG2中的表達(dá)差異

將QSG-7701及HepG2分別接種于10 cm含牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h,RIPA裂解后提取總蛋白并檢測(cè)蛋白濃度,經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜,兔抗人MED8抗體(購買于Invitrogen Ebioscienc公司)孵育及二抗孵育后,以GAPDH為內(nèi)參比較MED8在兩種細(xì)胞中的表達(dá)情況。

1.3 MED8在HCC中的共表達(dá)分析、可視化顯示及共表達(dá)基因的富集分析

按照MED8表達(dá)量的中位值將HCC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,通過DESeq2包對(duì)HTSeq-Counts數(shù)據(jù)分析表達(dá)差異基因,火山圖用于展示差異分析的結(jié)果(參數(shù)設(shè)置如下:|logFC|>2,padj<0.05)。clusterProfiler包用于分析基因的本體論(gene ontology,GO)富集分析,包括生物過程(biological process,BP),細(xì)胞組分(cellular components,CC)和分子功能(molecular function,MF)),以及京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)富集分析。

1.4 HCC患者樣本MED8和C1qc蛋白表達(dá)水平

通過Human Protein Atlas(www.proteinatlas.org)分析HCC組織和正常肝組織中MED8和C1qc蛋白表達(dá)水平,以免疫組化結(jié)果進(jìn)行呈現(xiàn)。

1.5 MED8與HCC臨床病理的相關(guān)性及預(yù)后分析

通過Kruskal-Wallis rank sum test統(tǒng)計(jì)方法分別比較MED8表達(dá)與HCCT分期、病理分期、組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系。按照MED8表達(dá)值的中位數(shù),將LIHC數(shù)據(jù)分為MED8高表達(dá)組及低表達(dá)組,利用survminer包繪制Kaplan-Meier 圖,用于評(píng)估MED8對(duì)HCC總生存期(overall survival,OS)及疾病相關(guān)生存率(Disease-Specific Survival)的預(yù)測(cè)價(jià)值;同時(shí)對(duì)MED8進(jìn)行亞組分析,比較在HCCT分期的T1&T2&T3&T4亞群、病理分期的Stage I&Stage II&Stage III&Stage IV亞群、組織學(xué)分級(jí)G1&G2&G3&G4亞群中MED8對(duì)其OS的預(yù)測(cè)價(jià)值。最后通過ROC曲線,分析MED8對(duì)HCC的診斷效能。ROC曲線橫坐標(biāo)為假陽性率(false positive rate,FPR),縱坐標(biāo)為真陽性率(true positive rate,TPR)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用R語言對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理,各數(shù)據(jù)的比較采用Wilcoxon signed rank test或Kruskal-Wallis rank sum test,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MED8在16種腫瘤組織中差異表達(dá)

Wilcoxon rank sum test法,比較MED8在GTEx聯(lián)合TCGA的正常樣本和TCGA對(duì)應(yīng)的腫瘤樣本中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,與正常樣本相比,MED8在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、乳腺浸潤癌(BRCA)、宮頸鱗癌和腺癌(CESC)、膽管癌(CHOL)、結(jié)腸癌(COAD)、食管癌(ESCA)、多形成性膠質(zhì)細(xì)胞瘤(GBM)、頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSC)、腎透明細(xì)胞癌(KIRC)、肝細(xì)胞肝癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺鱗癌(LUSC)、胃癌(STAD)、子宮內(nèi)膜癌(UCEC)組織中呈高表達(dá),在腎嫌色細(xì)胞癌(KICH)和甲狀腺癌(THCA)組織中呈低表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 MED8在HCC組織中的表達(dá)情況

Wilcoxon signed rank test法比較50例HCC樣本以及配對(duì)的HCC癌旁樣本中的MED8的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),MED8在HCC樣本中呈高表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,圖1A)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明,與正常肝細(xì)胞QSG-7701相比,MED8在肝癌細(xì)胞HepG2中呈高表達(dá)(圖1B)。免疫組化實(shí)驗(yàn)也表明,與正常人肝組織相比,MED8在肝癌組織中呈高表達(dá)(圖1C)。

注:A為MED8在HCC及配對(duì)癌旁樣本中表達(dá)情況;B為Western blot檢測(cè)MED8蛋白表達(dá)水平;C為MED8在正常肝組織和HCC組織中的表達(dá)。

2.3 MED8在HCC中的共表達(dá)及富集分析

根據(jù)MED8在HCC中表達(dá)情況,以中位數(shù)為截點(diǎn)將患者分成高表達(dá)組和低表達(dá)組。差異分析結(jié)果顯示,兩組共有582個(gè)差異表達(dá)基因,其中536個(gè)基因顯著上調(diào),46個(gè)基因顯著下調(diào)(圖2A)。GO富集分析及KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,差異表達(dá)基因主要參與補(bǔ)體的激活,離子反應(yīng)等生物過程,如圖2B所示。免疫組化實(shí)驗(yàn)表明,補(bǔ)體激活明星分子C1qc蛋白表達(dá)水平在HCC 標(biāo)本中升高(圖2C)。GEPIA數(shù)據(jù)庫分析顯示,在肝癌中,MED8與C1qc的表達(dá)呈正相關(guān)(R=0.47,P<0.001,見圖2D)。

注:A為火山圖分析差異表達(dá)基因;B為富集分析;C為C1qc在正常肝組織和HCC組織中的表達(dá);D為MED8與C1qc相關(guān)性檢測(cè)。

2.4 MED8表達(dá)與HCC腫瘤分期、病理分期及組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系

MED8表達(dá)與TCGA肝細(xì)胞肝癌的T分期(圖3A)、病理分期(圖3B)、組織學(xué)分型(圖3C)呈顯著正相關(guān)。

注:A為MED8與HCCT分期的相關(guān)性;B為MED8與HCC病理分期的相關(guān)性;C為MED8與HCC組織學(xué)分型的相關(guān)性。

2.5 MED8表達(dá)對(duì)HCC患者OS及疾病相關(guān)存活率的預(yù)測(cè)價(jià)值

以MED8表達(dá)值的中位數(shù)為截點(diǎn),將HCC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。KM曲線結(jié)果顯示:MED8高表達(dá)患者OS短[HR=2.49(1.74～3.58),P<0.001,圖4A]及疾病相關(guān)存活率低[HR=2.57(1.62～4.07),P<0.001,圖4B]。

注：A為KM曲線預(yù)測(cè)兩組HCC患者總生存期;B為KM曲線預(yù)測(cè)兩組HCC患者疾病相關(guān)生存率;C為MED8在HCC的T分期中的亞組分析;D為MED8在HCC的病理分期中的亞組分析;E為MED8在HCC的組織學(xué)分級(jí)中的亞組分析。

2.6 MED8的亞組預(yù)后分析

對(duì)HCC的T分期、病理分期、組織學(xué)分級(jí)進(jìn)行亞組分析,結(jié)果顯示:高表達(dá)MED8與T分期的T1&T2&T3&T4亞群[HR=2.46(1.72～3.54),P<0.001,圖4C]、病理分期的Stage Ⅰ&Stage Ⅱ&Stage Ⅲ&Stage Ⅳ亞群[HR=2.47(1.69～3.62),P<0.001,圖4D]、組織學(xué)分級(jí)的G1&G2&G3&G4亞群[HR=2.49(1.73～3.60),P<0.001,圖5E]呈顯著相關(guān)性。

圖5 ROC曲線

2.7 ROC曲線評(píng)價(jià)MED8在HCC中的診斷價(jià)值

ROC分析結(jié)果顯示:曲線下面積為0.817(95%CI 0.778～0.857),提示MED8對(duì)肝癌有一定的診斷準(zhǔn)確性(圖5)。

3 討論

介體復(fù)合物是基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Mediator分為四個(gè)不同的子模塊:頭、中、尾和激酶[7]。MED的頭部和中間模塊可以直接與RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ,POLⅡ)相互作用,作為轉(zhuǎn)錄因子和上游調(diào)控元件結(jié)合機(jī)制之間的橋梁。MED8、MED18和MED20表示中介頭域的子模塊。MED頭模塊主要由SRB編碼的蛋白質(zhì)組成[8]。研究表明,MED19[9],MED15[10],MED23[11]在HCC中升高,且與HCC預(yù)后相關(guān)。但很少有研究評(píng)估MED8和癌癥之間的關(guān)系。MED8被認(rèn)為是一種多結(jié)構(gòu)域蛋白,由一個(gè)n端螺旋結(jié)構(gòu)域、一個(gè)靈活的配體和一個(gè)與Med18(25)16相互作用的c端螺旋結(jié)構(gòu)域組成。MED8在所有真核生物的轉(zhuǎn)錄中起著重要的作用,其功能和/或組成的改變可能會(huì)產(chǎn)生重要的功能后果,導(dǎo)致包括癌癥在內(nèi)的各種疾病。免疫組化檢測(cè)到MED8在腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)高水平,沉默MED8會(huì)降低腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和運(yùn)動(dòng)能力。其他研究表明,MED8在結(jié)腸癌中會(huì)發(fā)生突變[5,12-13]。然而,MED8表達(dá)與HCC發(fā)生和預(yù)后的關(guān)系尚未見報(bào)道。

為了明確MED8在HCC中的作用,我們分析了來自TCGA的完整臨床信息的371例HCC患者的數(shù)據(jù)。結(jié)果表明,HCC組織中MED8表達(dá)水平高于正常組織。此外,MED8高表達(dá)與T分期、病理分期、組織學(xué)分級(jí)等病理參數(shù)密切相關(guān),提示MED8高表達(dá)參與了HCC的侵襲轉(zhuǎn)移。結(jié)合MED8高表達(dá)組HCC患者總生存率低于MED8低表達(dá)組,提示MED8可能作為HCC新的診斷和預(yù)后標(biāo)志物。本文根據(jù)MED8在HCC中表達(dá)的中位數(shù)將其分為高表達(dá)組和低表達(dá)組,并進(jìn)行差異分析及GO分析。結(jié)果顯示,與MED8共表達(dá)的基因主要參與補(bǔ)體激活,細(xì)胞對(duì)銅離子反應(yīng)等生物過程。補(bǔ)體激活是先天免疫的組成部分,能夠抵御入侵病原體。肝臟是合成補(bǔ)體成分的主要來源(>80%),并表達(dá)多種補(bǔ)體受體。HCC與先天性及適應(yīng)性免疫失調(diào)密切相關(guān),而免疫網(wǎng)絡(luò)的核心是補(bǔ)體級(jí)聯(lián),這是肝臟固有的基本防御系統(tǒng)[14]。研究表明,腫瘤微環(huán)境中的補(bǔ)體激活增強(qiáng)了腫瘤生長并增加了轉(zhuǎn)移,可以幫助腫瘤逃避免疫消除[15-16]。HCC是一種以慢性炎癥、纖維化和肝硬化為特征的免疫原性癌癥。由于HCC幾乎僅在慢性炎癥環(huán)境中出現(xiàn)[17],因此過早的補(bǔ)體激活可能是腫瘤炎癥過程的潛在驅(qū)動(dòng)因素。因而,我們猜測(cè)MED8通過調(diào)控補(bǔ)體激活通路從而影響HCC患者預(yù)后。免疫組化分析結(jié)果表明,補(bǔ)體激活經(jīng)典通路分子C1qc在肝癌患者癌組織升高,這與Lee等[18]的報(bào)道一致。同時(shí),MED8與C1qc表達(dá)水平正相關(guān)性。這些結(jié)果表明,MED8可能通過上調(diào)C1qc水平調(diào)控HCC進(jìn)展。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,我們將通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MED8通過C1qc調(diào)控HCC進(jìn)展的分子機(jī)制。

綜上所述,MED8高表達(dá)與HCC的T分期、病理分期、組織學(xué)分級(jí)等病理參數(shù)密切相關(guān),MED8可能是HCC診斷和預(yù)后的有效生物標(biāo)志物。同時(shí),我們對(duì)MED8調(diào)控HCC的分子機(jī)制進(jìn)行了初步研究,從而為開發(fā)HCC抗癌藥物提供了新的思路。