倪健彬 王 穎

隨著醫(yī)學(xué)進(jìn)步及對乳腺癌的深入研究,目前已形成局部治療與全身治療并重治療模式[1]。多環(huán)節(jié)作用機(jī)制的分析靶向治療已成為近年最活躍研究領(lǐng)域之一,多項研究表明癌細(xì)胞內(nèi)某些基因或的表達(dá)與疾病發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[2-3]。最新文獻(xiàn)認(rèn)為RNA XIST、mir-130b-3p在多種惡性腫瘤細(xì)胞中均有表達(dá),mir-130b-3p可抑制乳腺上皮細(xì)胞正常分化、增殖、細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、及細(xì)胞間粘附等過程,RNA XIST可促進(jìn)腫瘤生長、侵襲及轉(zhuǎn)移[4],提示RNA XIST、mir-130b-3p可能對乳腺癌患者疾病轉(zhuǎn)歸及短期生存率影響較大。本文將研究RNA XIST、mir-130b-3p在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 一般資料

經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理會討論通過,選取2014年1月至2016年1月于我院收治并確診的120例乳腺癌患者,收集患者癌組織和癌旁正常組織。入選標(biāo)準(zhǔn):①符合中國抗癌協(xié)會提出乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[5];②女性;③年齡18～90歲;④未接受過治療;⑤預(yù)計存活期超過1年。排除標(biāo)準(zhǔn):①惡性腫瘤;②依從性差,不能定期隨訪;③乳腺癌既往史;④合并精神疾病。剔除標(biāo)準(zhǔn):①中途自愿退出;②未完成或進(jìn)行其他治療;③隨訪資料不完整。其中年齡35～80歲,<55歲78例,≥55歲42例;BMI<18.5 kg/m259例、≥18.5 kg/m261例;平均KPS評分(80.65±2.11)分、70～80分50例、>80分70例;腫瘤直徑≤5 cm 56例,>5 cm 64例;Ⅰ～Ⅱ期54例、Ⅲ～Ⅳ期66例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移68例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例;低分化44例,高中分化76例。

1.2 方法

10%甲醛溶液(北京諾博萊德)固定乳腺癌組織和癌旁正常組織,經(jīng)梯度濃度酒精(蘇州吉瑪基因股份有限公司)脫水后包埋成塊(山東佰仟化工包埋機(jī));將組織切成5 μm的連續(xù)切片(深圳市匯沃科技切片機(jī)),依次采用二甲苯(桂林漓峰醫(yī)藥用品)、檸檬酸鈉(北京維欣儀奧科技)及3%過氧化氫(山東佰仟化工)進(jìn)行脫蠟、修復(fù)及阻斷;PBS緩沖液(上海恒遠(yuǎn)生物科技)漂洗3次后加山羊血清(上海田源生物技術(shù))封閉,滴加經(jīng)稀釋的鼠抗人mir-130b-3p多克隆抗體、鼠抗人RNA XIST單克隆抗體(上海立瑤生物);PBS漂洗3次后加入羊抗鼠IgG(四川訊麥科技)25 ℃孵育30 min漂洗;使用DAB顯色試劑盒(Solarlaio)顯色,蘇木精(上海長哲生物科技)復(fù)染、梯度酒精脫水及中性樹脂(南京森貝伽生物科技)封片,顯微鏡下觀察RNA XIST、mir-130b-3p表達(dá)。

判定標(biāo)準(zhǔn)。染色強(qiáng)度:0分為不著色,1分為淡黃色,2分為深黃色,3分為棕黃色;陽性細(xì)胞百分率:0分為0～5%,1分為5%～25%,2分為26%～50%,3分為51%～75%,4分為>75%。兩項之和≤ 3分為陰性,>3分為陽性[3]。

1.3 隨訪方式

采用電話及復(fù)查方式進(jìn)行隨訪,納入本研究后第1年,每3個月隨訪1次,第2年開始每6個月隨訪1次,隨訪至患者死亡或60個月止。隨訪期間無人失訪。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 RNA XIST、mir-130b-3p在乳腺癌組織和癌旁組織中表達(dá)水平比較

RNA XIST主要定位于細(xì)胞質(zhì)中,呈黃色或棕黃色顆粒;RNA XIST在乳腺癌組織中表達(dá)量較高(P<0.05);mir-130b-3p主要定位于細(xì)胞核中,呈黃色或棕黃色顆粒;mir-130b-3p在乳腺癌組織中的表達(dá)量較低(P<0.05),見表1。

表1 mir-130b-3p、RNA XIST在乳腺癌和癌旁組織中表達(dá)量

2.2 RNA XIST、mir-130b-3p表達(dá)相關(guān)性

RNA XIST與mir-130b-3p表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(γ=-0.277,P=0.002,圖1)。

圖1 RNA XIST與mir-130b-3p表達(dá)相關(guān)性

2.3 RNA XIST、mir-130b-3p表達(dá)量與其臨床病理特征的關(guān)系

RNA XIST、mir-130b-3p表達(dá)量與患者年齡、腫瘤直徑、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度呈顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.05),RNA XIST、mir-130b-3p表達(dá)量與BMI、KPS評分不相關(guān)(P>0.05)(表2)。

表2 RNA XIST、mir-130b-3p表達(dá)量與其臨床病理特征的關(guān)系

2.4 隨訪結(jié)果

所有患者均從治療起隨訪60個月,6例于治療后24～36個月復(fù)發(fā),8例全身轉(zhuǎn)移,54例死亡(12～18個月死亡4例,18～24個月死亡3例,24～30個月死亡4例,30～36個月死亡7例,36～42個月死亡8例,42～48個月死亡9例,48～54個月死亡9例,54～60個月死亡10例)。結(jié)果存活患者RNA XIST表達(dá)量低于死亡患者(P<0.05)、mir-130b-3p表達(dá)量高于死亡患者(P<0.05),見表3和圖2。

圖2 總生存率圖

表3 RNA XIST、mir-130b-3p表達(dá)量比較

2.5 乳腺癌患者死亡危險因素Logistic回歸分析

應(yīng)用獨(dú)立因子(年齡、BMI、KPS評分、腫瘤直徑、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及RNA XIST、mir-130b-3p表達(dá)量)建立Logistic回歸模型,以>0.5時預(yù)報為惡性,≤0.5時預(yù)報為良性,結(jié)果顯示建立該模型準(zhǔn)確率90.11%,提示預(yù)報準(zhǔn)確性較高。此時,RNA XIST表達(dá)量最佳截斷值為7.23,>7.23 提示高表達(dá),≤7.23 提示低表達(dá);mir-130b-3p表達(dá)量最佳截斷值為6.15,>6.15 提示高表達(dá),≤6.15 提示低表達(dá)。進(jìn)一步將乳腺癌患者死亡作為因變量,有預(yù)測意義的因子作為自變量,分析發(fā)現(xiàn),年齡≥55歲、腫瘤直徑>5 cm、腫瘤Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、RNA XIST高表達(dá)、mir-130b-3p低表達(dá)為乳腺癌患者死亡危險因素(P<0.05),見表4,表5。

表4 賦值表

表5 危險因素Logistic回歸分析

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)是乳腺癌患者死亡主要原因[6]。參考國內(nèi)外研究得出,癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移是一個多因素、多步驟、多階段發(fā)展過程,涉及基因改變[7-8]。目前國際上指出乳腺癌致病相關(guān)基因較多,抑癌基因和促癌基因在不同組織中扮演著不同角色,其中較敏感的分子主要有微小RNA(MicroRNA, miRNAs)[9-10]。這一理論也提示基因的表達(dá)存在組織和個體特異性,可能對腫瘤最終發(fā)生、發(fā)展有著一定差異。

mir-130b-3p是miRNAs中一類調(diào)控基因表達(dá)的小RNA分子,在正常細(xì)胞中呈高表達(dá)水平[11-12]。相關(guān)研究證實,細(xì)胞一旦發(fā)生癌變或浸潤,mir-130b-3p表達(dá)量可異常下降,考慮其對乳腺癌病情發(fā)展和預(yù)后有較高價值[13]。目前已在動植物及病毒中發(fā)現(xiàn)大量RNA XIST,這些分子可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、分化過程[14]。關(guān)于RNA XIST的較多報道是其可參與女性X染色體失活和男性X染色體調(diào)節(jié),在基因突變型疾病中表現(xiàn)為異常上調(diào)[15]。且多項研究發(fā)現(xiàn),RNA XIST在肺癌、結(jié)直腸癌、膀胱癌等多種惡性腫瘤中均有表達(dá),考慮其異常上調(diào)對腫瘤繁殖與分化有促進(jìn)作用[16-17]。本研究分析乳腺癌組織和癌旁正常組織中RNA XIST和mir-130b-3p的表達(dá)量發(fā)現(xiàn),乳腺癌組織中RNA XIST呈高表達(dá)而mir-130b-3p呈低表達(dá)。已有研究報道,mir-130b-3p在乳腺癌中表達(dá)水平低于健康者,而相關(guān)性分析中發(fā)現(xiàn)其表達(dá)水平與病情進(jìn)展呈顯著負(fù)相關(guān)[18],這與本研究結(jié)果一致。另外,有報道稱膀胱癌患者中檢測到大量RNA XIST,且晚期膀胱癌RNA XIST表達(dá)量顯著高于早期患者,提示其與癌細(xì)胞增殖呈顯著正相關(guān)關(guān)系[19]。相關(guān)性分析提示,RNA XIST與mir-130b-3p呈負(fù)相關(guān),也說明兩者拮抗作用。

為進(jìn)一步探討RNA XIST、mir-130b-3p在乳腺癌細(xì)胞中的作用,本研究繼續(xù)分析了其與臨床病理特征及5年生存率的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)RNA XIST、mir-130b-3p可影響乳腺癌疾病進(jìn)展和總生存率。當(dāng)RNA XIST呈高表達(dá)時,患者年齡、腫瘤直徑較小,而這與臨床一直以來認(rèn)為年齡可影響化療效果契合,由于老年患者身體機(jī)能、免疫功能等各方面均處于低水平狀態(tài),化療對自身影響較大而影響短期生存率[20-21]。本研究年齡≥55歲、腫瘤直徑>5 cm是影響乳腺癌患者預(yù)后高危因素,也進(jìn)一步說明高水平的RNA XIST可降低生存率。另mir-130b-3p呈高表達(dá)時,腫瘤穩(wěn)定性較好,主要表現(xiàn)為腫瘤分期早、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,而腫瘤Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為乳腺癌患者死亡危險因素,提示mir-130b-3p水平越高,疾病轉(zhuǎn)歸能力和預(yù)后越好。本研究生存率>5年患者RNA XIST表達(dá)量低于生存率<5年患者,mir-130b-3p表達(dá)量高于生存率<5年患者,說明RNA XIST可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和分化、mir-130b-3p可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。

綜上,RNA XIST在乳腺癌細(xì)胞中呈高表達(dá),mir-130b-3p在乳腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá),均與乳腺癌臨床病理特征和預(yù)后密切相關(guān),提示應(yīng)注意關(guān)注RNA XIST、mir-130b-3p表達(dá)量。但本研究研究時間較短、納入病例數(shù)較少,其具體機(jī)制尚不清楚,有待擴(kuò)大樣本并針對其具體機(jī)制作進(jìn)一步研究。