尚自強(qiáng) 張殿寶 張燦斌 李紀(jì)遠(yuǎn) 王 獻(xiàn) 鄭帥玉

食管癌(esophageal carcinoma,EC)是我國常見的消化道腫瘤,其發(fā)生率近年高居不下[1-2]。其中大部分EC是鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma,SCC),該疾病具有男性發(fā)病多、中晚期進(jìn)展快、發(fā)病年齡普通大于40周歲、早期癥狀與其他疾病重疊等臨床特點[2-3]。雖然隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,更多的ESCC得到針對性治療,但其5年生存率仍低于30%[4-5]。因此,尋找ESCC新的靶點和治療方案迫在眉睫。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA,在細(xì)胞周期、分化等調(diào)控中發(fā)揮重要作用[6]。因此,lncRNA的異常表達(dá)可能影響癌基因或抗癌基因的表達(dá)、腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲或/和轉(zhuǎn)移等生理病理過程。小核仁RNA宿主基因6(SNHG6)是位于染色體8q13.1的新lncRNA,可通過和多種miRNA結(jié)合,調(diào)控其表達(dá)水平來參與腫瘤的發(fā)生[7]。近期劉方舟等[8]發(fā)現(xiàn),lncRNA SNHG6通過結(jié)合mTOR和FAF2,增強(qiáng)和促進(jìn)mTOR信號通路關(guān)鍵蛋白至溶酶體的激活,從而加速膽固醇驅(qū)動的肝癌的發(fā)展。但目前鮮有l(wèi)ncRNA SNHG6在ESCC中表達(dá)和機(jī)制的報道。因此本研究擬采用一系列PCR方法檢測ESCC中l(wèi)ncRNA SNHG6的表達(dá)水平,并分析其與臨床病理特征的相關(guān)性,以此為ESCC臨床診斷和治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

篩選2020年2月至2022年2月于本院診治的鱗狀食管癌患者資料,將符合標(biāo)準(zhǔn)的96例納入本研究。其中男性50例,女性46例;年齡46～75歲,平均(62.18±3.45)歲;腫瘤<5 cm 47例,≥5 cm 49例;TNM Ⅰ～Ⅱ期37例,Ⅲ～Ⅳ期59例;低分化49例,中、高分化47例;家族腫瘤史18例,吸煙史20例,飲酒史20例。

納入標(biāo)準(zhǔn):本院首診,并通過病理檢查確診鱗狀食管癌;均行根治切除術(shù),且癌組織和癌旁組織(癌灶邊緣5 cm外的組織)保存完好;無既往化療、放療及免疫等治療經(jīng)歷;無其他免疫系統(tǒng)疾病,不合并其他惡性腫瘤;自愿加入本研究,且簽署知情同意書。

本研究經(jīng)本院倫理會批準(zhǔn),全部取樣和實驗均在監(jiān)督下進(jìn)行。

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司,qPCR購于愛博泰克公司,SNHG6和GAPDH引物由南京金斯瑞生物公司合成。

1.3 樣本處理

從手術(shù)獲取樣本后,立即將樣本剪碎并加入Trizol浸沒樣本,用勻漿儀進(jìn)行勻漿處理,離心后取上清去除雜質(zhì),轉(zhuǎn)移至無RNA酶的EP管中,使用RNA抽提試劑盒提取總RNA。如樣本不是立即抽提RNA,則置于-80 ℃保存待用。

1.4 指標(biāo)檢測

SNHG6在正常食管組織中表達(dá)情況:通過UALCAN分析工具(http://ualcan.path.uab.edu/)搜索并獲取TCGA數(shù)據(jù)庫中食管組織SNHG6表達(dá)量數(shù)據(jù)。

SNHG6在ESCC及癌旁組織中的表達(dá)情況:采用qPCR法檢測樣本組織中SNHG6表達(dá)水平。首先在OD260/280下測定抽提的總RNA濃度,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書使用RNA,在25 ℃ 5 min、40 ℃ 60 min、75 ℃ 5 min的條件下制備cDNA。隨后以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增調(diào)節(jié):95 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性5 sec、60 ℃退火32 sec、72 ℃延伸30 sec,共進(jìn)行40個循環(huán),72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增完成后,根據(jù)熒光信號到達(dá)閾值的循環(huán)數(shù)計算各空的Ct值,通過2-ΔΔCt法計算相對表達(dá)量,重復(fù)3次。以GAPDH作為參照。

1.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫中SNHG6在ESCC及正常食管組織中的表達(dá)情況

應(yīng)用UALCAN在線工具對數(shù)據(jù)庫中SNHG6在ESCC和正常食管組織中表達(dá)水平的分析發(fā)現(xiàn),ESCC組織中SNHG6表達(dá)水平(1.60±0.41)明顯高于正常食管組織(0.08±0.06)(t=12.59,P<0.0001),見圖1。

圖1 數(shù)據(jù)庫中SNHG6在正常食管組織及ESCC中的表達(dá)情況

2.2 SNHG6在ESCC及癌旁組織中的表達(dá)情況

qPCR檢測顯示,96例ESCC組織中SNHG6 mRNA表達(dá)水平(1.40±0.65)顯著高于癌旁組織(0.17±0.15)(t=17.93,P<0.0001),見圖2。

圖2 SNHG6在ESCC及癌旁組織中的表達(dá)情況

2.3 SNHG6表達(dá)與ESCC患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

本研究將所有ESCC患者相對表達(dá)臨界閾值定為1,相對表達(dá)>1為高表達(dá),≤1為低表達(dá)。SNHG6表達(dá)水平與ESCC患者性別、年齡、吸煙史和家族腫瘤史無關(guān)(P均>0.05),與TNM分期(χ2=12.834,P<0.0001)、分化程度(χ2=15.886,P<0.0001)和飲酒史(χ2=4.051,P=0.044)相關(guān),見表1。

表1 SNHG6表達(dá)與ESCC患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

3 討論

研究表明,95%以上的EC是ESCC或腺癌,同時這兩種不同的EC具有不同的臨床特征,具體差異體現(xiàn)在腫瘤位置和易感因素[9-10]。ESCC主要危險因素是吸煙和飲酒[11-12]。由于早期癥狀輕微,或與其他食管相關(guān)疾病癥狀重疊,因此ESCC難以在早期被發(fā)現(xiàn)。同時,這種癌癥的治療是世界性難題。因此,尋找針對的標(biāo)志物勢在必得。lncRNA是一類無開放閱讀框的RNA分子。雖然其不具有編碼蛋白的能力,但lncRNA被證實在染色質(zhì)重塑、mRNA降解、蛋白翻譯后修飾等多個重要節(jié)點調(diào)控腫瘤發(fā)生和發(fā)展[13]。因此,lncRNA失調(diào)可能與惡性腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)。

SNHG6,也稱U87HG,可通過和多種miRNA結(jié)合,以調(diào)控其表達(dá)水平來參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[14]。2016年Chang等人首次證實,SNHG6在肝細(xì)胞癌中過表達(dá),并能夠通過誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移,被認(rèn)為具有重要[15-16]。但在ESCC中的表達(dá)及其臨床價值探討少有。為了明確SNHG6在ESCC中是否存在表達(dá)異常,本研究首先在TCGA數(shù)據(jù)庫中分析了SNHG6的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,與正常食管組織相比,SNHG6在ESCC癌組織中表達(dá)水平明顯更高。這說明,SNHG6可能與ESCC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。為了驗證這一猜想,本研究通過qPCR法檢測了96例ESCC患者根治術(shù)中獲取的癌組織及癌旁組織樣本中的SNHG6表達(dá)水平。結(jié)果顯示,SNHG6在ESCC組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁組織。這一結(jié)果印證了上述猜想,也提示SNHG6的表達(dá)水平在ESCC發(fā)展中上調(diào)。同時,其可能影響EESCC細(xì)胞的生物學(xué)功能,并可能成為ESCC診斷的分子標(biāo)志物。

隨后,本研究分析了SNHG6與ESCC患者臨床癥狀的相關(guān)性。上述研究發(fā)現(xiàn),癌旁組織SNHG6表達(dá)水平最高為1.030,正常食管組織這一值為0.18,癌組織中SNHG6表達(dá)量的95%CI為1.278～1.766。所以本研究將所有ESCC患者相對表達(dá)臨界閾值定為1。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),表達(dá)水平高于1的患者更多出現(xiàn)于TNM Ⅲ～Ⅳ期,或腫瘤中、高分化,或具有飲酒史患者中。這說明,SNHG6可能參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲。但由于本研究納入近年病例,隨訪時間不足,未探究SNHG6與患者預(yù)后、生存率等近遠(yuǎn)期指標(biāo)間的相關(guān)性。因此在下一步的研究中,將延長研究時間,分析SNHG6與近遠(yuǎn)期預(yù)后之間的相關(guān)性。

綜上所述,SNHG6在ESCC組織中呈高水平表達(dá),其高表達(dá)與ESCC患者TNM分期、分化程度和飲酒史密切相關(guān),可作為分子標(biāo)志物為早期診斷和預(yù)后判斷提供基礎(chǔ)。