柳 毅 高絢照 常文廣

惡性膠質(zhì)瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見的原發(fā)性腫瘤[1]。盡管在手術(shù)技術(shù)、化療和放療方面取得了許多進(jìn)展,但惡性膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍然頑固地不佳。膠質(zhì)瘤的進(jìn)展取決于腫瘤血管的生長[2]。膠質(zhì)瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子和其他促血管生成因子,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長。此外,膠質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞還分泌多種促進(jìn)腫瘤生長的因子,這些分泌的因子的相互作用可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤生長[3]。miRNA通過與目標(biāo)基因的3'-非翻譯區(qū)(3'-UTR)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)。miRNAs調(diào)節(jié)許多癌癥關(guān)鍵的信號(hào)通路,進(jìn)而發(fā)揮致癌或腫瘤抑制功能[4]。例如,miR-339-5p的過度表達(dá)可以抑制結(jié)直腸癌和乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲并誘導(dǎo)其凋亡,并且這一過程與miR-339-5p調(diào)控p53相關(guān)[5]。最近研究發(fā)現(xiàn),相比癌旁組織,miR-339-5p在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)下降[6],然而,miR-339-5p對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用及相關(guān)機(jī)制尚未報(bào)道,因此本研究通過研究miR-339-5p與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞之間的關(guān)系,以期為腦膠質(zhì)瘤的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞(上海弘順生物科技公司);Lipofectamine 2000(美國賽默飛公司);AnnexinV-FITC試劑盒(上海碧云天生物科技公司);Transwell chamber(美國sigma公司);TRIzol Reagent(美國Invitrogen公司);TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司);SYBR Premix ExTaqTMReal-Time PCR Kit(美國Thermo Fisher公司);p53, GAPDH單克隆抗體(英國abeam公司);miR-339-5p mimics, si-p53(武漢漢恒生物)。

倒置顯微鏡(美國Thermo公司);酶標(biāo)儀(美國BIOTEK公司);Western bloting實(shí)驗(yàn)設(shè)備(德國PROTEC公司);流式細(xì)胞儀(美國BD公司);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國BIO-RAD公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中,在37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為4組:空白組、miR-339-5p mimic組、si-p53組、miR-339-5p mimic+si-p53組。按照說明書的要求,用Lipofectamine 2000分配并轉(zhuǎn)染到相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組。轉(zhuǎn)染完成后48 h開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力

轉(zhuǎn)染完成48 h后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至96孔板中,每孔大約5×103個(gè)細(xì)胞,加入20 μL MTT液(5.0 mg/ml),37 ℃培養(yǎng)4 h,用100 ml二甲基亞砜溶解紫色晶體,通過Mitras2LB943多功能酶標(biāo)儀在0、12、24、36、48 h分別檢測各組細(xì)胞的吸光度(490 nm)。

1.4 蛋白免疫印跡法檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)變化

使用RIPA裂解緩沖液從細(xì)胞系中提取總蛋白樣品,使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。等量的蛋白樣品在10%的SDS-PAGE上分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。膜在室溫下用5%的脫脂牛奶浸泡2小時(shí)。然后將膜與相應(yīng)的第一抗體在4 ℃下孵育過夜。用TBST洗滌后,將膜與山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶二抗在室溫下孵育2小時(shí),用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)捕捉印跡信號(hào)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析miR-339-5p和p53基因表達(dá)水平

使用TRIzol試劑從細(xì)胞系中提取總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒在37 ℃下60 min或98 ℃下10 min合成cDNA,使用SYBR Premix ExTaqTM實(shí)時(shí)PCR試劑盒在Applied Biosystems 7500序列檢測器上使用以下引物序列進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。熱循環(huán)條件如下:95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃40個(gè)循環(huán)30 s,60 ℃退火延伸1 min。所有反應(yīng)均為一式三份。以U6為內(nèi)參并使用2-ΔΔCq方法計(jì)算。引物序列見表1。

表1 所用引物序列

1.6 流式細(xì)胞術(shù)分析U87細(xì)胞凋亡率

轉(zhuǎn)染72 h后,收獲細(xì)胞,用冰冷的PBS清洗兩次,并在4 ℃下用70%的乙醇固定1 h。將細(xì)胞與50 μl RNase1在室溫下孵化10 min以降解RNA。在4 ℃下以3500 rpm離心5 min,然后加入5 μl Annexin V-FITC,5 μl碘化丙啶,在室溫下暗中雙染30 min。使用FACScan流式細(xì)胞儀評(píng)估細(xì)胞凋亡狀態(tài)。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)分析U87細(xì)胞侵襲能力

在無血清RPMI-1640培養(yǎng)基下,將有轉(zhuǎn)染完成后的U87細(xì)胞接種在Matrigel涂層的小室的上室。將含有15%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基加入下室。24小時(shí)后,在顯微鏡下觀察到侵入下室的細(xì)胞,隨后用結(jié)晶紫染色,使用Image J軟件統(tǒng)計(jì)U87細(xì)胞侵襲情況。

1.8 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-339-5p與p53的靶向關(guān)系

miR-339-5p與p53的結(jié)合位點(diǎn)是通過工具site targetscan獲得的。將p53的3'-UTR片段插入熒光素酶終止密碼子下游的pGL3載體中構(gòu)建p53-WT。并使用快速定向誘變?cè)噭┊a(chǎn)生突變體p53-MT。用螢火蟲熒光素酶的報(bào)告載體和海腎熒光素酶載體pRLTK共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,并加入0.5 μg的miR-339-5p mimic或miR NC。使用雙熒光素酶檢測法連續(xù)測量螢火蟲和海腎熒光素酶的活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用IBM SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。多組間的差異采用單因素方差分析進(jìn)行比較,兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中miR-339-5p和p53表達(dá)情況

各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,通過qPCR和蛋白免疫印跡檢測miR-339-5p和p53的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-339-5p和p53的表達(dá)組間比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-339-5p mimic組和miR-339-5p mimic+si-p53組miR-339-5p表達(dá)水平高于空白組和si-p53組(P<0.05)。si-p53組p53 mRNA和蛋白水平均低于其他3組(P<0.05),miR-339-5p mimic組p53 mRNA和蛋白水平均高于其他3組(P<0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞miR-339-5p和p53表達(dá)情況

2.2 膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中p53是miR-339-5p的直接靶點(diǎn)

通過TargetScan發(fā)現(xiàn)Has-miR-339-5p與p53基因的3'-UTR存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn),見圖1。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn),與陰性對(duì)照miR NC組相比,miR-339-5p mimic和p53-WT共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性明顯增加。另外,蛋白印跡法進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-339-5p mimic可以促進(jìn)p53的表達(dá),見表3。

圖1 p53潛在上游miR-339-5p結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果

表3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果

2.3 各組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖活性比較

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖率組間比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-339-5p mimic組細(xì)胞增殖率低于空白組、si-p53組和miR-339-5p mimic+si-p53組。與miR-339-5p mimic組相比,miR-339-5p mimic+si-p53組細(xì)胞增殖率升高(P<0.05),見圖2和表4。

圖2 各組細(xì)胞在不同時(shí)間增殖率比較

表4 各組細(xì)胞的增殖活性比較

2.4 各組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的侵襲能力比較

Transwell實(shí)驗(yàn)顯示,各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)量組間比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-339-5p mimic組細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)量低于空白組、si-p53組和miR-339-5p mimic+si-p53組。與miR-339-5p mimic組相比,miR-339-5p mimic+si-p53組細(xì)胞侵襲數(shù)量升高(P<0.05),見表5。

表5 各組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的侵襲數(shù)量比較

2.5 各組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞凋亡率比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),各組膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率組間比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-339-5p mimic組細(xì)胞凋亡率高于空白組、si-p53組和miR-339-5p mimic+si-p53組。與miR-339-5p mimic組相比,miR-339-5p mimic+si-p53組細(xì)胞凋亡率下降(P<0.05),見圖3和表6。

圖3 各組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的凋亡率比較

表6 各組膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的凋亡率比較

3 討論

miRNA可以調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移,成為相關(guān)腫瘤的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn),從而為腫瘤的診斷和治療提供可能[7]。相關(guān)研究分析了癌癥和健康樣本在不同階段的miRNA表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)miRNA可以區(qū)分癌癥和健康樣本。miRNA廣泛存在于膠質(zhì)瘤中,但每個(gè)miRNA的表達(dá)水平在膠質(zhì)瘤中是不同的[8]。相關(guān)研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)鑒定不同程度的惡性腫瘤中10種miRNA的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤的惡性程度越高,miR-13和miR-7的表達(dá)水平越低,而miR-21、miR-17、miR-9、miR-26a、miR-23a和miR-20a則隨之升高[9]。研究證明,miRNA的差異表達(dá)可能是膠質(zhì)瘤的重要分子生物標(biāo)志物,在基因表達(dá)調(diào)控方面具有潛在的研究價(jià)值。

最近研究發(fā)現(xiàn),相比癌旁組織,miR-339-5p在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)下降,既往研究報(bào)道m(xù)iR-339-5P的表達(dá)與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān),并可能抑制乳腺癌細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移潛力,這一結(jié)果提示miR-339-5p可能參與大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞癌變[10]。本文證明了miR-339-5p在人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲能力中的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),接受miR-339-5p mimic轉(zhuǎn)染的人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖率和侵襲數(shù)量都顯著降低,而凋亡率明顯升高。以上結(jié)果顯示,過度表達(dá)的miR-339-5p可以抑制人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖和侵襲能力,并促進(jìn)細(xì)胞的程序性死亡。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),miR-339-5p抑制非小細(xì)胞腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力,與癌癥淋巴轉(zhuǎn)移期和淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11]。還有研究表明,抑制miR-339-5p的表達(dá)會(huì)提高兩種卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力,而上調(diào)的miR-339-5p會(huì)減弱這兩種卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲能力,這些報(bào)道均與本研究結(jié)論一致。除此之外,p53腫瘤抑制蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子,作為許多應(yīng)激感應(yīng)途徑的中心樞紐,對(duì)細(xì)胞對(duì)基因毒性應(yīng)激的反應(yīng)和抑制腫瘤的發(fā)生至關(guān)重要[12]。如果p53功能失調(diào),一些DNA損傷得不到修復(fù),這可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定,這是癌癥的一個(gè)標(biāo)志。此外,有p53缺陷的細(xì)胞能夠逃避凋亡途徑,并在這些細(xì)胞壓力的選擇下無限期地增殖[13]。因此,p53在預(yù)防致癌方面起著關(guān)鍵作用。研究表明,在超過50%的人類癌癥中,p53發(fā)生了突變[14]。在本研究中,抑制p53表達(dá)后,人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖和侵襲能力增高,并且凋亡率降低。這一結(jié)果說明p53能夠抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞活性。一些調(diào)控p53或影響p53激活的miRNA已被認(rèn)為是癌癥中重要的預(yù)后生物標(biāo)志物和/或代表癌癥治療導(dǎo)向的研究對(duì)象[15]。因此,更透徹地了解調(diào)節(jié)這一關(guān)鍵途徑的miRNA是很重要的。本研究中,和空白組相比,轉(zhuǎn)染miR-339-5p mimic后,p53的蛋白和mRNA表達(dá)升高。另外,雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示,miR-339-5p能夠靶向調(diào)節(jié)p53的活性。此外,抑制p53后,miR-339-5p對(duì)U87細(xì)胞的抑制作用明顯減弱,這些結(jié)果表明,miR-339-5p能夠通過靶向提高p53表達(dá)抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移活性。

綜上所述,研究發(fā)現(xiàn),miR-339-5p能夠抑制腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖和侵襲,并促進(jìn)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞凋亡,同時(shí)這一過程與靶向激活p53相關(guān)。