鐘南山 楊 楓 劉志禮

FASN(fatty acid synthase,脂肪酸合成酶)在多種腫瘤中高表達(dá),促進(jìn)腫瘤惡性表型[1]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)FASN通過介導(dǎo)細(xì)胞失巢凋亡抵抗促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移[2],但是FASN在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明。泛素化修飾是蛋白翻譯后修飾的重要方式之一,蛋白泛素化異常是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素[3]。在本研究中,作者通過構(gòu)建失巢細(xì)胞模型,探討了FASN受到泛素化修飾調(diào)控的機(jī)制,并鑒定出了SYVN1是其E3連接酶,過表達(dá)SYVN1促進(jìn)細(xì)胞失巢凋亡抵抗而抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移。

1 材料與方法

1.1 人骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)

人骨肉瘤143B細(xì)胞系購自美國典型生物資源保藏中心(American type culture collection,ATCC)的細(xì)胞庫。該細(xì)胞系通過短串聯(lián)重復(fù)(STR)分析進(jìn)行鑒定,并在MEM-α培養(yǎng)基(Gibco,美國)中培養(yǎng)。細(xì)胞補(bǔ)充10%胎牛血清(Gibco,美國)和100 U/mL青霉素-鏈霉素(Gibco,美國),并在37 ℃和5%二氧化碳環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2 超低吸附培養(yǎng)皿法構(gòu)建骨肉瘤細(xì)胞失巢凋亡抵抗模型

使用超低吸附培養(yǎng)皿(Corning,美國)培養(yǎng)細(xì)胞,將消化后的骨肉瘤細(xì)胞重懸后鋪入超低吸附培養(yǎng)皿中,加入含20%FBS的MEM-α培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),48 h后將含細(xì)胞的懸液進(jìn)行收集,低速(200 rpm)離心,小心吸去上清,加入PBS洗滌細(xì)胞一次,再次低速離心去除上清剩余的細(xì)胞加入新鮮含20% FBS的MEM-α培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),待“失巢凋亡抵抗”細(xì)胞生長球體直徑至大于約30個細(xì)胞時,重復(fù)上述收集離心洗滌步驟,洗滌后的失巢凋亡抵抗細(xì)胞使用Accumax(Sigma,美國)解離液37 ℃孵育酶解10 min,解離成單個細(xì)胞后按1∶2～1∶3的比例再次種入超低吸附培養(yǎng)皿中。

1.3 慢病毒載體的構(gòu)建

根據(jù)目標(biāo)分子對應(yīng)CDS的序列,在5'端和3'端引入酶切位點,合成全長的目標(biāo)分子模板,連接至經(jīng)雙酶切的pLvTHM載體,轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌并挑取重組陽性克隆,經(jīng)PCR、雙酶切鑒定,鑒定正確的質(zhì)粒送DNA測序。插入shRNA序列或轉(zhuǎn)錄本編碼:shSYVN1:5′-GAGACAGTTTCAGATGATT-3′SYVN1:NM_032431.3,FASN:NM_004104.5。

慢病毒的包裝與擴(kuò)增:將重組的慢病毒載體,轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,以產(chǎn)生具有感染能力的重組慢病毒。獲得的重組慢病毒反復(fù)感染HEK293細(xì)胞以擴(kuò)增病毒,采用終點稀釋分析方法測定慢病毒滴度。

1.4 qRT-PCR法檢測相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

使用Trizol(Thermo,美國)提取總RNA并定量后,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾維贊,南京)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,加入目的基因、上下游引物、含SYBR greenⅠ擴(kuò)增酶(諾維贊,南京)等進(jìn)行熒光定量PCR檢測,以ACTB為內(nèi)參。具體方法參見《分子克隆實驗指南(第四版)》和有關(guān)試劑盒說明書。引物序列:FASN-F,5′-TGCTAGCTGATCGATCGATCGTCG-3′;FASN-R,5′-CGTAGCTGATCGATGCTAGCTAGC-3′;SYVN1-F,5′-AACCCCTGGGACAACAAGG-3′;SYVN1-R,5′-GCGAGACATGATGGCATCTG-3′;ACTB-F,5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′;ACTB-R,5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)

應(yīng)用凋亡檢測試劑盒(貝博,蘇州)來檢測骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期分布和凋亡細(xì)胞的百分比。所有細(xì)胞系都使用不含EDTA的胰蛋白酶進(jìn)行消化,并使用Annexin V/PI進(jìn)行染色,經(jīng)安捷倫流式細(xì)胞儀,檢測APC-PEtexRED通道上細(xì)胞凋亡比例分布。

1.6 免疫印跡分析

使用RIPA裂解法(Thermo,美國)提取骨肉瘤細(xì)胞的總蛋白。蛋白質(zhì)濃度由BCA檢測法(Thermo,美國)確定。等量的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE電泳后通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到經(jīng)甲醇活化的PVDF印跡膜上(Millipore,美國)。膜在室溫下用5%脫脂牛奶-TBST封閉2小時,然后根據(jù)上樣情況用FASN、SYVN1、UB、FLAG、HA等(CST,美國)一抗在4 ℃下孵育過夜。次日TBST清洗膜3次,用適當(dāng)?shù)睦备^氧化物酶(HRP)結(jié)合的二抗(抗兔和抗鼠,CST,美國)孵育1h,再次用TBST清洗膜3次。通過ECL成像(Bio-Rad,美國)檢測免疫復(fù)合物在膜上的情況。

1.7 免疫共沉淀實驗

收集細(xì)胞,IP buffer(Thermo,美國)裂解后4 ℃離心機(jī)15000 g離心15 min,收集上清,少量全細(xì)胞裂解液留于Western blot分析,其余加入目的蛋白/標(biāo)簽抗體和50 μl洗滌過的protein A/G-beads(MCE,美國)4 ℃孵育過夜,離心后去上清,取約30 μl 1x loading buffer 95 ℃加熱磁珠10 min,產(chǎn)物用于Western blot檢測目的蛋白及與其結(jié)合的其他蛋白。

1.8 裸鼠原位異種移植骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型

選取4周齡的雌性BALB/C-nude鼠(杭州子源實驗動物科技有限公司,SCXK(浙),2019-0004,中國杭州)。首先建立AR-143B細(xì)胞裸鼠皮下荷瘤模型:將約1×107經(jīng)不同處理方式處理的AR-143B細(xì)胞分別皮下注射至裸鼠左和右側(cè)肩胛處,3周成瘤后脫頸法犧牲裸鼠,解剖取出瘤體,并分別將其切割約1 mm3大小的瘤塊,植入裸鼠脛骨近端骨髓腔內(nèi);4周后脫頸法犧牲裸鼠,熒光活體成像儀檢測原位成瘤情況及肺部轉(zhuǎn)移情況,解剖取出瘤體和肺組織,測量瘤體體積V=長×寬×高×π/6,大體計數(shù)肺部轉(zhuǎn)移灶數(shù)量。本實驗方案得到了南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(江西,中國;編號:CDYFY-IACUC-202211QR012)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

離散數(shù)據(jù)采用非參數(shù)的Wilcoxon排名和檢驗分析。所有連續(xù)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。在雙樣本分析中使用t檢驗,在多樣本分析中使用單因素方差分析。所有的分析都是用SPSS統(tǒng)計軟件22.0版(SPSS,美國)進(jìn)行的。

2 結(jié)果

2.1 骨肉瘤143B細(xì)胞懸浮狀態(tài)下FASN泛素化水平降低而表達(dá)升高

Western Blot檢測顯示:在貼壁143B細(xì)胞中FASN蛋白水平顯著低于AR-143B細(xì)胞中FASN表達(dá)水平(圖1A),但是mRNA水平并無明顯差異(圖1B);提示失巢凋亡抵抗的骨肉瘤細(xì)胞中FASN表達(dá)的升高,可能與其轉(zhuǎn)錄后修飾相關(guān)。

注：A&B為AR-143B與143B細(xì)胞中FASN的蛋白和mRNA表達(dá)情況;C為降解實驗檢測FASN在143B細(xì)胞內(nèi)降解模式;D&E為降解實驗檢測143B與AR-143B細(xì)胞中FASN蛋白的半衰期;F為泛素化實驗檢測失巢凋亡抵抗過程中FASN表達(dá)量及其泛素化修飾水平的變化。

CHX-MG132降解實驗顯示,FASN的降解受蛋白酶體抑制劑MG132的抑制(圖1C),并且相比貼壁143B細(xì)胞,AR-143B細(xì)胞中FASN蛋白降解速度有所下降(圖1D、E);進(jìn)一步的泛素化實驗顯示:AR-143B細(xì)胞中的FASN蛋白具有更低的泛素化水平(圖1F),這提示AR-143B細(xì)胞中FASN水平的升高與FASN蛋白的泛素化降解水平降低有關(guān)。

2.2 FASN相互作用的E3-連接酶

通過蛋白組學(xué)測定了在143B細(xì)胞與AR-143B中具有差異的蛋白,通過功能富集把其中泛素化功能相關(guān)蛋白富集,其中AR-143B樣品中表達(dá)水平降低的泛素化相關(guān)蛋白有12個,升高的泛素化相關(guān)蛋白有3個(圖2A);與在線泛素化相關(guān)蛋白預(yù)測網(wǎng)站Ubibrowser(http://ubibrowser.bio-it.cn/ubibrowser/home/index)上FASN可能存在的E3泛素連接酶或去泛素化酶(圖2B)進(jìn)行交集,結(jié)果顯示:E3連接酶SYVN1是其交集(圖2C);Western Blot實驗證實SYVN1在AR-143B細(xì)胞中相比普通143B細(xì)胞表達(dá)更低(圖2D),并且免疫共沉淀實驗顯示:在HEK-293T細(xì)胞和AR-143B細(xì)胞中FASN和SYVN1這兩個分子可以相互富集(圖2E、F);這提示SYVN1很可能是FASN的E3連接酶。

注：A為熱圖顯示iTRAQ蛋白組學(xué)中143B與AR-143B細(xì)胞的泛素化相關(guān)蛋白水平差異;B為Ubibrowser預(yù)測FASN的E3泛素連接酶和去泛素化酶;C為蛋白組學(xué)結(jié)果和在線預(yù)測結(jié)果交疊;D為AR-143B與143B細(xì)胞中SYVN1蛋白水平驗證;E&F為免疫共沉淀檢測FASN和SYVN1間相互作用。

2.3 SYVN1促進(jìn)FASN泛素化降解

在AR-143B細(xì)胞中通過慢病毒載體過表達(dá)或沉默SYVN1,qRT-PCR、Western blot驗證其過表達(dá)或沉默效果,結(jié)果提示,經(jīng)篩選的穩(wěn)定細(xì)胞株中SYVN1的水平都被成功上調(diào)與下調(diào)(圖3A、B),過表達(dá)SYVN1后FASN的泛素化水平升高,并且蛋白水平降低(圖3C);沉默SYVN1后,FASN的泛素化水平隨之下降而蛋白水平升高(圖3D)。以上結(jié)果提示SYVN1可作為FASN的E3連接酶通過泛素化修飾FASN而影響其穩(wěn)定性。

注：A與B為Western blot和qRT-PCR驗證過表達(dá)或沉默SYVN1效果;C為過表達(dá)SYVN1可顯著增加FASN泛素化水平使其降解;D為沉默SYVN1可顯著降低FASN泛素化水平。

2.4 SYVN1降解FASN促進(jìn)骨肉瘤143B細(xì)胞失巢凋亡

為分析SYVN1對骨肉瘤細(xì)胞失巢凋亡抵抗能力的影響是否通過降解FASN實現(xiàn),使用FASN標(biāo)簽質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達(dá)SYVN1的穩(wěn)定細(xì)胞系進(jìn)行回復(fù)實驗。Western blot結(jié)果提示,在上調(diào)SYVN1表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株中FASN的量有所下降,轉(zhuǎn)染1 μg FASN質(zhì)粒后FASN表達(dá)有所上升(圖4A)。腫瘤成球?qū)嶒灆z測細(xì)胞增殖活力,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況,結(jié)果顯示:相對于陰性對照組,Lv-SYVN1轉(zhuǎn)染的AR-143B細(xì)胞中,細(xì)胞失巢凋亡率顯著升高,轉(zhuǎn)染FASN質(zhì)粒的細(xì)胞中凋亡細(xì)胞比例明顯下降,而同時上調(diào)SYVN1與FASN,相較于只上調(diào)SYVN1的組別,其凋亡細(xì)胞比例有所下降(圖4B);腫瘤成球?qū)嶒烇@示,AR-143B細(xì)胞上調(diào)SYVN1水平后腫瘤球直徑顯著小于陰性對照組,而上調(diào)FASN則會增強(qiáng)細(xì)胞成球能力,同時上調(diào)SYVN1與FASN,相較于只上調(diào)SYVN1的組別,其細(xì)胞成球能力有所提升(圖4C)。以上結(jié)果提示SYVN1通過介導(dǎo)FASN泛素化降解,促進(jìn)143B細(xì)胞失巢凋亡。

注:A與B為Western blot檢測;C為流式細(xì)胞術(shù)檢測;D為腫瘤成球?qū)嶒灆z測。

2.5 SYVN1抑制骨肉瘤細(xì)胞異種原位成瘤模型肺部轉(zhuǎn)移

將約1×107分別經(jīng)Lv-SYVN1和Lv-Vector轉(zhuǎn)染(帶GFP熒光蛋白標(biāo)簽)的AR-143B細(xì)胞皮下注射裸鼠左右兩側(cè)肩胛處(n=1),3周后兩組細(xì)胞均皮下成瘤,頸椎脫臼法處死裸鼠,解剖取出瘤體并切割成小塊原位移植至裸鼠脛骨近端髓腔,建立裸鼠骨肉瘤原位模型(n=6)。4周后熒光活體成像觀察成瘤情況,發(fā)現(xiàn)經(jīng)Lv-SYVN1感染細(xì)胞組3只裸鼠未見瘤體形成(成瘤率50%),經(jīng)Lv-Vector感染細(xì)胞組裸鼠均成瘤(成瘤率100%)(圖5A),但肺部未見顯著轉(zhuǎn)移性結(jié)節(jié)的熒光信號;處死裸鼠取出瘤體,測量計算體積,大體觀察肺部微小轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù),結(jié)果顯示:Lv-SYVN1感染細(xì)胞組瘤體體積顯著小于經(jīng)Lv-Vector感染細(xì)胞組(圖5B);Lv-SYVN1感染細(xì)胞組未發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移,經(jīng)Lv-Vector轉(zhuǎn)染細(xì)胞組3只發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移(圖5C)。這提示過表達(dá)SYVN1可抑制異種原位移植的骨肉瘤細(xì)胞增殖和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

注:A為裸鼠原位成瘤實驗;B為裸鼠原位骨肉瘤成瘤體積測量;C為大體計數(shù)裸鼠肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié),黑色箭頭為轉(zhuǎn)移灶。

3 討論

失巢凋亡是細(xì)胞脫離原位灶后,自發(fā)性產(chǎn)生凋亡的一種獨特現(xiàn)象,這在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中是必經(jīng)的步驟[4]。腫瘤經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移的步驟包括從原位病灶脫落,穿過細(xì)胞外基質(zhì),經(jīng)由血管內(nèi)皮進(jìn)入微小血管,產(chǎn)生失巢凋亡抵抗特性,進(jìn)而經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)(又稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞)到達(dá)適宜的再生長部位,形成轉(zhuǎn)移腫瘤灶[5],而在這個過程中,最重要的就是逃避失巢凋亡。課題組在前期研究中,已成功通過懸浮培養(yǎng)法構(gòu)建失巢凋亡抵抗的細(xì)胞株AR-143B,并觀測到FASN在其中表達(dá)量高于普通貼壁培養(yǎng)的143B,沉默F(xiàn)ASN會顯著降低骨肉瘤細(xì)胞的失巢凋亡抵抗能力[2],但FASN升高的機(jī)制當(dāng)時未作進(jìn)一步探討。

FASN作為經(jīng)典的癌基因之一,與腫瘤細(xì)胞惡性程度息息相關(guān),其升高往往預(yù)示著腫瘤預(yù)后不良[6]。Yasmina等報導(dǎo)FASN促進(jìn)脂質(zhì)相關(guān)的磷脂結(jié)構(gòu)合成原料生成,這可以增加自噬小體的產(chǎn)生,從而支持腫瘤細(xì)胞在更惡劣的環(huán)境中生存下去[7],Zou等[8]報導(dǎo)在肝癌中由于脂質(zhì)堆積異常導(dǎo)致肝癌細(xì)胞脂代謝重編程,升高的FASN在其中利用豐富的內(nèi)源性脂質(zhì)合成原料生成更多可供腫瘤細(xì)胞增殖和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的膜及囊泡結(jié)構(gòu)--這一效應(yīng)是由SREBP1驅(qū)動FASN轉(zhuǎn)錄實現(xiàn)的。但一直以來有關(guān)FASN在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中升高的機(jī)制卻未見闡明。在本研究中,我們利用失巢凋亡抵抗模型,模擬腫瘤在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程時經(jīng)歷的循環(huán)腫瘤細(xì)胞階段,并利用分子生物學(xué)手段結(jié)合蛋白組學(xué)定量技術(shù),初步探究了FASN在骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的升高是由于其E3連接酶SYVN1對其泛素化修飾減少導(dǎo)致的,并首次在骨肉瘤中初步研究了E3連接酶SYVN1的功能,其能夠降解FASN而對腫瘤失巢凋亡抵抗產(chǎn)生抑制作用。在體內(nèi)實驗中,GFP標(biāo)記的骨肉瘤細(xì)胞難以在活體成像中探測出肺部微小轉(zhuǎn)移灶,而大體觀察結(jié)果提示僅有Lv-Vector組別細(xì)胞存在三只肺轉(zhuǎn)移個體,總體結(jié)果提示過表達(dá)SYVN1可以有效抑制骨肉瘤細(xì)胞原位成瘤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,但在過表達(dá)SYVN1的組別中,存在三只成瘤效果不佳的個體,且總體肺轉(zhuǎn)移率較低。這是本實驗的不足之處,但SYVN1對骨肉瘤成瘤的抑制效果仍是顯著的,不影響本文結(jié)論成立。

FASN的抑制劑一直以來都備受關(guān)注,從最早發(fā)現(xiàn)的FASN天然抑制劑淺藍(lán)菌素[9],到最近新開發(fā)的FASN蛋白分子靶向抑制劑6p[10],針對這一前景廣闊的癌癥抑制靶點,眾多學(xué)者不斷致力于開發(fā)更精準(zhǔn)的分子抑制劑,并取得了顯著的體內(nèi)外效果[11],并在一些疾病(如酒精性脂肪肝)的動物模型治療上取得了令人滿意的療效[12],然而,直至今日,FASN抑制劑在腫瘤中的效果仍然不完全令人滿意。

直接靶向FASN將影響其他代謝正常細(xì)胞的脂質(zhì)從頭合成過程,從而導(dǎo)致一系列的毒副作用[13]。所以,針對異常升高的FASN進(jìn)行精準(zhǔn)降解,才是將這個強(qiáng)力腫瘤治療靶點應(yīng)用性提高的重要措施。泛素化是細(xì)胞內(nèi)最常見的蛋白質(zhì)平衡調(diào)控機(jī)制,異常表達(dá)或錯誤折疊的蛋白大多經(jīng)泛素-28S蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)控,降解為氨基酸,重新加入蛋白質(zhì)合成的過程[14]。促進(jìn)癌基因或腫瘤代謝關(guān)鍵通路分子的泛素化修飾已成為開發(fā)腫瘤靶向藥物的常用手段,其優(yōu)勢在于利用細(xì)胞內(nèi)天然的降解回收系統(tǒng),讓水平異常靶標(biāo)分子的水平回復(fù)一個趨近正常的狀態(tài),而不是針對所有細(xì)胞的同一靶蛋白同步作用,其導(dǎo)致的毒副作用將相對更小[15]。靶向FASN的泛素化降解可以更好地控制這一癌基因異常高表達(dá)導(dǎo)致的腫瘤惡性程度增加,同時更好的保護(hù)正常細(xì)胞中的代謝不受到單分子抑制劑的廣泛影響。FASN泛素化機(jī)制的研究將促進(jìn)針對這一分子的精準(zhǔn)靶向調(diào)控得到進(jìn)一步發(fā)展。本研究已闡述SYVN1調(diào)控FASN泛素化降解的作用,但SYVN1水平在失巢凋亡的骨肉瘤細(xì)胞是為什么而降低,后期我們將對這方面進(jìn)一步探索。

綜上所述,我們研究發(fā)現(xiàn)在失巢凋亡抵抗的骨肉瘤細(xì)胞中SYVN1表達(dá)下調(diào),從而減少FASN泛素化水平使其得到穩(wěn)定,并且SYVN1能夠抑制骨肉瘤失巢凋亡抵抗能力,減少其遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究初步闡述了FASN與SYVN1在骨肉瘤發(fā)展進(jìn)程中的作用,將為后期FASN與SYVN1作為骨肉瘤潛在的治療靶點提供理論基礎(chǔ),為未來骨肉瘤的治療提供新的理論依據(jù)。