孫悠嫻, 齊蔓莉

1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院,天津 300052; 2.天津市人民醫(yī)院,天津 300000

沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis,CT)是性傳播感染的主要病原體之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的報(bào)告[1],CT每年約有1.285億新增病例,男性約6 990萬,女性約5 860萬。CT感染目前已是最常見的性傳播疾病之一。在女性群體中約有70%～80%呈無癥狀感染,若不加以治療控制,會(huì)引起女性上生殖道的瘢痕,并最終導(dǎo)致盆腔炎、異位妊娠、不孕癥等嚴(yán)重的后遺癥[2-3]。此外,有研究表明CT與HPV感染相關(guān)的宮頸癌有所關(guān)聯(lián)[4];CT感染還會(huì)使人類免疫缺陷病毒感染和傳播的風(fēng)險(xiǎn)增加3～4倍[5]。因此,CT感染的防治需引起足夠重視。CT有嚴(yán)格胞內(nèi)寄生的特性且擁有獨(dú)特的雙相發(fā)育周期[6-7],一種是形態(tài)較小的(直徑約200 nm)、具有感染性和非復(fù)制性的原體(elementary bodies, EBs),另一種是形態(tài)較大的(直徑約800 nm)、非感染性和具有繁殖復(fù)制能力的網(wǎng)狀體(reticulate bodies, RBs)。在CT的發(fā)育周期中,EBs通過內(nèi)吞作用附著并進(jìn)入宿主粘膜細(xì)胞后,被內(nèi)化在細(xì)胞內(nèi)包涵體中。內(nèi)化后約2 h,EBs經(jīng)二硫化物還原擴(kuò)大,分化成RBs。RBs在感染后約6 h經(jīng)過幾輪復(fù)制重新分化為EBs。在發(fā)育周期末,包涵體占據(jù)了宿主細(xì)胞大部分細(xì)胞質(zhì)。感染48～72 h后,大量感染性EBs從宿主細(xì)胞中釋放出來,感染鄰近的上皮細(xì)胞并使得CT感染的過程持續(xù)存在。CT的感染依賴于其對宿主細(xì)胞的黏附和入侵機(jī)制,該機(jī)制與CT的免疫優(yōu)勢蛋白息息相關(guān)[8],這些蛋白包括主要外膜蛋白(MOMP)、熱休克蛋白70(HSP70)、質(zhì)粒蛋白pgp3以及外膜復(fù)合物蛋白B(OmcB)等。OmcB在衣原體中是含量第二豐富的外膜蛋白[9-10],在衣原體感染過程中表現(xiàn)出強(qiáng)大的免疫原性[11],在幫助CT感染的診斷以及疫苗研發(fā)方面具有很好的應(yīng)用前景。因此,本文對OmcB的結(jié)構(gòu)、定位及作用機(jī)理等相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 外膜復(fù)合物蛋白B的結(jié)構(gòu)

外膜復(fù)合物蛋白B(outer membrane complex protein,OmcB),也被稱為CT443,其基因長度為1 659 bp,分子質(zhì)量約為60 kD。OmcB是一類富含24個(gè)半胱氨酸殘基的外膜多肽,在衣原體中是第二豐富的外膜蛋白,含量僅次于MOMP[9-10]。OmcB可以被分為一個(gè)具有高度保守性的C端部分,以及一個(gè)具有物種特異性的N端部分[12]。衣原體的所有OmcB蛋白在其N端結(jié)構(gòu)域中都至少有一個(gè)XBBXBX序列(圖1),該序列已被證實(shí)與介導(dǎo)衣原體黏附相關(guān)。OmcB C端CD8表位的鑒定表明C端可進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)[13]。OmcB蛋白在不同種衣原體之間具有高度保守性[14],Wang等[11]通過分析血清型D CT OmcB開放閱讀框序列,并與其他衣原體序列進(jìn)行BLAST分析,發(fā)現(xiàn)血清型D與H、G和K之間同源性為100%,與血清型B和C有99%同源性,與L1-L3之間亦有98%的同源性,表明OmcB在衣原體感染過程中起重要作用。這意味著OmcB或許在衣原體疫苗的研究上具有一定潛力。

SS:信號序列;BD:OmcB結(jié)合結(jié)構(gòu)域;N-terminus:OmcB N末端,為OmcB結(jié)合結(jié)構(gòu)域,具有物種特異性;C-terminus:OmcB C末端,具有高度保守性;標(biāo)紅區(qū)域?yàn)镺mcB結(jié)合結(jié)構(gòu)域(OmcB-BD),內(nèi)含至少一個(gè)XBBXBX基本序列(B代表一種堿性氨基酸),可與肝素結(jié)合。

2 外膜復(fù)合物蛋白B的定位

關(guān)于OmcB的定位曾存在一定爭議。Everett等[15]認(rèn)為OmcB完全位于周質(zhì)而非暴露于表面或定位于外膜上。相較之下,Ting等[16]發(fā)現(xiàn)鸚鵡熱衣原體的 OmcB也對EBs的胰蛋白酶消化敏感,并提出OmcB可能是暴露在細(xì)胞表面的。Mygind等[17]試圖通過免疫電子顯微鏡觀察OmcB特異性抗體解決沙眼OmcB表面定位問題,發(fā)現(xiàn)OmcB位于外膜內(nèi)表面,只有在用還原試劑和蛋白裂解酶處理后才能到達(dá)細(xì)胞表面。然而在此前的研究中,由于表面暴露的OmcB區(qū)域有限,或是由于針對整個(gè)OmcB蛋白產(chǎn)生的抗體無法識別OmcB的構(gòu)象表位,導(dǎo)致這些抗體無法與完整的EBs結(jié)合。Fadel等[8]從血清型LGV1中將OmcB分離并測序,克隆表達(dá)于大腸桿菌,最終蛋白酶裂解的結(jié)果表明重組OmcB蛋白的部分位于大腸桿菌的外膜內(nèi)表面上,其余部分位于周質(zhì)中;體外感染抑制試驗(yàn)表明使用抗OmcB有效抑制LGV1的感染,提示在沙眼衣原體表面確有OmcB蛋白暴露,并且在免疫功能方面可與抗體發(fā)生結(jié)合。

3 外膜復(fù)合物蛋白B的作用機(jī)理

得益于OmcB在CT感染中的豐富性和免疫原性,在診斷和疫苗研發(fā)方面,OmcB一直被視作一個(gè)重要研究靶點(diǎn)。鑒于CT感染癥狀的隱匿性及其并發(fā)癥的危害性,CT感染者的早期篩查和后續(xù)充分治療對CT感染的防控工作具有重要意義。然而目前國內(nèi)各種檢測方法存在一定缺陷,如侵入性檢查在取材時(shí)給患者造成痛苦、耗時(shí)費(fèi)力、檢測結(jié)果敏感性不高和特異性不高等問題[18]。血清學(xué)檢查中血清中pgp3、MOMP、HSP60抗體在臨床應(yīng)用中同樣存在局限性[3,9,19]。已有研究驗(yàn)證,在感染衣原體患者的血清中可檢測出高滴度的抗MOMP、衣原體蛋白酶樣活性因子(Chlamydial protease-like activity factor, CPAF)、易位肌動(dòng)蛋白募集磷酸化蛋白 (translocated actin recrui-ting phosphoprotein, Tarp)等特異性抗體,這些免疫優(yōu)勢蛋白已被運(yùn)用于疫苗的研發(fā)之中[20-22]。同樣提示OmcB作為一類免疫優(yōu)勢蛋白,在衣原體感染的早期檢測、診斷和疫苗研發(fā)方面或許存在著可期的研究空間與前景。

3.1 OmcB是一種免疫優(yōu)勢蛋白

在CT感染過程中,OmcB已被證實(shí)是一種免疫優(yōu)勢抗原。不管是在動(dòng)物還是在人類CT感染中都可介導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。

CD8+T細(xì)胞通過裂解受感染細(xì)胞以及分泌細(xì)胞因子的機(jī)制在解決多種胞內(nèi)細(xì)菌感染方面發(fā)揮效應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)人類CD8+T細(xì)胞可以識別OmcB,第一次運(yùn)用CT感染的樹突狀細(xì)胞獲得克隆的人類CD8+T細(xì)胞,驗(yàn)證出OmcB為CT的一種抗原,通過MHC Ⅰ類加工途徑并以此刺激人類CD8+T細(xì)胞,這是人類對此病原體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的第一步,激活CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)也是抵抗CT感染所必需的步驟[13]。Telyatnikova等[23]通過從CT誘導(dǎo)的反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎患者的滑液淋巴細(xì)胞中克隆并表達(dá)了CT特異性CD4+T細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)人類CD4+T細(xì)胞可以識別OmcB。這些結(jié)果說明OmcB在T細(xì)胞介導(dǎo)的CT感染的免疫過程中發(fā)揮了作用。

克隆表達(dá)OmcB全長基因存在一定困難。Wang等[11]以O(shè)mcB的C端為研究對象,采用PCR技術(shù)從基因組中擴(kuò)增C端序列,構(gòu)建OmcBc重組質(zhì)粒,成功誘導(dǎo)表達(dá)重組OmcBc融合蛋白;同時(shí)該研究收集120例CT感染患者血清,并對家兔和小鼠進(jìn)行免疫接種或感染,獲得7份兔免疫血清、9份腹腔免疫小鼠血清、5份滴鼻感染小鼠血清,對倍稀釋后用IFA檢測各份免疫血清效價(jià),結(jié)果顯示,在1 ∶5 000稀釋下的人免疫血清中,CT的包涵體依然可以清晰著色,而兔和小鼠的血清效價(jià)均大于1 ∶10 000;ELISA檢測結(jié)果表明在120例患者免疫血清中,重組OmcBc融合蛋白反應(yīng)陽性率為87.5%;家兔和小鼠免疫血清與重組OmcBc融合蛋白均可發(fā)生強(qiáng)烈的抗原抗體反應(yīng),反應(yīng)頻率為100%。由此可見重組OmcBc蛋白具有很強(qiáng)的抗原性。此項(xiàng)研究證明無論CT的增殖過程是否發(fā)生在宿主細(xì)胞內(nèi),免疫細(xì)胞對OmcB的呈遞過程依然可以照常進(jìn)行并進(jìn)一步誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答。

OmcB屬于晚期基因[24]。Qi等[25]為監(jiān)測全長OmcB蛋白的表達(dá),用1%SDS透化CT感染的細(xì)胞,在感染后2 h可檢測到EBs中預(yù)先存在的OmcB,但在感染后12 h和18 h消失,在24 h可檢測出新合成的OmcB,感染后36 h檢測到OmcB與生物體廣泛重疊;用2%皂苷透化后可明顯觀察到在感染后24 h,有OmcBc分泌到宿主細(xì)胞胞質(zhì)中,這表明分泌的OmcBc可能是由新合成的OmcB主動(dòng)加工而成的。

Qi等[25]針對OmcB C端和N端片段分別構(gòu)建抗OmcBc抗體和抗OmcBn抗體,在宿主細(xì)胞被CT感染后,在其細(xì)胞質(zhì)中檢測到很強(qiáng)的抗OmcBc抗體信號,而抗OmcBn抗體只在衣原體包涵體內(nèi)部檢測出信號;經(jīng)各項(xiàng)試驗(yàn)證明,OmcBc片段被釋放到宿主細(xì)胞胞質(zhì)中,而OmcBn片段和剩余的全長OmcB被保留在衣原體包涵體中;同時(shí)該研究為驗(yàn)證CT感染期間OmcBc具有高度免疫原性,使用了20例感染沙眼衣原體女性的抗血清,通過ELISA和免疫印跡法繪制OmcB的免疫顯性區(qū)域。在ELISA中,這20例中抗血清均陽性識別全長OmcB,匯集20種人抗血清時(shí)也得到相似的結(jié)果;使用蛋白質(zhì)印跡分析也證實(shí)了人抗體對 OmcBc片段的顯性識別。實(shí)驗(yàn)中,即使人抗血清的稀釋度很低,合并的陽性抗血清也能識別 OmcB 的所有C末端片段而非N末端片段,這證實(shí)了OmcBc的免疫優(yōu)勢。OmcBc片段表現(xiàn)出與全長OmcB相似的抗原性,這表明OmcBc在OmcB的免疫原性表達(dá)方面占絕大部分作用。而OmcBc在CT感染期間被釋放到宿主細(xì)胞胞質(zhì)中,同時(shí)分泌的OmcBc可以方便提取到溶液中以進(jìn)行抗體的識別,也表明其可以用于研發(fā)一種基于免疫組化的OmcBc快速檢測方法。

Hou等[26]研究發(fā)現(xiàn)CPAF在處理OmcB使其裂解成OmcBc的過程中發(fā)揮重要作用。CPAF是一種絲氨酸蛋白酶,由包涵體內(nèi)CT分泌后可通過Sec依賴性途徑[25]進(jìn)入宿主細(xì)胞周質(zhì)空間,這表明CPAF可能是切割 OmcB 的候選蛋白酶。OmcB在CT感染晚期的加工處理發(fā)生在CPAF合成并活化之后,監(jiān)測CPAF的表達(dá)可發(fā)現(xiàn)在檢測到加工后的OmcBc之前檢測到了活性CPAF,表明CPAF處理OmcB的可能性。并且CPAF在經(jīng)CPAF特異性抗體消耗之后以及被一種CPAF特異性抗體抑制肽處理之后,OmcB的處理也得到抑制。在該研究中Hou等還監(jiān)測了宿主細(xì)胞的完整性以及感染時(shí)間過程,未發(fā)現(xiàn)明顯的細(xì)胞膜通透性變化,這表明OmcB加工確實(shí)發(fā)生在活細(xì)胞中,而非細(xì)胞死亡。Chen等[27]發(fā)現(xiàn)CPAF可能通過外膜囊泡(OMV)出芽機(jī)制分泌出CT并進(jìn)入宿主細(xì)胞。而OmcBc也被證明可以釋放到宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。因此,OmcBc有可能通過與CPAF共同包裝到OMV中并進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮作用。

3.2 OmcB介導(dǎo)CT對宿主細(xì)胞的黏附

OmcB可以作為CT侵入宿主細(xì)胞的黏附素。在OmcB蛋白的N-端結(jié)構(gòu)域中至少存在著一個(gè)XBBXBX序列(B代表一種堿性氨基酸),此序列以及N-端碎片所對應(yīng)的的合成肽,被證實(shí)可與肝素相結(jié)合來阻斷某些沙眼衣原體血清型的感染性[28-29]。在宿主細(xì)胞膜上存在著硫酸乙酰肝素蛋白多糖(heparan sulfate proteoglycan, HSPG),屬于粘多糖(glycosaminoglycan,GAG)家族中的一員,現(xiàn)已被證實(shí)可與CT細(xì)胞外基質(zhì)蛋白結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞黏附和遷移,是衣原體感染的必要條件[30]。Fadel等[8]研究發(fā)現(xiàn)血清型LGV1的重組OmcB蛋白與GAGs缺陷型宿主細(xì)胞的結(jié)合大大減少,表明OmcB可以與宿主細(xì)胞膜上的GAGs受體特異性結(jié)合從而增強(qiáng)衣原體對宿主細(xì)胞的黏附。

Fadel等[31]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),不同于血清型LGV1,在血清型E中,OmcB蛋白雖然也存在黏附性,但其與宿主細(xì)胞的結(jié)合并不依賴于GAGs。感染性抑制實(shí)驗(yàn)顯示在保持同樣存在肝素這一相同條件下,只有表達(dá)了血清型LGV1的OmcB的大腸桿菌的黏附性被顯著抑制(68%),血清型LGV1的重組OmcB與GAGs缺陷型細(xì)胞的結(jié)合顯著減少,而對于同一缺陷細(xì)胞,來自血清型E的重組OmcB的結(jié)合數(shù)量與野生型細(xì)胞相當(dāng)。

衣原體OmcB與宿主細(xì)胞的黏附是否依賴于GAGs取決于OmcB C端的3個(gè)可變氨基酸(第66、68、71位氨基酸)到保守的XBBXBX肝素結(jié)合結(jié)構(gòu)域[12],其中,第66位氨基酸是決定其依賴性的最主要因素,當(dāng)血清型E的OmcB蛋白的第66位亮氨酸被血清型LGV的OmcB中相應(yīng)位置的脯氨酸所取代后,由肝素非依賴轉(zhuǎn)變成了肝素依賴。相對應(yīng)地,當(dāng)血清型LGV的OmcB蛋白的第66位脯氨酸被亮氨酸取代后,其肝素依賴性也同樣發(fā)生了改變。

3.3 OmcB維持EBs細(xì)胞壁剛性和滲透穩(wěn)定性

EBs的細(xì)胞壁成分又被稱為衣原體外膜復(fù)合物(Chlamydia outer membrane complex, COMC)[32],它不溶于肌氨酸,除了含有主要外膜蛋白(MOMP)、富含半胱氨酸蛋白(Cysteine rich proteins, Crp)、多形態(tài)膜蛋白(polymorphic membrane proteins, Pmps)外,還具有一種剛性外膜,這種膜結(jié)構(gòu)由二硫化物交聯(lián)的富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)網(wǎng)構(gòu)成,即OmcB,有助于提高EBs對于外界環(huán)境壓力的抵抗力。Newhall等[33]表明OmcB可能參與RBs到EBs的轉(zhuǎn)化過程并且在維持EBs的細(xì)胞壁剛性和滲透穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用,其研究數(shù)據(jù)表明,在衣原體感染Hela細(xì)胞30 h后,細(xì)胞內(nèi)RBs轉(zhuǎn)化為EBs時(shí),才檢測到了OmcB蛋白的合成,這表明衣原體外膜蛋白的合成時(shí)間和程度受到調(diào)控,且這種調(diào)控在時(shí)間上與RBs到EBs的分化過程相吻合。此外,該項(xiàng)研究還顯示在外膜蛋白的生長周期內(nèi),OmcB蛋白的二硫鍵在大部分時(shí)間中廣泛交聯(lián)。

4 結(jié)語與展望

OmcB蛋白是衣原體中含量僅次于MOMP的外膜蛋白,其獨(dú)特結(jié)構(gòu)可以幫助維持衣原體EBs的細(xì)胞壁剛性及滲透穩(wěn)定性。在介導(dǎo)CT對宿主細(xì)胞的黏附與入侵過程中,OmcB蛋白發(fā)揮了重要作用,其與宿主細(xì)胞膜上的GAGs受體特異性結(jié)合從而增強(qiáng)衣原體對宿主細(xì)胞的黏附。同時(shí)對OmcB的研究也幫助我們對于衣原體致病機(jī)制的理解方面有所加深。多項(xiàng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果已證實(shí)OmcB是一種免疫優(yōu)勢抗原,不管是在動(dòng)物還是在人類CT感染中都可介導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。但OmcB作為一類免疫優(yōu)勢蛋白,其與宿主細(xì)胞的相互作用機(jī)制尚未完全明了,其在衣原體感染的早期檢測以及有效疫苗研制方面存在著可期的研究空間與前景,值得進(jìn)一步研究。