方柔柔，楊啟帆，韓若冰，鄔東東，孫娜，李娟，徐守竹，趙晶

作者單位：1.712046 陜西省咸陽(yáng)市，陜西中醫(yī)藥大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 2.712046 陜西省咸陽(yáng)市，陜西中醫(yī)藥大學(xué)陜西省針?biāo)幗Y(jié)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種危害人類健康的慢性心血管疾病，每年約有2 000萬(wàn)人死于AS引起的疾病，且AS發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)［1］。AS的主要病變是動(dòng)脈壁存在脂質(zhì)沉積并伴隨平滑肌細(xì)胞增殖和纖維基質(zhì)增生，逐漸形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊［2］，從而引起冠狀動(dòng)脈狹窄和易損斑塊形成，進(jìn)而導(dǎo)致心血管事件風(fēng)險(xiǎn)增加［3］。在AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在各種形式的細(xì)胞死亡，其中鐵死亡與多種細(xì)胞病理過(guò)程相關(guān)［4］。鐵死亡是一種新型非凋亡形式的調(diào)控性細(xì)胞死亡，其主要機(jī)制是氧化應(yīng)激狀態(tài)下鐵代謝紊亂導(dǎo)致多種抗氧化系統(tǒng)異常，從而誘導(dǎo)脂質(zhì)過(guò)氧化物在細(xì)胞內(nèi)積聚［5］。研究顯示，鐵死亡在腫瘤、肝臟疾病、神經(jīng)退行性疾病、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病、心血管系統(tǒng)疾病中均是重要的治療靶點(diǎn)［6-10］。因此，在AS發(fā)病率不斷上升的背景下，研究AS中鐵死亡的機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)具有重要意義。

加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（weighted gene coexpression network analysis，WGCNA）是一種將基因數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為共表達(dá)模塊，從而探索基因與給定特征之間相關(guān)性的生物信息學(xué)方法。近年來(lái)，WGCNA已被廣泛應(yīng)用于鑒定各種疾病的生物標(biāo)志物，并展現(xiàn)出良好的潛力［11-12］。本研究基于WGCNA篩選AS中鐵死亡核心基因，并分析其與免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的關(guān)系，以期為揭示AS與鐵死亡之間的關(guān)系提供數(shù)據(jù)支撐，為探索新的AS治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

從基因表達(dá)綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下載AS轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集GSE100927。該數(shù)據(jù)集是基于GPL17077平臺(tái)（Agilent-039494 SurePrint G3 Human GE v2 8x60K Microarray 039381）的轉(zhuǎn)錄測(cè)序數(shù)據(jù)，共有104個(gè)樣本。篩選出頸動(dòng)脈樣本41個(gè)，包含12個(gè)健康對(duì)照者的頸動(dòng)脈樣本（對(duì)照組）和29個(gè)AS患者的頸動(dòng)脈樣本（AS組）。從FerrDb數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.zhounan.org/ferrdb/legacy/index.html）下載鐵死亡相關(guān)基因（ferroptosis related genes，F(xiàn)RG），去除重復(fù)基因后，最終納入564個(gè)FRG。

1.2 研究方法

1.2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理

利用R軟件（版本4.2.3）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，包括消除背景、標(biāo)準(zhǔn)化處理數(shù)據(jù)、構(gòu)建表達(dá)矩陣等，同時(shí)去除缺失、重復(fù)及低表達(dá)的基因探針。

1.2.2 差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEG）的篩選

使用R軟件的limma包對(duì)GSE100927的41個(gè)頸動(dòng)脈樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，主要篩選DEG，篩選標(biāo)準(zhǔn)為校正后P＜0.05和|log2FC|＞1。使用ggplot2包繪制火山圖。

1.2.3 基因本體論（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

使用R軟件clusterProfiler包和org Hs.eg.db包對(duì)篩選出的DEG進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，以P＜0.05為截?cái)鄻?biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 WGCNA

采用R包WGCNA對(duì)GSE100927的41個(gè)頸動(dòng)脈樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，以獲得與AS相關(guān)的基因模塊。使用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治龃_定軟閾值，并依據(jù)軟閾值進(jìn)一步計(jì)算拓?fù)渲丿B矩陣（topological overlap matrix，TOM），識(shí)別不同基因模塊，計(jì)算每個(gè)基因模塊與AS的相關(guān)系數(shù)及P值，篩選出與AS相關(guān)性最高的基因模塊。取DEG、WGCNA中與AS相關(guān)性最高的基因模塊和FRG的交集基因，并繪制其韋恩圖。

1.2.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction networks，PPI）分析、核心基因的確定

通過(guò)在線String數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/cgi/input.pl）構(gòu)建交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，設(shè)置最低互動(dòng)分?jǐn)?shù)為0.15，去除沒(méi)有交互作用的基因后，通過(guò)Cytoscape軟件（3.8.2版本）對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化分析，利用cytoHubba插件的Degree算法計(jì)算出該網(wǎng)絡(luò)中每個(gè)節(jié)點(diǎn)的Degree值，取Degree值排名前5的基因作為核心基因。

1.2.6 核心基因表達(dá)水平及驗(yàn)證

比較GSE100927中對(duì)照組和AS組核心基因表達(dá)水平。使用R軟件中g(shù)gplot2包分析數(shù)據(jù)集GSE20129〔包括79個(gè)健康對(duì)照者的外周血樣本（對(duì)照組）和56個(gè)AS患者的外周血樣本（AS組）〕和GSE226790〔包括3個(gè)健康對(duì)照者的動(dòng)脈樣本（對(duì)照組）和3個(gè)AS患者的血管樣本（AS組）〕中核心基因表達(dá)水平。

1.2.7 單樣本基因集富集分析（single sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）

從分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)（Molecular Signature Database，MSigDB）中下載“c2.cp.kegg.symbols.gmt”的注釋基因集，進(jìn)行ssGSEA，以進(jìn)一步探究核心基因在AS進(jìn)程中的調(diào)控作用。

1.2.8 免疫浸潤(rùn)分析

從CIBERSORT網(wǎng)站（http://cibersort.stanford.edu/）獲取LM22文件，采用CIBERSORT算法估計(jì)22種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞（初始CD4T淋巴細(xì)胞、靜息CD4記憶T淋巴細(xì)胞、活化CD4記憶T淋巴細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、活化肥大細(xì)胞、靜息樹突狀細(xì)胞、活化樹突狀細(xì)胞、靜息自然殺傷細(xì)胞、活化自然殺傷細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD8T淋巴細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞、濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞、γ-δT細(xì)胞、初始B細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞）表達(dá)水平。應(yīng)用ggcorrplot包分析核心基因表達(dá)水平與免疫浸潤(rùn)細(xì)胞表達(dá)水平的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用R軟件（版本4.2.3）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)量資料不符合正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEG篩選結(jié)果

共篩選出了508個(gè)DEG，其中上調(diào)DEG 308個(gè)、下調(diào)DEG 200個(gè)，見(jiàn)圖1。

圖1 DEG分析的火山圖Figure 1 Volcano map of DEG analysis

2.2 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結(jié)果

GO功能富集分析結(jié)果顯示，DEG主要涉及的生物過(guò)程為參與細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞活化的正調(diào)控、白細(xì)胞介導(dǎo)免疫、外部刺激反應(yīng)的正調(diào)節(jié)、骨髓白細(xì)胞活化、白細(xì)胞遷移、吞噬作用、參與免疫反應(yīng)的白細(xì)胞活化、參與免疫反應(yīng)的髓系細(xì)胞活化、吞噬作用的調(diào)節(jié)，主要涉及的細(xì)胞組分為分泌顆粒膜、含膠原蛋白的細(xì)胞外間質(zhì)、內(nèi)吞囊泡、膜筏、膜微區(qū)、分泌顆粒腔、三級(jí)顆粒、特定顆粒、三級(jí)顆粒膜、特定顆粒膜，主要涉及的分子功能為磷脂結(jié)合、酰胺結(jié)合、肽結(jié)合、整合素結(jié)合、β-淀粉樣蛋白結(jié)合、細(xì)胞因子結(jié)合、貨物受體活性、磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸結(jié)合、肌肉結(jié)構(gòu)成分、Toll樣受體結(jié)合。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，DEG主要涉及黑熱病、破骨細(xì)胞分化、吞噬體、肺結(jié)核、血脂與動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀病毒、造血細(xì)胞系、細(xì)胞黏附分子、EB病毒感染、Rap1信號(hào)通路、金黃色葡萄球菌感染、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、溶酶體、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、Fc epsilon RI信號(hào)通路、百日咳、炎癥性腸病、抗原處理和提呈、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)、瘧疾、軍團(tuán)菌病、病毒性心肌炎、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferatorsactivated receptors，PPAR）信號(hào)通路、膽固醇代謝、哮喘、移植物抗宿主疾病、1型糖尿病等信號(hào)通路。

2.3 WGCNA結(jié)果

網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果顯示，軟閾值為2，見(jiàn)圖2。共識(shí)別到5個(gè)基因模塊，其中綠松石色基因模塊與AS相關(guān)性最強(qiáng)（r=-0.96，P＜0.001），見(jiàn)圖3，該基因模塊共包含15 087個(gè)基因。將綠松石色基因模塊中的基因、FRG、DEG取交集，共得到17個(gè)交集基因，分別為ZEB1、ABCC5、CAPG、LGMN、CTSB、YAP1、PTPN6、BID、PLIN4、FTL、CDKN2A、PLIN2、HMOX1、IL1B、HAMP、ALOX5、DPP4，見(jiàn)圖4。

圖2 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鼋Y(jié)果Figure 2 Network topology analysis results

圖3 5個(gè)基因模塊與AS的相關(guān)性Figure 3 Correlation between 5 gene modules and AS

圖4 交集基因的韋恩圖Figure 4 Venn diagram of intersecting genes

2.4 PPI分析和核心基因的確定

PPI分析結(jié)果顯示，構(gòu)建出1個(gè)含有17個(gè)節(jié)點(diǎn)、60條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖5；核心基因分別為IL1B、CTSB、HMOX1、CDKN2A、ALOX5。

圖5 交集基因的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Figure 5 PPI network diagram of intersecting genes

2.5 核心基因驗(yàn)證

在GSE100927中，AS組IL1B、CTSB、HMOX1、CDKN2A、ALOX5表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在GSE20129中，AS組IL1B、HMOX1表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在GSE20129中，對(duì)照組與AS組CDKN2A、ALOX5表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在GSE226790中，對(duì)照組與AS組CTSB表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 不同數(shù)據(jù)集中對(duì)照組與AS組核心基因表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison of core genes expression levels between control group and AS group in different datasets

表1 不同數(shù)據(jù)集中對(duì)照組與AS組核心基因表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison of core genes expression levels between control group and AS group in different datasets

注：AS=動(dòng)脈粥樣硬化。

組別GSE100927GSE20129GSE226790樣本量IL1BCTSBHMOX1CDKN2AALOX5樣本量IL1BHMOX1CDKN2AALOX5樣本量CTSB對(duì)照組126.10±0.98 8.83±0.67 8.43±1.00 6.17±0.51 7.77±1.02799.16±0.18 7.85±0.34 6.70±0.10 6.59±0.0935.87±1.03 AS組298.16±0.37 10.52±0.28 10.51±0.71 7.56±0.24 9.44±0.20569.50±0.29 8.30±0.19 6.73±0.10 6.64±0.0936.07±0.90 t值9.8711.467.5411.818.562.793.200.581.110.25 P值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.0010.0150.0060.5740.2870.817

2.6 ssGSEA結(jié)果

ssGSEA結(jié)果顯示，IL1B、CTSB、HMOX1、CDKN2A、ALOX5主要涉及鐵死亡、脂肪消化吸收、核酸結(jié)合寡聚結(jié)構(gòu)域（nucleotide-binding oligomerization domain，NOD）樣受體信號(hào)通路、組氨酸代謝、卟啉代謝、Th1和Th2細(xì)胞分化、TGF-β信號(hào)通路、FC epsilon RI信號(hào)通路等機(jī)制。

2.7 免疫浸潤(rùn)分析結(jié)果

對(duì)照組和AS組初始CD4T淋巴細(xì)胞、靜息樹突狀細(xì)胞、活化自然殺傷細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、初始B細(xì)胞表達(dá)水平均為0。AS組靜息肥大細(xì)胞、靜息自然殺傷細(xì)胞表達(dá)水平為0。AS組靜息CD4記憶T淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞表達(dá)水平低于對(duì)照組，活化肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞、記憶B細(xì)胞表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照組和AS組22種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of expression levels of 22 types of immune infiltrating cells between the control group and the AS group

表2 對(duì)照組和AS組22種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of expression levels of 22 types of immune infiltrating cells between the control group and the AS group

注：a表示U值；-表示無(wú)此項(xiàng)數(shù)據(jù)。

細(xì)胞對(duì)照組（n=12）AS組（n=29）t（U）值P值靜息CD4記憶T淋巴細(xì)胞（images/BZ_14_2062_2150_2079_2187.png±s）0.148±0.0360.074±0.0305.197＜0.001活化CD4記憶T淋巴細(xì)胞（images/BZ_14_2062_2150_2079_2187.png±s）0.073±0.0530.042±0.0301.9690.058靜息肥大細(xì)胞〔M（P25，P75）〕0.010（0，0.028）0——活化肥大細(xì)胞〔M（P25，P75）〕0.002（0，0.042）0.118（0.077，0.137）25.00a0.005活化樹突狀細(xì)胞〔M（P25，P75）〕0（0，0.078）0.011（0，0.030）82.00a0.828靜息自然殺傷細(xì)胞〔M（P25，P75）〕0.008（0.002，0.036）0——中性粒細(xì)胞（images/BZ_14_2062_2150_2079_2187.png±s）0.083±0.0500.067±0.0310.9920.328單核細(xì)胞〔M（P25，P75）〕0.007（0，0.022）0.091（0.028，0.102）23.50a0.003漿細(xì)胞（images/BZ_14_2062_2150_2079_2187.png±s）0.011±0.0020.004±0.0033.7200.001 CD8 T淋巴細(xì)胞〔M（P25，P75）〕0.003（0，0.041）0.009（0，0.023）77.00a0.667調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞〔M（P25，P75）〕0（0，0.003）0（0，0.009）70.50a0.431濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞〔M（P25，P75）〕0.009（0，0.030）0.031（0.020，0.045）37.00a0.027 γ-δT細(xì)胞（images/BZ_14_2062_2150_2079_2187.png±s）0.076±0.0380.074±0.0250.1420.888記憶B細(xì)胞（images/BZ_14_2062_2150_2079_2187.png±s）0.020±0.0080.033±0.0132.5450.016 M0型巨噬細(xì)胞（images/BZ_14_2062_2150_2079_2187.png±s）0.273±0.0420.302±0.0750.9160.366 M1型巨噬細(xì)胞〔M（P25，P75）〕0.024（0，0.037）0.007（0，0.016）52.00a0.126 M2型巨噬細(xì)胞（images/BZ_14_2062_2150_2079_2187.png±s）0.173±0.0880.134±0.0341.8490.073

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，IL1B表達(dá)水平與活化肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表達(dá)水平呈正相關(guān)，與濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；CTSB、HMOX1表達(dá)水平與22種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞表達(dá)水平均無(wú)直線相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）；CDKN2A表達(dá)水平與中性粒細(xì)胞表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；ALOX5表達(dá)水平與活化CD4記憶T淋巴細(xì)胞、活化樹突狀細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與活化肥大細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)水平呈正相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 核心基因表達(dá)水平與22種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞表達(dá)水平的相關(guān)性（r值）Table 3 Correlation between the expression level of core genes and the expression levels of 22 types of immune infiltrating cells

3 討論

自從DIXON等［13］在2012年首次提出鐵死亡概念以來(lái)，鐵死亡與各種疾病之間的關(guān)系被廣泛研究［14-15］。研究表明，鐵死亡在心血管疾病中起關(guān)鍵作用，包括AS［16］、心肌梗死［17］和心力衰竭［18］等。但哪些FRG與AS有關(guān)，目前尚不清楚。本研究旨在基于WGCNA篩選AS中鐵死亡核心基因，并分析其與免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的關(guān)系。

本研究通過(guò)cytoHubba插件的Degree算法篩選出了5個(gè)AS中鐵死亡核心基因，分別為IL1B、CTSB、HMOX1、CDKN2A、ALOX5。進(jìn)一步驗(yàn)證核心基因，結(jié)果顯示，在GSE100927中，AS組IL1B、CTSB、HMOX1、CDKN2A、ALOX5表達(dá)水平高于對(duì)照組；在GSE20129中，AS組IL1B、HMOX1表達(dá)水平高于對(duì)照組；在GSE20129中，對(duì)照組與AS組CDKN2A、ALOX5表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在GSE226790中，對(duì)照組與AS組CTSB表達(dá)水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；分析原因，可能與所用的數(shù)據(jù)集樣本量較小、樣本來(lái)源不同以及樣本間存在差異等多種因素有關(guān)。本研究ssGSEA結(jié)果顯示，IL1B、CTSB、HMOX1、CDKN2A、ALOX5主要涉及鐵死亡、脂肪消化吸收等作用，說(shuō)明核心基因通過(guò)多因素、多機(jī)制共同參與AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。研究顯示，白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）由單核細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和腦內(nèi)皮細(xì)胞釋放［19］，其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞以及血管平滑肌細(xì)胞均有促進(jìn)作用，可促進(jìn)AS的發(fā)生。IL-1β還可通過(guò)刺激冠狀動(dòng)脈壁內(nèi)皮細(xì)胞而產(chǎn)生細(xì)胞間黏附分子和血管黏附分子，從而促進(jìn)單核細(xì)胞趨化蛋白的合成，進(jìn)而導(dǎo)致單核細(xì)胞的聚集，進(jìn)一步推動(dòng)AS的進(jìn)展［20］。而鐵死亡可通過(guò)抑制GPX4和SIRT1的表達(dá)來(lái)增加IL1B的表達(dá)，進(jìn)而激活炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生大量活性氧，最終導(dǎo)致AS的發(fā)生［21］。CTSB是一種廣泛表達(dá)于溶酶體上的半胱氨酸肽鏈內(nèi)切酶，在自噬、抗原提呈、細(xì)胞應(yīng)激、新陳代謝和溶酶體依賴性細(xì)胞死亡等方面發(fā)揮著不可或缺的作用［22］，其可通過(guò)加重炎癥反應(yīng)和降解含彈性蛋白的動(dòng)脈細(xì)胞外基質(zhì)而參與動(dòng)脈的變性、鈣化和硬化［23］。研究顯示，在冠狀動(dòng)脈病變組織中，與自噬相關(guān)的CTSB的表達(dá)明顯上調(diào)［24］；CTSB在人頸動(dòng)脈斑塊中也呈高表達(dá)，并與斑塊嚴(yán)重程度相關(guān)［25］。此外，血糖升高和肥胖是公認(rèn)的AS的危險(xiǎn)因素，而CTSB在肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪性肝病和癌癥等腸道血管生成和膽固醇吸收中起關(guān)鍵作用［26］。HMOX1是血紅素降解過(guò)程的限速酶，可控制一氧化碳、Fe2+和膽綠素的生成，其與AS的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可抑制各種炎癥因子導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而抑制AS形成，并可促進(jìn)晚期斑塊的穩(wěn)定［27］。CDKN2A可參與細(xì)胞增殖、凋亡及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期［28］。p16INK4a、p14ARF和p15INK4b為CDKN2A/B基因位點(diǎn)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，在AS病變中，CD68陽(yáng)性巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞可分泌這些蛋白質(zhì)產(chǎn)物，而其均可參與AS的形成［29］。ALOX5是一種含鐵的非血紅素雙加氧酶，可激活炎癥反應(yīng)并觸發(fā)各種細(xì)胞死亡模式［30-31］。已有研究證實(shí)，ALOX5是引發(fā)癌癥［32］或神經(jīng)元損傷［33］中鐵死亡的關(guān)鍵酶。但尚未見(jiàn)有直接證據(jù)表明ALOX5可介導(dǎo)AS斑塊中的鐵死亡，這仍需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

免疫浸潤(rùn)細(xì)胞在AS中持續(xù)活化和分化，這對(duì)細(xì)胞間抗原免疫提呈和細(xì)胞信號(hào)通路的激活具有重要作用［34］，因而了解免疫微環(huán)境特征有利于認(rèn)識(shí)AS斑塊生物學(xué)過(guò)程。本研究免疫浸潤(rùn)分析結(jié)果顯示，AS組靜息CD4記憶T淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞表達(dá)水平低于對(duì)照組，活化肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞、濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞、記憶B細(xì)胞表達(dá)水平高于對(duì)照組，提示AS患者免疫微環(huán)境發(fā)生了改變。研究表明，IL1B可導(dǎo)致AS患者體內(nèi)中性粒細(xì)胞明顯增加［35］，并促進(jìn)濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞的分化［36］；CDKN2A可阻止中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）的產(chǎn)生，從而減緩AS的發(fā)生發(fā)展［37-38］；ALOX5可通過(guò)促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生而參與AS斑塊的形成［39-40］，還可通過(guò)抑制M2型巨噬細(xì)胞的生成而發(fā)揮抗炎作用，從而減緩AS的病程進(jìn)展［40-41］。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，IL1B表達(dá)水平與活化肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞表達(dá)水平呈正相關(guān)，與濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞、記憶B細(xì)胞、M0型巨噬細(xì)胞表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)；CTSB、HMOX1表達(dá)水平與22種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞表達(dá)水平均無(wú)直線相關(guān)關(guān)系；CDKN2A表達(dá)水平與中性粒細(xì)胞表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)；ALOX5表達(dá)水平與活化CD4記憶T淋巴細(xì)胞、活化樹突狀細(xì)胞、M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與活化肥大細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞、M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)水平呈正相關(guān)；與既往研究結(jié)果［42-43］存在差異，可能與樣本量較小有關(guān)，后續(xù)仍需進(jìn)行更全面的數(shù)據(jù)分析及驗(yàn)證。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究基于WGCNA共篩選出5個(gè)AS中鐵死亡相關(guān)核心基因，分別為IL1B、CTSB、HMOX1、CDKN2A、ALOX5，其中IL1B、CDKN2A、ALOX5表達(dá)水平與部分免疫浸潤(rùn)細(xì)胞表達(dá)水平有直線相關(guān)關(guān)系，而CTSB、HMOX1表達(dá)水平與22種免疫浸潤(rùn)細(xì)胞表達(dá)水平均無(wú)直線相關(guān)關(guān)系。但本研究未能納入AS患者的一些臨床特點(diǎn)進(jìn)行綜合分析，如年齡、性別和飲食習(xí)慣等，且未通過(guò)蛋白表達(dá)的檢測(cè)來(lái)驗(yàn)證核心基因的翻譯水平。

作者貢獻(xiàn)：方柔柔、趙晶提出主要研究目標(biāo)，負(fù)責(zé)研究的構(gòu)思與設(shè)計(jì)；方柔柔進(jìn)行研究的實(shí)施，撰寫及修訂論文；方柔柔、楊啟帆、韓若冰、孫娜進(jìn)行數(shù)據(jù)的收集與整理，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，圖、表的繪制與展示；方柔柔、鄔東東、李娟、徐守竹進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋；趙晶負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制與審查，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無(wú)利益沖突。