羅 倩 陳 琳 丁 錦

據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)每年新發(fā)宮頸癌病例占全世界的20%[1］。研究顯示，宮頸癌是女性惡性腫瘤中常見(jiàn)類(lèi)型，在中國(guó)每年新增子宮頸癌病例約14 萬(wàn)，死亡病例約3.7 萬(wàn)[2-4］。人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）本質(zhì)是一群無(wú)包膜的雙鏈DNA 病毒，主要通過(guò)性生活傳播[5］，就目前已知基因型別有200 多種[6］。在某個(gè)致病因素下，HPV 的DNA 可以整合到宿主細(xì)胞的DNA 上，從而影響細(xì)胞的基因調(diào)控，遂即可能導(dǎo)致宮頸發(fā)生病變甚至癌變[7-8］，且按照致癌潛能，可將HPV 主要分為高危型和低危型[9］。在不同條件下，HPV 基因型別的感染率有差異，與不同的影響因素密切相關(guān)，如環(huán)境因素、社會(huì)因素及個(gè)人因素等[10］。本研究主要通過(guò)對(duì)2022 年合肥市某地區(qū)不同年齡段的常規(guī)體檢女性HPV 感染結(jié)果進(jìn)行綜合分析，為該地區(qū)女性HPV疫苗接種的選擇提供相關(guān)建議，同時(shí)也為我國(guó)產(chǎn)HPV疫苗繼續(xù)研發(fā)提供理論參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2022 年1～12 月中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院南區(qū)健康管理中心常規(guī)體檢要求篩查宮頸HPV 的女性4 663 例。年齡24～72 歲，平均（43±11）歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：月經(jīng)期、該時(shí)間段因已知陽(yáng)性再次復(fù)查仍為陽(yáng)性的體檢人員。納入標(biāo)準(zhǔn)：要求初次在本中心體檢人員且已有性生活史、無(wú)宮頸疫苗接種史、無(wú)盆腔化療放療史、無(wú)婦科手術(shù)史、近1 周無(wú)陰道用藥史、近3 d 無(wú)同房、無(wú)流產(chǎn)史、無(wú)婦科疾病史、無(wú)妊娠哺乳期、近3 個(gè)月無(wú)激素用藥史、無(wú)自身免疫性疾病史。按照年齡分為5 組（24 歲～、31 歲～、41 歲～、51歲～和61～72 歲組），本研究已通過(guò)中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（倫理號(hào)：2023-RE-142）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集與保存 由婦科醫(yī)師進(jìn)行樣本采集，用無(wú)菌擴(kuò)陰器（揚(yáng)州美林醫(yī)療器械有限公司）暴露宮頸，用棉拭子擦拭過(guò)多的分泌物，宮頸刷在宮頸口轉(zhuǎn)動(dòng)3～5 周采集足量的宮頸脫落細(xì)胞，然后迅速放進(jìn)樣本管（安徽同科生物科技有限公司）中，密閉送檢。樣本應(yīng)立即檢測(cè)，如果樣本不能立即檢測(cè)，在2～8℃條件下保存不應(yīng)超過(guò)1 d，或在（-20±5）℃條件下保存不應(yīng)超過(guò)28 d。-70℃可長(zhǎng)期保存（24 個(gè)月），盡量避免反復(fù)凍融樣本（凍融次數(shù)不超過(guò)10 次）。采用泡沫箱加冰袋密封進(jìn)行運(yùn)輸（運(yùn)輸時(shí)間不超過(guò)5 d）。

1.2.2 檢驗(yàn)原理 基于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈（polymerase chain reaction， PCR）技術(shù)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR儀，在4 種PCR 反應(yīng)混合液中分別采用4 種熒光通道檢測(cè)HPV 基因。該檢測(cè)體系含有尿嘧啶糖基化酶和脫氧尿嘧啶防污染措施，用來(lái)排除假陽(yáng)性結(jié)果。以人β-珠蛋白（HBB）作為內(nèi)參對(duì)樣本的采集、脫氧核糖核酸（DNA）的提取及PCR 抑制因素進(jìn)行監(jiān)控。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟 首先，通過(guò)檢驗(yàn)科醫(yī)師先取出試劑盒中各組分，室溫解凍，待其溫度達(dá)室溫后混勻備用，根據(jù)待測(cè)樣本數(shù)、陰性對(duì)照數(shù)量和陽(yáng)性對(duì)照數(shù)量，按比例（每反應(yīng)PCR 反應(yīng)液43.5 μL+酶混合液1.5 μL）取相應(yīng)量的PCR 反應(yīng)液和酶混合液，分別充分振蕩混勻制備成HPV16/58/35/HBB-PCR 反應(yīng)混合液、HPV18/33/51/66-PCR 反應(yīng)混合液、HPV45/59/39/56-PCR 反應(yīng)混合液和HPV31/52/68/53-PCR 反應(yīng)混合液，在離心機(jī)中低速離心30 s，每反應(yīng)分別按照PCR 反應(yīng)液43.5 μL+酶混合液1.5 μL 分裝至熒光PCR 反應(yīng)管中，2～8℃保存?zhèn)溆谩Ｆ浯?，將懸浮于?xì)胞保存液中的樣本振蕩混勻后，取1 mL 細(xì)胞保存液于1.5 mL 離心管中，12 000 r/min 離心5 min，棄上清（如有明顯溶血，可用生理鹽水漂洗數(shù)次，直至無(wú)明顯溶血）。加入100 μL DNA 提取液，充分混勻，100℃孵育10 min。12 000 r/min 離心2 min，2～8℃保存?zhèn)溆?。取?yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照各20 μL 至1.5 mL 離心管，分別加入100 μL DNA 提取液，充分混勻，100℃孵育10 min，12 000 r/min離心2 min，2～8℃保存?zhèn)溆?。再次，取處理過(guò)的待檢樣本、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照各5 μL，分別加到4 種PCR反應(yīng)混合液的PCR 反應(yīng)管中，蓋上管蓋（如有氣泡，可用手指彈擊，去除氣泡），在離心機(jī)中低速離心30 s 至管壁無(wú)明顯液珠。最后，將PCR 反應(yīng)管放入PCR 擴(kuò)增儀樣品槽，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置待檢樣本、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照。TK6000 選擇FAM 通道、JOE 通道、ROX 通道、CY5 通道。設(shè)置Reaction Volume 為50。擴(kuò)增條件為50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min（收集熒光），循環(huán)45 次；38℃ 5 s 終止，反應(yīng)結(jié)束后記錄和保存結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料用±s表示；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和/或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，同時(shí)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Cochran-Armitage 線性趨勢(shì)χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV 感染率 4 663 例篩查宮頸HPV 的女性中，實(shí)際HPV 陽(yáng)性人數(shù)為393 例，HPV 陽(yáng)性人數(shù)感染率為8.43%（393/4 663）。各年齡段之間，HPV 陽(yáng)性人數(shù)感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=13.070，P=0.011），HPV 的3 種感染模式感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=27.731，P＜0.001）。Cochran-Armitage 趨勢(shì)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Z=-2.726，P=0.006。見(jiàn)表1、2。

表1 各年齡組HPV感染率分布情況

表2 各年齡組HPV的3種感染模式[例（%)]

2.2 HPV 多重感染 多重感染總?cè)藬?shù)為69 例，在多重感染中，二重感染率13.23%（52/393）及檢出率1.12%（52/4 663）最高。多重感染率在61～72 歲組最高3.16%（6/190）。各年齡段之間，多重感染率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.474，P=0.482）。見(jiàn)表3、4。

表3 HPV多重感染檢出情況

表4 各年齡組多重感染率分布情況

2.3 HPV 亞型感染排位 HPV 感染情況檢出率排名前3 的為52 型（1.91%，89/4 663）、53 型（1.24%，58/4 663）及16 型（0.94%，44/4 663），即是所謂的優(yōu)勢(shì)亞型。在各個(gè)年齡組，排名前3 的一重感染型別和多重感染型別皆有差別，均以52 型為主，而24 歲～組則增加了58 和59 型，61～72 歲組增加了53、56 型；即使同一個(gè)年齡組，排名前3 的一重感染型別和多重感染型別也略有差別，包括少見(jiàn)的51 型和66 型。見(jiàn)表5。

表5 各年齡組HPV優(yōu)勢(shì)亞型分布情況

3 討論

眾所周知，HPV 基因型別分布受多種因素影響，因此進(jìn)行不同地區(qū)的HPV 感染率以及感染常見(jiàn)亞型的分析，對(duì)HPV 的流行病學(xué)及疫苗接種有重要意義，由于缺乏抗HPV 病毒的特異性藥物，HPV 感染更多需要接種疫苗來(lái)預(yù)防[11］。

本研究中，HPV 感染率首先是61～72 歲組中最高，其次是51 歲～組，再次24 歲～組，可看出數(shù)據(jù)的分布存在首尾2 個(gè)高峰，與袁建暉等[12］研究結(jié)果基本符合。分析61～72 歲組及51 歲～組感染率高的主要原因是HPV感染有隱匿性特點(diǎn)，與其絕經(jīng)后激素水平、陰道內(nèi)環(huán)境、機(jī)體免疫力、潛伏病毒再激活或病毒持續(xù)感染等相關(guān)，應(yīng)重視此類(lèi)人群的篩查，做好預(yù)防工作[13］。分析24 歲～組感染率較高的主要原因是性生活較多，增加感染的概率。本研究最小年齡為24 歲，雖缺乏小于24 歲的研究數(shù)據(jù)，但對(duì)低年齡段的女性保護(hù)也要引起重視。此外，各個(gè)年齡段中，HPV 感染率是有差異的，感染的模式也存在差異，可見(jiàn)年齡是一重要影響因素，Cochran-Armitage 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著年齡的增加，HPV 感染有上升趨勢(shì)，考慮與高年齡段可能缺少疫苗的保護(hù)有關(guān)，因此，應(yīng)盡可能降低高年齡段的感染率。

本研究HPV 多重感染中主要為二重感染，其次為三重感染，最少的為四重感染。由此能看出隨著感染型別增加，感染人數(shù)逐漸減少，四重感染有3 人，其年齡分別為35 歲、44 歲和58 歲，多重HPV 感染率在61～72 歲組中最高，但是多重感染在各個(gè)年齡之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與茅書(shū)為等[14］研究結(jié)果基本符合，因此對(duì)于HPV 多重感染要積極治療。

本研究HPV 感染率第一位的亞型為52、53 和16。與Zhang 等[15］研究結(jié)果基本符合。在多重感染中，HPV 16 以混合感染方式出現(xiàn)，伴有HPV 53 和HPV 51。由此看出，HPV 52 是合肥地區(qū)重點(diǎn)防治的亞型，可針對(duì)性選用含有52 型的預(yù)防性HPV 疫苗，且主要以單一感染為主。李見(jiàn)等[16］調(diào)查徐州地區(qū)重點(diǎn)防治亞型為HPV 16，羅志粦等[17］調(diào)查莆田地區(qū)重點(diǎn)防治亞型為HPV 52，馬麗娜等[18］調(diào)查黑龍江地區(qū)重點(diǎn)防治亞型也為HPV 16。優(yōu)勢(shì)亞型的差異考慮原因主要為多種因素，其中最主要的是因素是地域環(huán)境差異[19］。趙雪蓮等[20］研究表明，年齡、民族、受教育程度、職業(yè)、經(jīng)濟(jì)條件等重要因素影響著宮頸癌篩查和HPV 認(rèn)知水平。本地仍需加大宣傳的力度以及途徑，盡管人們目前對(duì)HPV 疫苗認(rèn)知率欠缺，但愿意接種HPV 疫苗人數(shù)所占比例相對(duì)較高[21-22］。

綜上所述，選擇性應(yīng)用預(yù)防性HPV 疫苗是必要的，也能為我國(guó)女性HPV 疫苗繼續(xù)研發(fā)提供新思路。本文不足之處，后期可隨訪宮頸疫苗接種情況，來(lái)進(jìn)一步評(píng)價(jià)疫苗接種情況對(duì)不同年齡段感染率，多重感染分布以及優(yōu)勢(shì)亞型的影響。