趙建強(qiáng) 賈欣秒

摘?要：

為了科學(xué)制定雙氫鏈霉素產(chǎn)品中未知雜質(zhì)的限度標(biāo)準(zhǔn)，從分子結(jié)構(gòu)、來源和質(zhì)量穩(wěn)定性等3個(gè)方面開展研究。首先，采用制備色譜儀從雙氫鏈霉素產(chǎn)品中制得雜質(zhì)純品，借助液相色譜-高分辨質(zhì)譜（LC-HRMS）和核磁共振譜（NMR）進(jìn)行波譜分析、研究雜質(zhì)分子結(jié)構(gòu)；其次，采用高效液相色譜法（HPLC），結(jié)合雙氫鏈霉素生產(chǎn)過程開展雜質(zhì)來源考察；最后，設(shè)計(jì)了多條件的影響因素實(shí)驗(yàn)，考證雜質(zhì)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明：雜質(zhì)分子結(jié)構(gòu)與雙氫鏈霉素的分子結(jié)構(gòu)類似，同屬氨基糖苷類物質(zhì)；雜質(zhì)來源于雙氫鏈霉素發(fā)酵階段產(chǎn)生的鏈霉素類似物，類似物在氫化過程被同步還原成為產(chǎn)品中的雜質(zhì)；雜質(zhì)對酸、堿、高溫、氧化、光照等因素不敏感，具有較好的穩(wěn)定性。由鏈霉素發(fā)酵代謝產(chǎn)生的相關(guān)性雜質(zhì)穩(wěn)定性較好，設(shè)定其限度標(biāo)準(zhǔn)為≤1.0%（峰面積分?jǐn)?shù)）是安全、合理的，可為臨床用藥提供重要參考。

關(guān)鍵詞：

色譜分析；雙氫鏈霉素；結(jié)構(gòu)確證；雜質(zhì)限度；臨床用藥

中圖分類號：

R917

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI： 10.7535/hbgykj.2024yx01008

Structure elucidation and limit setting of unknown impurity of dihydrostreptomycin

ZHAO Jianqiang1， JIA Xinmiao2

（1North China Pharmaceutical Huasheng Company Limited， Shijiazhuang， Hebei 0521602， China; 2North China Pharmaceutical Company Limited， Shijiazhuang， Hebei 050015， China）

[HQK]Abstract：

In order to scientifically establish the limit standard of unknown impurity in dihydrostreptomycin products， the study was conducted from three aspects： molecular structure， source and quality stability. Firstly，preparative chromatography was used to prepare pure impurity from dihydrostreptomycin， and LC-HRMS and NMR techniques were used for chromatographic analysis to study the molecular structure of impurities. Secondly， the impurity source was investigated by HPLC method combined with the dihydrostreptomycin production process. Finally， experiments of various influencing factors were designed to verify the quality stability of the impurity. The results show that the molecular structure of the impurity was similar to that of dihydrostreptomycin and belonged to aminoglycoside. The impurity was derived from the streptomycin analogue produced in the fermentation stage of dihydrostreptomycin， which becomes the unknown impurity of dihydrostreptomycin product through hydrogenation reduction. The impurity is not sensitive to acid， alkali， high temperature， oxidation， light and other factors， and has good stability. The related impurity produced by streptomycin fermentation metabolism has good stability， and it is safe and reasonable to set the limit standard that the peak area fraction is less than or equal to 1.0%， which provides important reference value for clinical medication.

Keywords：

chromatography analysis; dihydrostreptomycin; structure elucidation; limit of impurity; clinical medication

雙氫鏈霉素屬于氨基糖苷類抗生素，對結(jié)核桿菌和多種革蘭氏陰性桿菌有抗菌作用，在全球范圍內(nèi)廣泛用于治療家畜細(xì)菌性疾病。雙氫鏈霉素是鏈霉素經(jīng)過氫化得到的衍生物，而鏈霉素又是由傳統(tǒng)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)獲得，即在特定的發(fā)酵培養(yǎng)條件下，鏈霉素生產(chǎn)菌株通過次級代謝合成鏈霉素，此代謝過程會(huì)同步合成少量與鏈霉素結(jié)構(gòu)近似的雜質(zhì)，雜質(zhì)與鏈霉素結(jié)構(gòu)相似度越高，越難于去除，因此鏈霉素發(fā)酵液雖經(jīng)過多個(gè)工序提取純化，但仍有少量雜質(zhì)殘留于產(chǎn)品中。華北制藥華勝有限公司提供的雙氫鏈霉素樣品，經(jīng)高效液相色譜法（HPLC）檢測發(fā)現(xiàn)主峰后有一未知雜質(zhì)，其殘留水平約為0.6%（峰面積分?jǐn)?shù)，下同），HPLC譜圖見圖1。

2013年6月，歐盟EMA發(fā)布了《制訂抗生素有關(guān)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的指導(dǎo)原則》[1]（以下簡稱歐盟EMA抗生素雜質(zhì)指南）。該指南在國際上首次闡述了抗生素類藥品雜質(zhì)控制策略和要求：針對發(fā)酵類獸用抗生素，應(yīng)對超過0.5%的未知雜質(zhì)開展結(jié)構(gòu)確證研究，并結(jié)合雜質(zhì)分子結(jié)構(gòu)信息制定合理的限度標(biāo)準(zhǔn)。

歐洲藥典中，已收載的雙氫鏈霉素已知雜質(zhì)包括鏈霉胍、雙氫鏈霉素B、雜質(zhì)C等，其他未知雜質(zhì)尚未載明分子結(jié)構(gòu)及限度標(biāo)準(zhǔn)[2]。近年來，國內(nèi)外對雙氫鏈霉素未知雜質(zhì)多有研究，諸多學(xué)者借助現(xiàn)代色譜技術(shù)對多種藥品開展了雜質(zhì)研究[3-13]，并提出了控制思路與策略，但未見對該雜質(zhì)的研究和報(bào)道。用藥安全性是評價(jià)藥品的首要指標(biāo)，而未知雜質(zhì)又是影響用藥安全性的關(guān)鍵因素，這已成為當(dāng)前藥品上市前審評和藥政監(jiān)管的共識。為了科學(xué)制定雜質(zhì)限度標(biāo)準(zhǔn)，須對其開展系統(tǒng)的質(zhì)量研究，徹底明晰雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、來源途徑和質(zhì)量穩(wěn)定性等情況，以便醫(yī)生臨床用藥時(shí)參考。本研究借助LC-HRMS、NMR等波譜技術(shù)，分析確證該雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，采用HPLC考察其來源，并設(shè)計(jì)多種影響因素實(shí)驗(yàn)來評價(jià)它的質(zhì)量穩(wěn)定性。

1?材料和儀器

1.1?樣品與試劑

雙氫鏈霉素產(chǎn)品及各步中間體樣品，由華北制藥華勝有限公司提供；乙腈、甲醇、三氟乙酸、辛烷硫酸鈉，均為色譜純試劑，由賽默飛世爾科技公司提供；磷酸二氫鉀、磷酸、無水硫酸鈉，均為分析純試劑，由天津永大化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2?儀器設(shè)備

制備色譜儀NU300-NP7000，由江蘇漢邦科技有限公司提供；Thermo Vanquish-Q Exactive液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，由賽默飛世爾科技公司提供；Agilent 400 MR 超導(dǎo)脈沖傅里葉變換核磁共振波譜儀，由安捷倫科技有限公司提供；Waters 2695高效液相色譜儀，由沃特世科技（上海）有限公司提供；分析天平AG285、酸度計(jì)SevenEasy，由梅特勒-托利多科技（中國）有限公司提供。

2?方法和結(jié)果

2.1?雜質(zhì)的制備與結(jié)構(gòu)確證

2.1.1?雜質(zhì)的制備

取雙氫鏈霉素適量，加水配制成質(zhì)量濃度約為50 mg/mL的水溶液，用0.45 μm濾膜過濾，后采用制備色譜儀NU300-NP7000分離制備。色譜條件：色譜柱為Unisil 10-120 PFP（50 mm×250 mm，10 μm）；流動(dòng)相為0.2%（體積分?jǐn)?shù)）三氟乙酸水溶液；流速為100 mL/min；柱溫為常溫；檢驗(yàn)波長為205 nm；進(jìn)樣體積為2 mL；運(yùn)行時(shí)間為15 min。目標(biāo)峰保留時(shí)間約為10.8 min（色譜分析結(jié)果見圖2），按照出峰時(shí)間收集雜質(zhì)組分，凍干即得到峰面積分?jǐn)?shù)（純度）為93.6%的雜質(zhì)品。

2.1.2?液相色譜-高分辨質(zhì)譜（LC-HRMS）分析

將“2.1.1”項(xiàng)所得的雜質(zhì)品采用電噴霧電離（ESI）進(jìn)行質(zhì)譜分析，在正離子模式下進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描，獲得譜圖數(shù)據(jù)如圖3所示。

通過LC-HRMS測試，獲得雜質(zhì)游離態(tài)準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+的m/z為598.302 73，高分辨質(zhì)譜計(jì)算其分子式為C22H43N7O12；[M+H]+的m/z為598.302 73，通過ddMS2模式進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，得到的主要碎片離子m/z為263.145 29、190.106 78等，推測其裂解途徑見圖4。

2.1.3?核磁共振譜（NMR）分析

對雜質(zhì)品進(jìn)行一維和二維NMR測試，獲得的1H-NMR譜中共給出了27組氫信號，無活潑氫；13C-NMR譜中共給出了22組碳信號，代表22個(gè)碳原子，將碳?xì)鋽?shù)據(jù)進(jìn)行歸屬，結(jié)果見表1。

2.2?雜質(zhì)來源與影響因素

2.2.1?HPLC色譜條件

色譜柱為Hypersil GOLD（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液，其制備方法：稱取無水硫酸鈉4.6 g、辛烷磺酸鈉1.5 g，用848 mL水溶解，加入色譜純乙腈102 mL、質(zhì)量濃度27.2 g/L的磷酸二氫鉀溶液50 mL，混合均勻后備用；流速為1.0 mL/min；柱溫為45 ℃；進(jìn)樣體積為20 μL；檢測波長為205 nm；運(yùn)行時(shí)間為80 min。

2.2.2?雜質(zhì)流程考察

以鏈霉素發(fā)酵液為起始點(diǎn)，經(jīng)預(yù)處理得到中間體1，再經(jīng)樹脂提取、提純分別得到中間體2和中間體3，鏈霉素被氫化還原為雙氫鏈霉素得到中間體4，再經(jīng)精制得到中間體5，最后干燥得到產(chǎn)品。用HPLC檢測發(fā)酵液、5種中間體和成品，所得數(shù)據(jù)繪制未知雜質(zhì)來源與變化趨勢圖，見圖5。

2.3?影響因素實(shí)驗(yàn)

取適量雙氫鏈霉素樣品3份：1份溶于5 mL、0.5 mol/L的鹽酸溶液，放置30 min；1份溶于5 mL、0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液，放置30 min；1份溶于5 mL水中，加入2.0 mL、60％（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的雙氧水，放置30 min；分別考察雜質(zhì)在酸、堿和氧化條件下的穩(wěn)定性。另取2份雙氫鏈霉素樣品：1份置于光照箱內(nèi)，照度為（4 500±500）lx，放置10 d；另1份置于密封容器中，恒溫60 ℃，放置10 d；分別考察雜質(zhì)對高溫和光照的穩(wěn)定性。待實(shí)驗(yàn)結(jié)束，樣品經(jīng)HPLC檢測，其數(shù)據(jù)匯總于表2。

3?討?論

3.1?未知雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)

通過LC-HRMS測試，獲得未知雜質(zhì)游離態(tài)準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+的m/z為598.302 73，高分辨質(zhì)譜計(jì)算其分子式為C22H43N7O12；通過一維和二維NMR測試，對1H-1HCOSY、HSQC、HMBC核磁數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，結(jié)合降解機(jī)理推斷出雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，見圖6。

從雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)可知，它同屬于氨基糖苷類，雙氫鏈霉素分子結(jié)構(gòu)中含有N-甲基-L-葡萄糖胺，而雜質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中含有N，N-二甲基-L-葡萄糖胺，即N位上一個(gè)氫基被甲基取代，可以推斷該雜質(zhì)是一種工藝雜質(zhì)，非降解雜質(zhì)。

3.2?雜質(zhì)的來源

雜質(zhì)在生產(chǎn)過程的變化趨勢表明，雜質(zhì)在發(fā)酵液中含量最高，之后逐步減少，可見該雜質(zhì)來源于微生物發(fā)酵階段，是與主組分鏈霉素具有近似結(jié)構(gòu)微生物的代謝物。鏈霉素的生物合成機(jī)制已經(jīng)很清晰[14-15]，其分子結(jié)構(gòu)由鏈霉胍、鏈霉糖和N-甲基-L-葡萄糖胺3個(gè)部分組成。在N-甲基-L-葡萄糖胺的生物合成過程中，首先L-葡萄糖胺在S-腺甘酰甲硫氨酸條件下發(fā)生甲基化反應(yīng)，生成N-甲基-L-葡萄糖胺，該反應(yīng)進(jìn)一步甲基化，可生成副產(chǎn)物N，N-二甲基-L-葡萄糖胺，副產(chǎn)物進(jìn)一步與鏈霉胍、鏈霉糖結(jié)合可得到一種特定雜質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)如圖7所示。

該特定雜質(zhì)與雙氫鏈霉素未知雜質(zhì)相比，可發(fā)現(xiàn)：特定雜質(zhì)分子結(jié)構(gòu)中的鏈霉糖上有一個(gè)醛基，而雙氫鏈霉素未知雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)中是一個(gè)羥基。由此可推斷，鏈霉素氫化成雙氫鏈霉素時(shí)（化學(xué)反應(yīng)式見圖8），該特定雜質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的醛基同步被氫化還原為羥基，生成雙氫鏈霉素產(chǎn)品中的雜質(zhì)。

3.3?雜質(zhì)的穩(wěn)定性

通過影響因素實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，雜質(zhì)在60 ℃高溫條件下長時(shí)間放置，含量略有降低，比原樣降低了0.04個(gè)百分點(diǎn)；在酸、堿、氧化等其他條件下，雜質(zhì)含量基本無變化。主組分雙氫鏈霉素在酸、堿和氧化條件下，與雜質(zhì)相比其含量呈現(xiàn)出一定的降低趨勢，這也佐證了該雜質(zhì)屬于工藝雜質(zhì)，而非降解雜質(zhì)，這與雜質(zhì)在生產(chǎn)過程中的變化趨勢一致。另外，從雜質(zhì)分子結(jié)構(gòu)看，N-甲基-L-葡萄糖胺N位上的氫基被甲基取代后，形成的二甲基結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，對酸、堿和氧化等條件具有更強(qiáng)的耐受性。

3.4?雜質(zhì)的限度設(shè)定

經(jīng)結(jié)構(gòu)確證可知，雜質(zhì)是與主體化合物雙氫鏈霉素結(jié)構(gòu)相關(guān)的雜質(zhì)，即雙氫鏈霉素的一個(gè)氫原子被甲基取代。從分子結(jié)構(gòu)看，雜質(zhì)無基因毒性警示結(jié)構(gòu)，不存在基因毒性風(fēng)險(xiǎn)[16-17]。考慮到產(chǎn)品中雜質(zhì)的實(shí)際殘留水平未超出藥典規(guī)定的其他已知雜質(zhì)≤1.0%的限度標(biāo)準(zhǔn)，又鑒于雜質(zhì)分子結(jié)構(gòu)已明確、無基因毒性且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可設(shè)定其限度標(biāo)準(zhǔn)為≤1.0%，這既能保證用藥的安全性，又能滿足歐盟EMA抗生素雜質(zhì)指南的控制要求。

4?結(jié)?語

本文借助HPLC、LC-HRMS和NMR等波譜技術(shù)，研究獲得了雙氫鏈霉素產(chǎn)品中超標(biāo)雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)、來源和影響因素等信息，為制定雜質(zhì)限度標(biāo)準(zhǔn)提供了客觀依據(jù)。

從分子結(jié)構(gòu)確證結(jié)果看，雜質(zhì)與雙氫鏈霉素同屬于氨基糖苷類，沒有基因毒性警示結(jié)構(gòu)及用藥風(fēng)險(xiǎn)。雜質(zhì)來源考察證實(shí)，鏈霉素微生物發(fā)酵階段產(chǎn)生一種鏈霉素類似物，類似物經(jīng)氫化得到產(chǎn)品中的雜質(zhì)，屬于典型的工藝雜質(zhì)。在影響因素實(shí)驗(yàn)條件下，雜質(zhì)含量基本無變化，具有較好的穩(wěn)定性，在藥品貯存或臨床用藥時(shí)，不易受外部因素影響而降解?；诖?，可將該雜質(zhì)作為一個(gè)已知雜質(zhì)來控制，其限度標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為≤1.0%。

未來還需進(jìn)一步研究鏈霉素發(fā)酵工藝，改善微生物代謝過程，從源頭上減少雜質(zhì)的生成，不斷提高雙氫鏈霉素產(chǎn)品的純度。

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收稿日期：2023-09-08;修回日期：2023-12-06；責(zé)任編輯：王海云

第一作者簡介：

趙建強(qiáng)（1976—），男，河北蠡縣人，高級工程師，主要從事抗生素質(zhì)量控制與管理方面的研究。

通信作者：

賈欣秒高級工程師。E-mail：3265804@qq.com

趙建強(qiáng)，賈欣秒.

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