魏麗紅，常福瑞，閆 爽，郝德國，于東輝，王冬梅，劉曉秋，潘英妮

（沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，沈陽市中藥藥效物質(zhì)研究與創(chuàng)新藥開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽 110016）

防風(fēng)來源于傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata（Turcz.） Schischk.的干燥根，具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛、止痙等功效，現(xiàn)代臨床多用于治療感冒、頭痛、風(fēng)濕痹痛等［1］。氣味是中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，中藥傳統(tǒng)性狀鑒別多以人的感官鑒別為主，具有一定的主觀性和經(jīng)驗(yàn)性，鑒別結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性較差。電子鼻技術(shù)實(shí)現(xiàn)了特征性氣味的檢測(cè)，電子鼻也稱人工嗅覺系統(tǒng)，是模擬動(dòng)物嗅覺器官開發(fā)出的高科技產(chǎn)品，其主要工作機(jī)制是陣列中的每個(gè)傳感器對(duì)不同被測(cè)氣體的靈敏度不同，不同氣體在不同傳感器上產(chǎn)生的響應(yīng)高低不同，最終形成傳感器陣列對(duì)不同氣體的響應(yīng)圖譜［2］。目前，電子鼻技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)境控制、鑒別中藥材的真?zhèn)巍a(chǎn)地等［3-8］。與2020 年版《中國藥典》 中防風(fēng)性狀描述一致的是野生防風(fēng)，由于防風(fēng)臨床療效良好，需求量大，導(dǎo)致野生防風(fēng)資源匱乏。目前市場(chǎng)上流通的主要是栽培品，也常見野生防風(fēng)中混有抽薹防風(fēng)，而藥典規(guī)定抽薹防風(fēng)不可藥用，臨床對(duì)栽培防風(fēng)的認(rèn)可度也不高［9］。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，藥物形態(tài)、顏色、氣味、質(zhì)地與藥性相關(guān)，性狀是決定藥性的主要因素［10］。本實(shí)驗(yàn)從氣味出發(fā)，借助電子鼻對(duì)不同防風(fēng)粉末的整體氣味進(jìn)行客觀化表達(dá)，探究不同生長(zhǎng)方式防風(fēng)的氣味與化學(xué)成分間的相關(guān)性及栽培防風(fēng)、抽薹防風(fēng)與野生防風(fēng)的區(qū)別。

1 材料

1.1 儀器 PEN 型電子鼻（北京盈盛恒泰科技有限公司）； FW100 型粉碎機(jī)、DK-98-1 型電熱恒溫水浴鍋（天津泰斯特儀器有限公司）； LC-20AB 型高效液相色譜儀，配置SPD-20AUV 型檢測(cè)器、LC-Solution 型色譜工作站（日本島津公司）； TGL-16B 型高速離心機(jī) （上海安亭科學(xué)儀器廠）； 2600-UV/VIS 型紫外分光光度計(jì)［尤尼柯（上海）儀器有限公司］。

1.2 試劑 升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷對(duì)照品（純度≥98%，成都普菲德生物有限公司）。95%硫酸、蒽酮（天津市大茂化學(xué)試劑廠）。甲醇、甲酸為色譜純（天津市康科德科技有限公司）； 乙酸乙酯為色譜純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.3 藥材 防風(fēng)共15 批，經(jīng)沈陽藥科大學(xué)潘英妮教授鑒定為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikoviadivaricata（Turcz.）Schischk.的干燥根，具體見表1。

表1 樣品信息

2 揮發(fā)油含量測(cè)定

按照2020 年版《中國藥典》 四部2204 項(xiàng)下方法操作，分別取栽培防風(fēng)、野生防風(fēng)、抽薹防風(fēng)各50 g，粉碎，過60 目篩備用。將粉碎好的藥材置圓底燒瓶中，加10 倍量純凈水和一定量的沸石，振搖混合后，連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管，自冷凝管上端加水使其充滿揮發(fā)油測(cè)定器的刻度部分，并溢流入燒瓶為止，圓底燒瓶置于電熱套加熱至沸騰并保持微沸至測(cè)定器中油量不再增加（約5 h），停止加熱，放置片刻，開啟測(cè)定器的下端活塞，將水緩緩放出，至油層上端到達(dá)零刻度線上方5 mm 處為止，放置1 h以上，再開啟活塞使油層下降至其上端恰與零刻度線平齊，讀取揮發(fā)油量，并計(jì)算揮發(fā)油含量。

3 多糖含量測(cè)定

3.1 對(duì)照品溶液制備 取無水葡萄糖對(duì)照品25 mg，精密稱定，置于25 mL 量瓶中，蒸餾水定容至刻度，即得含1.084 mg/mL 葡萄糖的貯備溶液。取2.5 mL 至25 mL 量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度為0.108 4 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

3.2 供試品溶液制備 精密稱取野生防風(fēng)、栽培防風(fēng)、抽薹防風(fēng)粉末各0.5 g，置于50 mL 圓底燒瓶中，加入25 mL 95%乙醇回流提取2 次，每次1 h，過濾，棄去濾液，回收濾渣，濾渣揮干溶劑后加25 mL 蒸餾水回流2 次，每次1 h，合并2 次提取液，轉(zhuǎn)移至100 mL 量瓶中，加水定容至刻度，取1 mL，置于50 mL 量瓶中，加水定容至刻度，即得。

3.3 蒽酮-濃硫酸試劑制備 精密稱取蒽酮粉末0.22 g，置于100 mL 棕色量瓶中，加80%濃硫酸溶解，定容至刻度，即得。

3.4 最大吸收波長(zhǎng)的確定 吸取對(duì)照品、供試品溶液各1 mL，置于具塞試管中，冰水浴下分別緩慢加入0.2%的蒽酮-濃硫酸試劑4 mL，混勻，冷卻至室溫； 另取0.2%蒽酮-濃硫酸試劑4 mL，加入1 mL 蒸餾水，作為空白。將具塞試管置于沸水浴中加熱10 min，冷卻至室溫，在200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果，對(duì)照品、供試品溶液均在580 nm 處具有最大吸收，故選定其作為最大吸收波長(zhǎng)，見圖1。

圖1 紫外全波長(zhǎng)掃描圖

3.5 線性關(guān)系考察 分別吸取0.108 4 mg/mL 對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、0.9 mL，加蒸餾水至1 mL，在冰水浴中緩慢加入蒽酮-濃硫酸試劑4 mL 混勻，冷卻至室溫；另取蒸餾水1 mL，同法加入蒽酮-濃硫酸試劑4 mL 混勻，作為空白。將具塞試管置于沸水浴中加熱10 min，冷卻至室溫，于580 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（A） 進(jìn)行回歸，得方程為A＝0.007 9X＋0.008 8 （r＝0.999 3），在21.68～97.56 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.6 精密度試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（Y1） 0.5 g，按“3.4” 項(xiàng)下方法操作，在580 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度5 次，測(cè)得其RSD 為0.85%，表明儀器精密度良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（Y1） 0.5 g，按“3.4” 項(xiàng)下方法操作，分別于0、0.5、1.0、2.0、3.0 h 以水為空白，在580 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，測(cè)得其RSD 為0.22%，表明溶液在3.0 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批藥材（Y1） 5 份，按“3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以水為空白對(duì)照，按“3.4” 項(xiàng)下方法在580 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，測(cè)得其RSD為1.38%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取總糖含量已知的樣品（Y1） 6 份，每份0.25 g，加入1.084 mg/mL 對(duì)照品溶液4 mL，按“3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以水為空白對(duì)照，按“3.4” 項(xiàng)下方法在580 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 多糖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

3.10 樣品含量測(cè)定 按“3.2” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以水為空白對(duì)照，在580 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算含量。

4 防風(fēng)整體氣味測(cè)定

4.1 傳感器信號(hào)分析 PEN 型電子鼻共有10 根金屬氧化物傳感器，具體如表3 所示。

表3 PEN 型電子鼻標(biāo)準(zhǔn)傳感器陣列與性能

4.2 樣品方法處理篩選 以樣品對(duì)傳感器響應(yīng)值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選稱樣量、孵化溫度、孵化時(shí)間。測(cè)量條件為手動(dòng)進(jìn)樣，傳感器清洗時(shí)間80 s，測(cè)定時(shí)間60 s，采樣時(shí)間15 s。

4.3 稱樣量 取過40 目篩樣品，分別精密稱取0.3、0.6、1.0、1.5 g 后測(cè)定傳感器響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)1.0 g 時(shí)響應(yīng)值最高，并且各稱樣量無明顯差異，故確定稱樣量為1.0 g。

4.4 孵化溫度 精密稱取過40 目篩的樣品1.0 g，分別置于35、45、60 ℃水浴加熱40 min 后測(cè)定傳感器響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)在60 ℃時(shí)響應(yīng)值最高，故確定孵化溫度為60 ℃。

4.5 孵化時(shí)間 精密稱取過40 目篩的樣品1.0 g，分別置于60 ℃水浴中孵化20、30、40 min 后測(cè)定傳感器響應(yīng)值，發(fā)現(xiàn)在30 min 時(shí)響應(yīng)值最高，故確定孵化時(shí)間為30 min。

4.6 分析條件 采用直接頂空吸氣法，直接將進(jìn)樣針頭插入含樣品的進(jìn)樣瓶中吸氣，測(cè)定條件為室溫（22±2）℃，采樣時(shí)間每組15 s，傳感器自清洗時(shí)間10 s，分析采樣時(shí)間60 s，每批樣品連續(xù)測(cè)量2 次。以采樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，傳感器響應(yīng)電壓為縱坐標(biāo)繪制響應(yīng)曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 防風(fēng)對(duì)電子鼻的響應(yīng)曲線

4.7 精密度試驗(yàn) 取樣品適量，測(cè)定10 個(gè)傳感器響應(yīng)值，重復(fù)5 次，測(cè)得其RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

4.8 樣品分析 取樣品適量，在“4.6” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣分析，平行3 次，取平均值。

5 結(jié)果

5.1 色原酮、揮發(fā)油、多糖含量與電子鼻傳感器響應(yīng)值 15批樣品中色原酮（升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷）、揮發(fā)油、多糖含量測(cè)定結(jié)果見表4，電子鼻不同傳感器響應(yīng)值結(jié)果見表5，可知野生防風(fēng)各組響應(yīng)值波動(dòng)均大于栽培防風(fēng)和抽薹防風(fēng)，表明前者氣味較濃郁。

表4 防風(fēng)中主要成分含量測(cè)定結(jié)果（%）

表5 防風(fēng)氣味響應(yīng)值測(cè)定結(jié)果

5.2 傳感器分析 Loading 分析是針對(duì)電子鼻傳感器的分析，可準(zhǔn)確計(jì)算出10 根傳感器的敏感成分信息及區(qū)分樣品的能力［11］。利用Loading 分析法對(duì)防風(fēng)藥材電子信號(hào)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3，可知7 號(hào)傳感器（W1W） 和9 號(hào)傳感器（W2W） 對(duì)第一主成分的貢獻(xiàn)率最大，5 號(hào)傳感器（W5C） 對(duì)第二成分的貢獻(xiàn)率最大。結(jié)合表5 可知，7 號(hào)傳感器對(duì)于萜烯類靈敏度較高，9 號(hào)傳感器對(duì)于芳香類靈敏度較高，5 號(hào)傳感器對(duì)于烷烴類靈敏度較高，推測(cè)防風(fēng)揮發(fā)性成分可能是萜烯類芳香化合物及烷烴化合物。

圖3 Loading 分析結(jié)果

5.3 PCA 分析 主成分分析（PCA） 是將數(shù)據(jù)降維，分為第一、第二主成分貢獻(xiàn)率，通過比較兩者總貢獻(xiàn)率反映原始數(shù)據(jù)信息，以此判斷電子鼻技術(shù)對(duì)樣品的識(shí)別能力［12-13］。將3 種樣品傳感器響應(yīng)值進(jìn)行PCA 分析，結(jié)果見圖4，區(qū)分度見表6，可知第一、第二主成分貢獻(xiàn)率達(dá)99.318%。由表6 可知，抽薹防風(fēng)和其他2 種防風(fēng)的區(qū)分度較大，但栽培防風(fēng)和野生防風(fēng)有部分重合在一起，區(qū)分度不夠顯著。

圖4 3 種防風(fēng)PCA 分析圖

表6 3 種防風(fēng)區(qū)分度

5.4 LDA 分析 利用線性判別分析（LDA） 縮小組內(nèi)差距，擴(kuò)大組間差距［14］。組間差距越大，差異性越大，若第一、第二主成分之和的貢獻(xiàn)率相近，說明樣品之間氣味值的區(qū)分度較小。由圖5 可知，3 種防風(fēng)第一主成分貢獻(xiàn)率為27.96%，第二主成分貢獻(xiàn)率為16.59%，總區(qū)分率為44.55%，表明三者之間的區(qū)分度有部分重合，整體區(qū)分度不高。

圖5 LDA 分析結(jié)果

5.5 防風(fēng)氣味與主要成分含量相關(guān)性分析 采用SIMCA 14.0 軟件中的雙變量分析法，對(duì)電子鼻傳感器響應(yīng)值與防風(fēng)主要成分進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見圖6 ～7。由此可知，色原酮（升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷） 含量?jī)H與W2S 傳感器呈顯著正相關(guān)，與W5S、W2W 呈顯著負(fù)相關(guān)，說明W2S 傳感器響應(yīng)值越高，該類成分含量越高； 揮發(fā)油含量與W6S 和W3S 呈顯著正相關(guān)，與W5S 和W2W 呈顯著負(fù)相關(guān)，說明前兩者傳感器響應(yīng)值越高，該類成分含量越高。

圖7 揮發(fā)油與防風(fēng)氣味相關(guān)性分析圖

6 討論

由3 種防風(fēng)化學(xué)物質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果可知，野生防風(fēng)揮發(fā)油含量最高，其次是栽培防風(fēng)，最次為抽薹防風(fēng)。防風(fēng)揮發(fā)油的組成主要為脂肪族和萜類化合物，具有較好的鎮(zhèn)痛、抗炎、止血等作用［15-16］。推測(cè)野生防風(fēng)的藥效優(yōu)于栽培防風(fēng)可能與其揮發(fā)油含量高有關(guān)。野生防風(fēng)的色原酮總量最高，抽薹防風(fēng)和栽培防風(fēng)含量相近，15 批樣品中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量均符合2020 年版《中國藥典》 要求。防風(fēng)抽薹后色原酮總量并不減少，與文獻(xiàn)［17］ 報(bào)道一致。栽培防風(fēng)的多糖含量高于野生防風(fēng)及抽薹防風(fēng)，與栽培環(huán)境中水、肥等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足有關(guān)［18］。防風(fēng)在抽薹后多糖含量下降，推測(cè)是因?yàn)橹参镞M(jìn)入生長(zhǎng)繁殖期后，大量的多糖營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為其他成分。

本實(shí)驗(yàn)借助電子鼻對(duì)不同防風(fēng)粉末的整體氣味進(jìn)行客觀化表達(dá)。對(duì)3 種防風(fēng)進(jìn)行氣味與化學(xué)成分之間相關(guān)性的分析得出，防風(fēng)中響應(yīng)值較高的是萜烯類芳香性化合物，該結(jié)果與文獻(xiàn)［19］ 報(bào)道一致。根據(jù)電子鼻對(duì)氣味的響應(yīng)值來看，野生防風(fēng)＞抽薹防風(fēng)＞栽培防風(fēng)。而當(dāng)色原酮的含量較高時(shí)，其在電子鼻的響應(yīng)值也較高，可見氣味與化學(xué)成分的含量具有一定的相關(guān)性。結(jié)合SIMCA 軟件對(duì)防風(fēng)電子鼻氣味值與色原酮類、揮發(fā)油含量進(jìn)行相關(guān)性分析，可以得出W2S 傳感器、W3S 和W6S 傳感器與色原酮類、揮發(fā)油含量呈顯著正相關(guān)，傳感器響應(yīng)值越高，防風(fēng)中所對(duì)應(yīng)的成分含量越高。綜上所述，可根據(jù)電子鼻中W2S、W3S 和W6S 傳感器響應(yīng)值判斷防風(fēng)中色原酮類與揮發(fā)油的含量，但氣味濃郁程度是否會(huì)影響藥效發(fā)揮還需要進(jìn)一步研究。