劉 茵，邱 華，毛德文，王明剛，余鈺娟，宋振恒，周曉云，黃永林

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝病科，廣西 南寧 530023； 2.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中醫(yī)科，廣西 南寧 530000； 3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530001）

肝硬化是一種以彌漫性纖維化、肝內(nèi)靜脈血流嚴(yán)重中斷、門脈高壓和肝衰竭為特征的進(jìn)行性慢性肝病。當(dāng)出現(xiàn)腹水、靜脈曲張出血時，會出現(xiàn)失代償性肝硬化［1］，其發(fā)病率高，能誘發(fā)許多自發(fā)性腹膜炎、肝腎綜合征等致命的并發(fā)癥［2］。目前，治療肝硬化腹水方法包括控制水和鈉鹽的攝入、利尿劑、腹腔穿刺放液配合靜脈輸注白蛋白、生長抑素及肝移植等，但遠(yuǎn)期療效欠佳，且復(fù)發(fā)率高，需要巨額的醫(yī)療費(fèi)用［3］。近年來，中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，在肝病治療中協(xié)同作用好且副作用低［4］。芪遂逐水膏由黃芪、甘遂、木香、茯苓、丹參、益母草和大腹皮組成，具有益氣健脾、活血柔肝、溫陽暖腎、利水消腫等功效［5］，能有效促進(jìn)肝硬化頑固性腹水患者腹水消退，改善肝功能［6］。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析芪遂逐水膏敷貼有效活性成分及其可能作用通路，構(gòu)建復(fù)方中藥-單體化合物-藥物作用靶點(diǎn)-通路的作用網(wǎng)絡(luò)，并通過動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為臨床更好地利用芪遂逐水膏敷貼提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥物 芪遂逐水膏由黃芪、甘遂、木香、茯苓、益母草、丹參、大腹皮7 味中藥組成，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥房提供，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)何報(bào)作教授鑒定為正品，按照前期確定的藥物提取方法、制劑基質(zhì)配方、制劑工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制備芪遂逐水膏的凝膠膏劑型［7-9］。黃芪、茯苓、益母草加12 倍量水浸泡30 min，回流提取3次，每次1.5 h，合并提取液； 取甘遂、木香、丹參、大腹皮加6 倍量85%乙醇浸泡30 min，加水回流提取2 次，每次1.5 h，合并提取液，過濾，將水煎液與乙醇回流提取液合并，濃縮得到浸膏，真空干燥，粉碎，制成干膏粉。在凝膠膏基質(zhì)和透皮促滲劑中加入制備好的中藥干膏粉攪拌混勻，制備芪遂逐水凝膠膏，每片規(guī)格為6 cm×8 cm。本品每片含黃芪以黃芪甲苷計(jì)不低于0.693 2 mg，含甘遂以大戟二烯醇計(jì)不低于1.476 6 mg［8］。按成人與大鼠體表面積比例換算，統(tǒng)一裁制成1 cm×1 cm、2 cm×2 cm 2 種規(guī)格，在4 ℃下保存。

1.2 試劑與儀器 谷丙轉(zhuǎn)氨酶 （ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、白蛋白（ALB） 試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司； 伊紅、中性樹脂、RIPA （強(qiáng)） 組織細(xì)胞快速裂解液、BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司（貨號E8090、G8590、R0010、PC0020）； 蘇木素購自武漢賽維爾生物科技有限公司（貨號G1004）； 血管內(nèi)皮生長因子A （VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶8 （MAPK8）、蛋白激酶B1 （AKT1）、TP53、GAPDH、Goat anti-Rabbit IgG 購自武漢貝茵萊生物科技有限公司（貨號PAB30096、PAB33334、PAB30596、PAB34226、PAB36269、SAB43714）； PVDF 轉(zhuǎn)移膜、化學(xué)發(fā)光試劑購自美國Millipore 公司 （貨號IPVH00010、WBKLS0500）。mini protean 3 cell 電泳儀購自美國Bio-Rad公司； iCEN-24R 高速冷凍離心機(jī)購自杭州奧盛儀器有限公司； Tanon-5200 全自動化學(xué)發(fā)光分析儀購自上海天能科技有限公司。

1.3 動物 SPF 級雄性SD 大鼠24 只，體質(zhì)量200～250 g，來源于三峽大學(xué)（質(zhì)量合格證號42010200005069），飼養(yǎng)于武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號SYXK （鄂） 2018-0104。研究符合武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司倫理審查委員會有關(guān)動物研究指導(dǎo)原則（倫理審查號HLK-20210930-01）。

2 方法

2.1 芪遂逐水膏活性成分及靶點(diǎn)篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http： //tcmspw.com/tcmsp.php，version 2.3） 進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，收集有效成分與作用靶點(diǎn)。通過對既往外敷型藥物有效成分的研究結(jié)果［10-11］，將化合物相對分子質(zhì)量（MW） ≤500、辛醇與水分配系數(shù)（AlogP） ＜5、氫鍵供體數(shù) （Hdon） ＜5、氫鍵受體數(shù)（Hacc） ＜10、可旋轉(zhuǎn)鍵（RBN） ＜10 設(shè)置為篩選參數(shù)，在TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)，通過UniProt 數(shù)據(jù)庫將其名稱轉(zhuǎn)換為基因簡稱。

2.2 芪遂逐水膏預(yù)測靶點(diǎn)功能分析 通過構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），可清晰呈現(xiàn)靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間直接、間接的調(diào)控關(guān)系。使用STRING 數(shù)據(jù)庫分析靶點(diǎn)之間蛋白互作關(guān)系，DAVID 分析工具對獲得的靶蛋白進(jìn)行基因本體（GO） 分析［12］，包括生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞定位（CC） 和分子功能（MF），各自描述了基因產(chǎn)物可能行使的分子功能、所處的細(xì)胞環(huán)境、參與的生物學(xué)過程，將P≤0.05 設(shè)定為顯著性基因富集的臨界值，使用R 軟件進(jìn)行作圖。再采用京都基因與基因組百科全書（KEGG）［13-14］分析，物種設(shè)置為人（Homosapiens），以P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)確定功能及重要通路，并對通路進(jìn)行注釋和分析。

2.3 芪遂逐水膏及肝硬化腹水共有靶點(diǎn)分析 采用GeneCards［15］（https： //www.genecards.org/） 數(shù)據(jù)庫中查找肝硬化腹水相關(guān)靶點(diǎn)，取活性成分預(yù)測靶點(diǎn)與疾病預(yù)測靶點(diǎn)交集，繪制韋恩圖。采用DAVID 分析工具對獲得的靶蛋白進(jìn)行GO和KEGG 分析，以P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)確定功能及重要通路，并對后者進(jìn)行注釋和分析。

2.4 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 選擇共有靶點(diǎn)中與肝硬化腹水相關(guān)的通路，使用Cytoscape 3.7.0 軟件繪制“靶基因-通路” 網(wǎng)絡(luò)圖。

2.5 動物實(shí)驗(yàn) 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為正常組、模型組與芪遂逐水膏敷貼高、低劑量組，每組6 只。除正常組外，其余各組大鼠第1 周給予35%苯巴比妥CMCNa 混懸液，然后背部皮下注射CCl4油溶液建立肝硬化腹水模型，14 周后芪遂逐水膏敷貼高、低劑量組分別給予2 cm×2 cm、1 cm×1 cm 規(guī)格敷貼于脫毛大鼠的腹部皮膚上，每天1 次，每次6 h，連續(xù)4 周。

常規(guī)乙醚麻醉大鼠后腹主動脈采血，離心，收集血清，全自動生化分析儀檢測ALT、AST 活性及TBIL、ALB 水平，收集肝組織，HE 染色觀察肝臟病理變化。

Western Blot 法檢測VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53 蛋白表達(dá)，將大鼠肝臟剪碎，按比例加入裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制劑），勻漿器勻漿直至完全裂解。4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度檢測，加入適量上樣緩沖液，沸水浴10 min 使蛋白變性，將配制好的PAGE 膠放入電泳槽中，上樣后電泳，濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉4 ℃過夜，加入一抗VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53 （1 ∶1 000），室溫孵育1 h，TBST洗滌3 次，再加入二抗（1 ∶20 000） 室溫孵育1 h，TBST洗滌3 次，滴加ECL 化學(xué)發(fā)光液，以GAPDH 為內(nèi)參，Image J 軟件計(jì)算相關(guān)條帶灰度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，2 組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 芪遂逐水膏活性成分及靶點(diǎn)篩選 共得到13 種活性成分和240 個預(yù)測靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 “化合物-預(yù)測靶點(diǎn)個數(shù)” 花瓣圖

3.2 芪遂逐水膏靶蛋白PPI 分析 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖見圖2，包含240 個節(jié)點(diǎn)、2 674條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為22.3，PPI富集P＜1.0 × 10-16。使用Cytoscape 軟件中的network analyzer 工具對預(yù)測靶蛋白互作結(jié)果進(jìn)行可視化分析，其中節(jié)點(diǎn)的大小和顏色的明暗與靶蛋白的節(jié)點(diǎn)度呈正比，節(jié)點(diǎn)越大，靶蛋白與其他蛋白的關(guān)聯(lián)度越大，結(jié)果見圖3。由此可知，AKT1、TP53、VEGFA、TNF、SRC、PTGS2、EGFR、CASP3、JUN、ESR1 等蛋白之間的相互作用具有重要地位，其中AKT1、TP53、VEGFA、TNF 鄰接靶標(biāo)數(shù)目最多。

圖2 芪遂逐水膏活性成分預(yù)測靶點(diǎn)PPI 蛋白互作圖

圖3 芪遂逐水膏預(yù)測靶點(diǎn)蛋白互作可視化圖

3.3 芪遂逐水膏預(yù)測靶點(diǎn)功能分析 GO 分析顯示，芪遂逐水膏活性成分參與的生物學(xué)過程最多的為藥物反應(yīng)、氧化應(yīng)激、活性氧代謝過程等，主要涉及的細(xì)胞定位為膜筏、膜微域、囊腔等，分子功能主要有血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、氧化還原酶活性，作用于成對供體，結(jié)合或還原分子氧，見圖4。KEGG 分析顯示，芪遂逐水膏活性成分主要參與神經(jīng)活性配體-受體相互作用、化學(xué)致癌作用-受體激活、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化等通路，見圖5。

圖4 芪遂逐水膏預(yù)測靶點(diǎn)的GO 功能分析柱狀圖

圖5 芪遂逐水膏預(yù)測靶點(diǎn)的KEGG 通路分析柱狀圖

3.4 芪遂逐水膏與肝硬化腹水共有靶點(diǎn)分析 在GeneCard數(shù)據(jù)庫（https： //www.genecards.org/） 查找肝硬化腹水相關(guān)靶點(diǎn)作為預(yù)測靶點(diǎn)，共得到1 108 個?；钚猿煞诸A(yù)測靶點(diǎn)與肝硬化腹水預(yù)測靶點(diǎn)取交集，繪制韋恩圖，見圖6，得到共有靶點(diǎn)86 個，PPI 蛋白互作圖見圖7，包含86 個節(jié)點(diǎn)、1 083 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度為25.2，PPI 富集P＜1.0×10-16。其中，共有靶點(diǎn)中的核心基因?yàn)锳KT1、VEGFA、TNF、TP53、CASP3、MMP9 等。

圖6 芪遂逐水膏與肝硬化腹水共有靶點(diǎn)

圖7 芪遂逐水膏與肝硬化腹水共有靶點(diǎn)PPI 蛋白互作圖

3.5 芪遂逐水膏及肝硬化腹水共有靶點(diǎn)功能分析 GO 分析顯示，參與最多的生物學(xué)過程為藥物反應(yīng)、氧含量反應(yīng)等，主要涉及的細(xì)胞定位為膜筏、膜微域等，分子功能主要有DNA 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合，見圖8。KEGG 分析顯示，其主要參與脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣化等通路，見圖9。

圖8 芪遂逐水膏及肝硬化腹水共有靶點(diǎn)的GO 功能分析柱狀圖

圖9 芪遂逐水膏及肝硬化腹水共有靶點(diǎn)的KEGG 通路分析柱狀圖

3.6 靶點(diǎn)-通路的網(wǎng)絡(luò)分析 基于共有靶點(diǎn)-通路關(guān)系使用Cytoscape 軟件構(gòu)建靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，可直觀地體現(xiàn)芪遂逐水膏通過多靶點(diǎn)和多通路治療肝硬化腹水的作用機(jī)制，見圖10。

圖10 芪遂逐水膏與肝硬化腹水共有靶點(diǎn)-KEGG 通路網(wǎng)絡(luò)圖

3.7 肝臟病理學(xué)觀察 正常組肝臟結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞呈放射狀整齊排列，無炎癥細(xì)胞浸潤； 模型組肝臟結(jié)構(gòu)明顯破壞，肝細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)變性腫脹及壞死，伴有大量炎性細(xì)胞浸潤，纖維組織增生形成假小葉； 芪遂逐水膏低劑量組肝臟結(jié)構(gòu)基本完整，輕微纖維組織增生，可見少量炎性細(xì)胞浸潤，較模型組有改善； 芪遂逐水膏高劑量組肝臟結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，肝細(xì)胞索排列較整齊，可見散在的炎性細(xì)胞浸潤，見圖11。

圖11 各組大鼠肝組織染色（HE，×100）

3.8 芪遂逐水膏對ALT、AST 活性及TBIL、ALB 水平的影響 與正常組比較，模型組血清ALT、AST 活性及TBIL 水平升高，ALB 水平降低（P＜0.01），表明模型制備成功；與模型組比較，芪遂逐水膏低劑量組血清ALT、AST 活性降低（P＜0.05），TBIL、ALB 水平無明顯變化（P＞0.05），芪遂逐水膏高劑量組血清ALT、AST 活性及TBIL 水平降低（P＜0.01），ALB 水平升高（P＜0.01），見圖12。

圖12 芪遂逐水膏對ALT、AST 活性及TBIL、ALB 水平的影響（±s，n＝3）

3.9 芪遂逐水膏對VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組肝臟組織VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，芪遂逐水膏各劑量組肝臟組織VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53 蛋白表達(dá)表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖13。

圖13 芪遂逐水膏對VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53 表達(dá)的影響（±s，n＝3）

4 討論

腹水是肝硬化最突出的臨床表現(xiàn)，肝硬化腹水的發(fā)生嚴(yán)重影響了肝硬化患者的生命質(zhì)量與生存率，目前尚無特效療法［16］。中藥方劑具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，在治療肝硬化腹水方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，但難以解釋其藥理作用機(jī)制。

TCMSP 發(fā)現(xiàn)，芪遂逐水膏組方13 種活性成分，其對應(yīng)的靶點(diǎn)共有240 個，其中AKT1、TP53、VEGFA、TNF、SRC、PTGS2、EGFR、CASP3、JUN、ESR1 等蛋白具有重要地位。AKT 參與多種細(xì)胞功能，如生存、代謝、轉(zhuǎn)錄和翻譯等過程，在癌癥和炎癥性疾病中起調(diào)節(jié)作用［17-18］。VEGFA 是生理和病理狀態(tài)下最重要的血管內(nèi)皮生長因子，參與腫瘤新生血管的形成，在腫瘤的形成、增殖和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用［19］。caspase-3 是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族的成員之一，有證據(jù)表明它可促進(jìn)癌細(xì)胞生長、細(xì)胞遷移和侵襲性，為疾病治療提供新靶點(diǎn)［20-21］。

PPI 蛋白互作圖分析發(fā)現(xiàn)，芪遂逐水膏和肝硬化腹水共有靶點(diǎn)中的核心基因?yàn)锳KT1、VEGFA、TNF、TP53、CASP3、MMP9。GO 和KEGG 功能分析發(fā)現(xiàn)主要參與藥物反應(yīng)和氧含量反應(yīng)，具有DNA 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、血紅素結(jié)合、四吡咯結(jié)合等分子功能，參與脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣化等通路，結(jié)果表明芪遂逐水膏對肝硬化腹水的治療是多靶點(diǎn)的。根據(jù)共有靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖分析發(fā)現(xiàn)，VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53 與芪遂逐水膏治療肝硬化腹水密切相關(guān)。VEGFA 和CASP3 參與細(xì)胞凋亡和增殖等生物過程，與線粒體功能和凋亡密切相關(guān)，AKT1 磷酸化會降低氧化應(yīng)激刺激的MAPK 激酶活性，從而防止細(xì)胞凋亡。MAPK 信號通路參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和腫瘤侵襲等多種生物學(xué)過程［22］。本研究構(gòu)建肝硬化腹水動物模型后檢測血清肝功能指標(biāo)，結(jié)果顯示模型組血清中ALT、AST 活性和TBIL 水平高于正常組，ALB 水平降低。肝臟病理組織檢查發(fā)現(xiàn)模型組肝臟結(jié)構(gòu)破壞，纖維組織增生形成假小葉，有大量炎性細(xì)胞浸潤，表明模型制備成功。本研究進(jìn)一步檢測肝臟中VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53 的表達(dá)，結(jié)果顯示在肝硬化腹水模型中，VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53 蛋白表達(dá)增加，給予芪遂逐水膏后蛋白表達(dá)降低。

綜上所述，芪遂逐水膏治療肝硬化腹水的可能機(jī)制是多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的協(xié)同作用，可能與VEGFA、CASP3、MAPK8、AKT1、TP53 有關(guān)，為臨床更好的利用芪遂逐水膏敷貼提供理論基礎(chǔ)。