葉佳豐，韓婕珺，龔天貴，王 斌，陳 賢，王春麗*

（1.華東理工大學(xué)藥學(xué)院，上海 200237； 2.美出萊化妝品有限責(zé)任公司，浙江 杭州 311121； 3.廣州伽能生物科技有限公司，廣東 廣州 511335）

變應(yīng)性接觸性皮炎（allergic contact dermatitis，ACD）是一種遲發(fā)型超敏反應(yīng)，分為致敏期和激發(fā)期［1-2］，是皮膚或黏膜接觸外源性物質(zhì)后發(fā)生的過敏性炎癥反應(yīng)，常在接觸部位甚至它處發(fā)生。除了臨床常用的皮質(zhì)類固醇和抗組胺藥，中藥對(duì)接觸性皮炎也有較好的療效，如苦木［3］、地膚子［4］、陰地蕨［5］等。

牡丹皮為毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，性微寒，味辛、苦，歸心、肝、腎經(jīng)，功效清熱涼血、活血化瘀，具有抗炎、抗腫瘤、降糖、抗過敏、保護(hù)心血管等作用［6］。丹皮酚是牡丹皮中的主要作用成分，也是皮炎、濕疹的有效治療藥物。牡丹皮提取物具有治療接觸性皮炎的潛力，且機(jī)制尚不明確。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)牡丹皮提取物治療接觸性皮炎的作用機(jī)制進(jìn)行探究，對(duì)牡丹皮提取物治療接觸性皮炎效果進(jìn)行了簡(jiǎn)單評(píng)價(jià)，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步的驗(yàn)證，為牡丹皮提取物開發(fā)外用抗炎舒緩的藥品或化妝品提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)ICR 小鼠20 只，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自上海必凱科翼生物科技有限公司 ［動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK （滬） 2018-0006］，于室溫20 ～25 ℃、相對(duì)濕度40% ～60%、12 h/12 h 明暗交替的動(dòng)物房?jī)?nèi)適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)華東理工大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)ECUST-2021-03007）。

1.2 藥物 牡丹皮購(gòu)自北京同仁堂股份有限公司，經(jīng)華東理工大學(xué)藥學(xué)院馬磊教授鑒定為毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosaAndr.的干燥根皮，其提取物的制備方法參考文獻(xiàn)［7］ 報(bào)道。復(fù)方醋酸地塞米松乳膏（華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)2102019X）。

1.3 試劑 1-氯-2，4-二硝基苯（DNCB） （東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)WT6CA-VO）； BCA 總蛋白定量試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)O20HR198586）； 小鼠白細(xì)胞介素6 （IL-6） ELISA 試劑盒（北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司，批號(hào)202210）； β-actin、ERK1/2 抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)GB15001、GB11560）； p-ERK1/2 （美國(guó)Cell Signaling Technology 公司，貨號(hào)4370）；p-Akt （上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)AA329）。

1.4 儀器 正置白光拍照顯微鏡（日本Nikon 公司，型號(hào)Eclipse Ci-L）； 酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司，型號(hào)RT-6100）； 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，型號(hào)D3024R）； 研磨儀、脫色搖床、垂直電泳儀（武漢賽維爾生物科技有限公司，型號(hào)KZ-III-F、DS-2S100、SVE-2）； 轉(zhuǎn)印電泳儀（武漢賽維爾生物科技有限公司，型號(hào)SVT-2）； 超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司，型號(hào)JY92-11N）； 化學(xué)發(fā)光儀（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)6100）； 熒光定量PCR 儀（美國(guó)Bio-Rad 公司，型號(hào)CFX Connect）； PCR 儀（北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司，型號(hào)ETC811）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥組和牡丹皮組，每組5 只。采用DNCB 誘導(dǎo)建立接觸性皮炎模型［8］，并適當(dāng)改進(jìn)，實(shí)驗(yàn)前1 d 對(duì)小鼠腹部及背部去毛，第1 天和第2 天上午9： 00 在下腹部2 cm×2 cm脫毛部位處均勻涂抹含5% DNCB 的乙醇50 μL 致敏； 第6天開始，在小鼠尾基底部以上1 cm 處的背部脫毛部位（2 cm×2 cm） 涂抹含1% DNCB 的乙醇25 μL 激發(fā)，每3 d 1 次，共4 次，均在上午9： 00進(jìn)行。從致敏日起預(yù)防給藥，給藥面積2 cm×2 cm，每天1 次，至激發(fā)結(jié)束，均在下午5： 00 進(jìn)行。牡丹皮組給予0.5%牡丹皮提取物0.2 mL，陽性藥組給予醋酸地塞米松乳膏0.2 g，各組均勻涂抹至沒有液體殘留，并采用無刺激膠布固定以防止小鼠舔舐。

2.2 取材 末次給藥24 h 后，脫頸處死小鼠，取給藥部位皮膚2 cm×2 cm，平均分成1 cm×1 cm 的4 份，左上部分用于HE 染色，左下部分用于ELISA 檢測(cè)，右上部分用于Western blot 實(shí)驗(yàn)，右下部分用于RT-qPCR 檢測(cè)。

2.3 脾臟、胸腺指數(shù)檢測(cè) 小鼠脫頸處死后，測(cè)定體質(zhì)量，解剖取脾臟及胸腺并測(cè)定其質(zhì)量，脾臟、胸腺指數(shù)以脾臟、胸腺質(zhì)量與體質(zhì)量的比值表示。

2.4 HE 染色觀察皮膚組織病理形態(tài) 取各組小鼠皮膚組織，用4%多聚甲醛固定，經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋切片后用蘇木精-伊紅染色后脫水、透明、封片，于顯微鏡下觀察皮膚組織結(jié)構(gòu)形態(tài)及炎細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

2.5 ELISA 法檢測(cè)皮膚組織IL-6 水平 取各組小鼠皮膚組織，用預(yù)冷的PBS （pH 7.4） 沖洗，去除殘留血液，并用加有蛋白酶抑制劑的PBS 勻漿，反復(fù)凍融后于4 ℃、5 000×g下離心10 min，取上清，利用BCA 法測(cè)定總蛋白含量，按照試劑盒說明書操作，于450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度（OD） 值，計(jì)算IL-6 水平。

2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.6.1 牡丹皮成分的獲取及篩選 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（https： //old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），以牡丹皮為搜索對(duì)象收集相關(guān)成分并進(jìn)行篩選，標(biāo)準(zhǔn)為分子量（MW） ≤500、脂水分配系數(shù)（AlogP） 1 ～3［9］，得到符合要求的透皮吸收成分。由于類藥性低并不代表沒有藥效，如丹皮酚的類藥性值為0.04，依然有較好的藥理活性，因此不考慮類藥性的篩選。

2.6.2 潛在作用靶點(diǎn)的收集 通過TCMSP 收集各活性成分的靶點(diǎn)信息，并將 Swisstarget Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http： //www.swisstargetprediction.ch/） Probability≥0.1、TargetNet 數(shù) 據(jù) 庫(kù) （ http： //targetnet.scbdd.com/）Probability ≥0.9、PharmMapper 數(shù)據(jù)庫(kù) （ http： //www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/） Probability≥0.5 的高分預(yù)測(cè)靶點(diǎn)納入活性成分靶點(diǎn)中，將蛋白名用UniProt 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù) （https： //www.uniprot.org/） 轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的 gene symbol，并通過DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)（https： //www.disgenet.org/）、GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫(kù) （ https： //www.genecards.org/）、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù) （http： //db.idrblab.net/ttd/） 以“contact dermatitis” “allergic contact dermatitis” 為關(guān)鍵詞收集接觸性皮炎靶點(diǎn)信息，取各數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn)信息的并集作為最終的疾病靶點(diǎn)集。活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集即為牡丹皮提取物治療接觸性皮炎的潛在作用靶點(diǎn)。

2.6.3 活性成分-潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 整理活性成分信息及潛在作用靶點(diǎn)信息，得到對(duì)應(yīng)的Network 及Type 文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件，構(gòu)建活性成分-潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

2.6.4 蛋白-蛋白相互作用 （PPI） 網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 在STRING 平臺(tái)（https： //cn.string-db.org/） 導(dǎo)入潛在作用靶點(diǎn)信息，限定物種“Homosapiens”，選擇最高置信度0.900，隱藏游離節(jié)點(diǎn)，獲得潛在作用靶點(diǎn)蛋白的互作關(guān)系，導(dǎo)出為TSV 格式文件，并導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 軟件，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。再利用cytoHubba 插件工具計(jì)算節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)。

2.6.5 GO、KEGG 富集分析 利用生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https： //david.ncifcrf.gov/） 進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）、京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 富集分析，以揭示牡丹皮提取物外用治療接觸性皮炎的生物進(jìn)程、細(xì)胞組分、分子功能及相關(guān)通路情況。

2.6.6 Reactome 信號(hào)通路富集分析 在Reactome Pathway數(shù)據(jù)庫(kù) （Reactome Pathway Database，https： //reactome.org/） 中導(dǎo)入潛在作用靶點(diǎn)信息，限定物種為 “Homo sapiens”，進(jìn)行通路富集分析。

2.6.7 分子對(duì)接驗(yàn)證 在Protein Data Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https： //www.rcsb.org/） 中，篩選解析度＜3? 的靶點(diǎn)蛋白，得到對(duì)應(yīng)的PDB 格式文件。并從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https： //pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/） 中下載活性成分3D 結(jié)構(gòu)SDF 文件，通過Open Babel 2.4.1 轉(zhuǎn)換為PDB 格式［10］。使用AutoDock Vina 1.1.2 進(jìn)行分子對(duì)接，Autodock Tool 1.5.6 對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行包括去水、加氫、去配體等預(yù)處理，測(cè)定小分子扭轉(zhuǎn)鍵，導(dǎo)出蛋白及配體的pdbqt 文件。隨后將配體與處理后的蛋白對(duì)接，并用PyMOL 2.3.4 處理對(duì)接結(jié)果，通過結(jié)合能判斷活性成分與靶點(diǎn)蛋白結(jié)合效果［11］。

2.7 Western blot 法檢測(cè)皮膚組織p-ERK1/2、p-Akt 蛋白表達(dá) 取各組小鼠皮膚組織，勻漿裂解得到總蛋白，使用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)電泳分離、轉(zhuǎn)膜后5%脫脂牛奶室溫封閉30 min，加一抗4 ℃搖床孵育過夜，加二抗孵育30 min，加入ECL 發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。采用Image J分析圖像條帶灰度值。

2.8 RT-qPCR 法檢測(cè)皮膚組織PI3KmRNA 表達(dá) 取各組小鼠皮膚組織，用RNA 提取液提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸30 s，循環(huán)40 次。采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。GAPDH正向引物序列 5′-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3′，反向引物序列 5′-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3′；PI3K正向引物序列5′-CACGGCGATTACACTCTTACACTA-3′，反向引物序列5′-CACTGGGTAGAGCAACTTCACATC-3′。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過IBM SPSS Statistics 26 和Graph Pad 8.4.3 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 牡丹皮提取物對(duì)小鼠皮膚組織病理的影響 如圖1 所示，模型組小鼠皮膚出現(xiàn)明顯的結(jié)痂、潮紅，伴有皮膚粗糙破損； 與模型組比較，陽性藥組及牡丹皮組小鼠皮膚結(jié)痂消失，少見皮膚潮紅，皮膚狀態(tài)優(yōu)于模型組。HE 染色結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組表皮重度增厚（黑色箭頭），角質(zhì)層增厚，可見膿性灶（紫色箭頭）； 表皮局部缺失，真皮裸露（紅色箭頭）； 真皮膠原纖維排列紊亂，真皮及皮下可見大量的淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞呈彌散性浸潤(rùn)（藍(lán)色箭頭）。與模型組比較，陽性藥組及牡丹皮組小鼠皮膚組織皮膚結(jié)構(gòu)完整，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較少（藍(lán)色箭頭）。

圖1 各組小鼠皮膚形態(tài)及HE 病理染色

3.2 牡丹皮提取物對(duì)小鼠脾臟、胸腺指數(shù)的影響 如表1所示，與空白組比較，模型組小鼠脾臟指數(shù)升高 （P＜0.01），顯示超敏反應(yīng)發(fā)生； 與模型組比較，陽性藥組及牡丹皮組小鼠脾臟指數(shù)降低（P＜0.05，P＜0.01）。與空白組比較，模型組小鼠胸腺指數(shù)降低（P＜0.01）； 與模型組比較，牡丹皮組小鼠胸腺指數(shù)升高（P＜0.01），而陽性藥組小鼠胸腺指數(shù)降低（P＜0.05）。

表1 各組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)比較（mg/10 g，±s，n＝5）

表1 各組小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)比較（mg/10 g，±s，n＝5）

組別脾臟指數(shù)胸腺指數(shù)空白組39.35±3.5236.68±0.38模型組49.18±1.52＃＃22.30±1.78＃＃陽性藥組15.36±1.95**19.50±0.66*牡丹皮組42.70±0.83*29.51±1.48**

3.3 牡丹皮提取物對(duì)小鼠皮膚組織IL-6 水平的影響 如圖2 所示，與空白組比較，模型組小鼠皮膚組織IL-6 水平升高（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性藥組及牡丹皮組小鼠皮膚組織IL-6 水平降低（P＜0.01）。

圖2 各組小鼠皮膚組織IL-6 水平比較（±s，n＝5）

3.4 牡丹皮提取物的活性成分 從TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選得到牡丹皮活性成分18 種。如表2 所示，這些化合物具有較小的分子量及較好的透皮性質(zhì)，可作為后續(xù)研究的有效成分。

表2 牡丹皮有效成分信息

3.5 牡丹皮提取物的潛在作用靶點(diǎn) 通過多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)收集各活性成分的靶點(diǎn)信息，去除重復(fù)項(xiàng)共得到628 個(gè)靶點(diǎn)。從DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)收集疾病靶點(diǎn)，去除重復(fù)項(xiàng)，得到靶點(diǎn)信息共2 317 條。使用Venny 2.1.0 平臺(tái)（https： //bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/） 取活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)的交集，得到潛在作用靶點(diǎn)共317 個(gè)，見圖3。

圖3 活性成分靶點(diǎn)-接觸性皮炎靶點(diǎn)Venn 圖

3.6 牡丹皮提取物活性成分-潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 如圖4所示，活性成分與潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖包含336 個(gè)節(jié)點(diǎn)（1個(gè)藥、18 種成分、317 個(gè)靶點(diǎn)）、1 380 條邊。槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422） 可結(jié)合靶點(diǎn)較多，分別為199、132 個(gè)。

圖4 活性成分-潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

3.7 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖（圖5） 反映了靶點(diǎn)之間的聯(lián)系，共含270 個(gè)節(jié)點(diǎn)（47 個(gè)游離節(jié)點(diǎn)）、1 423 條邊，各靶點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)可反映1 個(gè)靶點(diǎn)對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)的影響［12］。該網(wǎng)絡(luò)圖中顏色表示度值（Degree），字體大小表示緊密度（Closeness），節(jié)點(diǎn)大小表示介度 （Betweenness），取Degree、Closeness、Betweenness 前15 位的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)［13］。表3 顯示，牡丹皮外用治療接觸性皮炎主要作用于原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、有絲分裂原激活的蛋白激酶1 （MAPK1）、磷脂酰肌醇3-激酶調(diào)節(jié)亞單元α（PIK3R1） 等關(guān)鍵靶點(diǎn)。

表3 關(guān)鍵靶點(diǎn)拓?fù)鋮?shù)

圖5 潛在作用靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

3.8 GO、KEGG 富集分析 如圖6 所示，GO 富集分析得到顯著性P＜0.05 的生物進(jìn)程（biological process，BP） 條目892 條，細(xì)胞組分（cellular component，CC） 條目88 條，分子功能（molecular function，MF） 條目112 條。牡丹皮外用治療接觸性皮炎的生物進(jìn)程主要涉及對(duì)藥物的反應(yīng)（response to drug）、對(duì)脂多糖的反應(yīng) （ response to lipopolysaccharide）、炎癥反應(yīng)（inflammatory response） 等，細(xì)胞組分主要涉及在細(xì)胞外空間（extracellular space）、膜筏（membrane raft）、胞液（cytosol） 等，分子功能主要涉及在酶結(jié)合（enzyme binding）、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性（transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity）、蛋白酪氨酸激酶活性（protein tyrosine kinase activity） 等。

圖6 潛在作用靶點(diǎn)GO、KEGG 富集分析圖

KEGG 信號(hào)通路富集分析得到顯著性P＜0.05 的條目共177 條。潛在作用靶點(diǎn)顯著富集于PI3K-Akt 信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、MAPK 信號(hào)通路 （MAPK signaling pathway） 等［1-2，14］，表明牡丹皮提取物可能通過PI3K-Akt、MAPK 信號(hào)通路發(fā)揮治療接觸性皮炎的作用。

3.9 Reactome 信號(hào)通路富集分析 Reactome 信號(hào)通路富集共得到P＜0.05 條目1 427 條，如圖7 所示，潛在作用靶點(diǎn)顯著富集于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) （signal transduction）、免疫系統(tǒng)（immune system）、免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞因子信號(hào)（cytokine signaling in immune system） 等，表明PI3K-Akt 信號(hào)通路的傳導(dǎo)可能在牡丹皮提取物治療接觸性皮炎中發(fā)揮重要作用。

圖7 Reactome 信號(hào)通路富集分析結(jié)果

3.10 分子對(duì)接驗(yàn)證 關(guān)鍵成分槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、鄰苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate）、5- ｛ ［5- （4-methoxyphenyl） -2-furyl］ methylene｝ barbituric acid、兒茶素［（＋） -catechin］ 與關(guān)鍵靶點(diǎn)SRC （1A07）、MAPK1 （3SA0）、PIK3R1 （1H9O）、HSP90AA1 （1BYQ）、TP53 （3Q01） 分子對(duì)接驗(yàn)證的結(jié)果見圖8，可知結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol［15］，表明槲皮素、山柰酚等成分與靶點(diǎn)各靶點(diǎn)都具有較好的結(jié)合活性。

圖8 分子對(duì)接結(jié)果熱圖及對(duì)接模式圖

3.11 牡丹皮提取物對(duì)小鼠皮膚組織p-ERK、p-Akt 表達(dá)的影響 如圖9 所示，與空白組比較，模型組小鼠皮膚組織p-ERK1/2、p-Akt 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性藥組及牡丹皮組小鼠皮膚組織p-ERK1/2、p-Akt蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）。

圖9 各組小鼠皮膚組織p-ERK、p-Akt 蛋白表達(dá)比較（±s，n＝5）

3.12 牡丹皮提取物對(duì)小鼠皮膚組織PI3KmRNA 表達(dá)的影響 如圖10 所示，與空白組比較，模型組小鼠皮膚組織PI3KmRNA 表達(dá)降低（P＜0.01）； 與模型組比較，陽性藥組及牡丹皮組小鼠皮膚組織PI3KmRNA 表達(dá)升高（P＜0.01）。

圖10 各組小鼠皮膚組織PI3K mRNA 表達(dá)降低（±s，n＝5）

4 討論

接觸性皮炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，這是一種由多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)，包括白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、干擾素等［16-17］。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，牡丹皮提取物可以降低小鼠皮膚組織的炎細(xì)胞浸潤(rùn)及IL-6 水平，維持皮膚組織結(jié)構(gòu)； 牡丹皮提取物給藥可以降低模型小鼠的脾臟指數(shù)，減輕過敏反應(yīng)，表明牡丹皮提取物可以有效緩解小鼠接觸性皮炎的癥狀。此外，IL-6 可以影響MAPK 信號(hào)通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激和凋亡［18］。本研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示，牡丹皮提取物中的18 種活性成分通過調(diào)節(jié)多種生物進(jìn)程，發(fā)揮多種分子功能發(fā)揮改善接觸性皮炎的作用，包括免疫應(yīng)答和對(duì)脂多糖的反應(yīng)［2，19］等； 其次牡丹皮提取物還可以調(diào)節(jié)包括PI3K-Akt 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路在內(nèi)的多個(gè)通路，這些通路與免疫炎癥調(diào)節(jié)有重要關(guān)系［20-22］。

MAPK、PI3K-Akt 信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)代謝、增殖分化中發(fā)揮著重要的作用［23-24］。MAPK1 編碼的MAP 激酶1（ERK2） 通過MAPK/ERK 信號(hào)通路依賴的機(jī)制被細(xì)胞外信號(hào)激活，調(diào)控細(xì)胞的增殖凋亡等生理活動(dòng)。PI3K/Akt 信號(hào)通路可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，與多種炎性介質(zhì)密切相關(guān)［25］，其中Akt 是PI3K 通路的中心介質(zhì)，其C 端調(diào)節(jié)區(qū)的Ser473 位點(diǎn)對(duì)Akt 的完全激活起著重要作用［26］。研究表明，激活ERK1/2 可以減少心肌細(xì)胞凋亡［27］，減輕大鼠腦缺血誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)［28］。同時(shí)有研究指出，激活PI3K-Akt 信號(hào)通路可以減輕前列腺素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激及炎癥水平，抑制自噬，減輕細(xì)胞損傷及凋亡［29］。本研究結(jié)果顯示，牡丹皮提取物可以提高接觸性皮炎小鼠皮膚組織p-ERK、p-Akt 蛋白表達(dá)及PI3KmRNA 表達(dá)，激活了MAPK/ERK、PI3K-Akt 信號(hào)通路，發(fā)揮炎癥抑制的作用。

綜上所述，本研究表明，牡丹皮提取物可以降低接觸性皮炎小鼠皮膚組織IL-6 水平，改善皮膚狀態(tài)，調(diào)節(jié)小鼠脾臟、胸腺指數(shù)； 其次通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討了牡丹皮提取物治療接觸性皮炎的機(jī)制，并進(jìn)行了簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果也表明，牡丹皮提取物可通過提高p-ERK1/2 表達(dá)激活MAPK/ERK 通路，提高p-Akt 蛋白表達(dá)及PI3KmRNA 表達(dá)，激活PI3K-Akt 信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮炎癥抑制的作用。MAPK/ERK、PI3K-Akt 信號(hào)通路可能是牡丹皮提取物治療接觸性皮炎的關(guān)鍵信號(hào)通路。詳細(xì)的通路傳導(dǎo)機(jī)制有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。