曹好好，劉 濤，許美霞

（武漢市第四醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 武漢 430033）

膿毒癥所致腦功能障礙 （sepsis-induced brain dysfunction，SIBD） 是一種彌漫性腦功能障礙，由非中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的膿毒癥所致，因此也被稱為膿毒癥相關(guān)性腦?。╯epsis-associated encephalopathy，SAE），是膿毒癥患者嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥［1］。近年來，臨床上發(fā)現(xiàn)合并SAE 的患者預(yù)后明顯變差［2］，是決定膿毒癥死亡率的關(guān)鍵因素之一［3-4］。然而，對于SAE 的治療，臨床上尚沒有特異性的診斷和治療手段。血腦屏障（BBB） 完整性破壞是SAE 發(fā)展的關(guān)鍵因素［5］。星形膠質(zhì)細(xì)胞是BBB 的重要組成部分，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)和功能中扮演著十分重要的角色［6］。Nrf2 被認(rèn)為是細(xì)胞對抗氧化損傷最重要的作用機(jī)制之一［7］。多項(xiàng)研究證實(shí)，川芎的多種有效成分能透過BBB，有效減輕炎癥因子和氧化應(yīng)激對腦組織的損傷［8-10］。但目前該藥物成分洋川芎內(nèi)酯I 針對星形膠質(zhì)細(xì)胞功能調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究通過LPS 刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞并檢測相關(guān)指標(biāo)，探討洋川芎內(nèi)酯I 對星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的影響及機(jī)制，以期為川芎在膿毒癥腦病治療方面提供理論參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞 大鼠神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞（貨號CP-R137） 購自武漢普諾賽生命科技有限公司，用含10%胎牛血清及雙抗的培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，按時(shí)更換新培養(yǎng)液。

1.2 試劑與藥物 洋川芎內(nèi)酯I （上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號S412878）。Nrf2 特異抑制劑ML385 （美國MCE 公司，貨號846657-71-9）。胎牛血清（美國Gibco公司，貨號10270-106）； 大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號CM-R137）； 脂多糖（美國Sigma 公司，貨號L3012）； 一氧化氮檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號S0021S）； 兔抗GFAP 多克隆抗體、Nrf2 多克隆抗體、HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG（武漢貝茵萊生物科技有限公司，貨號 PAB36507、PAB30175、SAB43732）； 兔抗iNOS 多克隆抗體 （英國Abcam 公司，貨號ab283655）； CCK-8 試劑（北京索萊寶科技有限公司，貨號CA1210）； MDA 檢測試劑盒、SOD 活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，貨號A003-1-2、A001-3-2）。

2 方法

2.1 分組 星形膠質(zhì)細(xì)胞以1.0×105/mL 的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h 后分為①對照組，培養(yǎng)基培養(yǎng)，不作任何處理； ②LPS 組，1 μg/mL LPS 干預(yù)24 h； ③LPS＋不同濃度洋川芎內(nèi)酯I 組，分別以20、50、100 μmol/L 洋川芎內(nèi)酯I 與1 μg/mL LPS 共同干預(yù)24 h； ④LPS＋ML385 組，先用終濃度為10 μmol/L 的ML385 預(yù)處理24 h，再予以1 μg/mL LPS 共同干預(yù)24 h； ⑤LPS＋洋川芎內(nèi)酯I＋ML385組，用終濃度為10 μmol/L 的ML385 預(yù)處理24 h，再予以50 μmol/L 洋川芎內(nèi)酯I 和1 μg/mL LPS 共同干預(yù)24 h。

2.2 CCK-8 法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞活性 將星形膠質(zhì)細(xì)胞混懸液按每孔3.0×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96 孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，按“2.1” 項(xiàng)下方法處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。取出細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入10 μL CCK8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，使用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm 波長處測量各孔光密度（OD） 值。

2.3 Western blot 法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、Nrf2、iNOS蛋白表達(dá) 從星形膠質(zhì)細(xì)胞裂解液中分離出總蛋白，BCA試劑盒測定濃度，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%BSA 封閉后加入一抗4 ℃孵育過夜，PBST 洗滌3次，加入二抗室溫孵育1 h，ECL 顯影。以GAPDH 為內(nèi)參，通過Image J 軟件分析條帶灰度值，計(jì)算目的蛋白相對表達(dá)量。

2.4 Griess 法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液NO 水平 細(xì)胞按“2.1” 項(xiàng)下方法處理，培養(yǎng)24 h 后收集上清液，按試劑盒說明書檢測NO 水平。

2.5 比色法檢測細(xì)胞SOD 活性和MDA 水平 細(xì)胞按“2.1” 項(xiàng)下方法處理，培養(yǎng)24 h 后與0.1 mol/L TBA、0.05 mmol/L EDTA 溶液混合，加入1% TritonX100 50 μL，置于振蕩器上反應(yīng)1 min，再加入100 μL HPO3溶液，將蛋白沉淀于4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作，檢測SOD 活性及MDA 水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 22.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s） 表示，多組間比較采用單因素方差分析，2 組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 洋川芎內(nèi)脂I 對星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響 如圖1 所示，與對照組比較，LPS 組細(xì)胞活性增加（P＜0.01）； 與LPS 組比較，LPS ＋ML385 組細(xì)胞活性增加 （P＜0.01），LPS＋洋川芎內(nèi)酯I 不同濃度組細(xì)胞活性降低（P＜0.01）；與LPS＋洋川芎內(nèi)酯I 50 μmol/L 組比較，LPS＋洋川芎內(nèi)酯I＋ML385 組細(xì)胞活性升高（P＜0.01）。

圖1 洋川芎內(nèi)脂I 對星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響（±s，n＝6）

3.2 洋川芎內(nèi)酯I 對星形膠質(zhì)細(xì)胞SOD 活性和MDA、NO水平的影響 如表1 所示，與對照組比較，LPS 組細(xì)胞SOD 活性降低 （P＜0.01），MDA、NO 水平升高 （P＜0.01）； 與LPS 組比較，LPS＋ML385 組細(xì)胞SOD 活性降低（P＜0.01），MDA、NO 水平升高（P＜0.01），LPS＋洋川芎內(nèi)酯I 不同濃度組細(xì)胞SOD 活性升高（P＜0.01），MDA、NO 水平降低（P＜0.05，P＜0.01）； 與LPS＋洋川芎內(nèi)酯I 50 μmol/L 組比較，LPS＋洋川芎內(nèi)酯I＋ML385 組細(xì)胞SOD活性降低（P＜0.01），MDA、NO 水平升高（P＜0.01）。

表1 洋川芎內(nèi)酯I 對星形膠質(zhì)細(xì)胞SOD 活性和MDA、NO 水平的影響（±s，n＝5）

表1 洋川芎內(nèi)酯I 對星形膠質(zhì)細(xì)胞SOD 活性和MDA、NO 水平的影響（±s，n＝5）

注： 與對照組比較，**P＜0.01； 與LPS 組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01； 與LPS＋洋川芎內(nèi)酯I 50 μmol/L 組比較，△△P＜0.01。

組別SOD/（U·mg prot-1）MDA/（nmol·mg prot-1）NO/（μmol·L-1）對照組63.90±0.133.73±0.1511.12±0.18 LPS 組47.02±0.83**9.01±0.30**20.37±0.34**LPS＋洋川芎內(nèi)酯I 20 μmol/L 組51.35±1.11＃＃8.52±0.32＃18.71±0.46＃＃LPS＋洋川芎內(nèi)酯I 50 μmol/L 組58.05±1.18＃＃7.08±0.27＃＃15.11±0.31＃＃LPS＋洋川芎內(nèi)酯I 100 μmol/L 組62.25±0.69＃＃6.21±0.24＃＃11.65±0.32＃＃LPS＋ML385 組45.71±0.92＃9.40±0.29＃21.64±0.36＃＃LPS＋洋川芎內(nèi)酯I 50 μmol/L＋ML385 組50.59±0.92＃?！鳌?.83±0.45△△19.63±0.44＃?！鳌?/p>

由此可知，洋川芎內(nèi)酯I 在20 ～100 μmol/L 濃度范圍內(nèi)對LPS 誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞均有較好的保護(hù)作用，故選擇50 μmol/L 進(jìn)行后續(xù)機(jī)制探索。

3.3 洋川芎內(nèi)脂I 對星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP 熒光表達(dá)的影響 如圖2 所示，與對照組比較，LPS 組細(xì)胞GFAP 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)； 與LPS 組比較，LPS＋ML385 組細(xì)胞GFAP 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，LPS＋洋川芎內(nèi)酯I 組細(xì)胞GFAP 熒光強(qiáng)度減弱；與LPS＋洋川芎內(nèi)酯I 組比較，LPS＋洋川芎內(nèi)酯I＋ML385 組GFAP 熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。

圖2 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP 免疫熒光反應(yīng)

3.4 洋川芎內(nèi)酯I 對星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、Nrf2、iNOS 蛋白表達(dá)的影響 如圖3 所示，與對照組比較，LPS 組細(xì)胞GFAP、iNOS 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），Nrf2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）； 與LPS 組比較，LPS ＋ML385 組細(xì)胞GFAP、iNOS 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01），Nrf2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），LPS＋洋川芎內(nèi)酯I 組細(xì)胞GFAP、iNOS 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），Nrf2 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）； 與LPS＋洋川芎內(nèi)酯I 組比較，LPS＋洋川芎內(nèi)酯I＋ML385 組GFAP、iNOS 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），Nrf2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）。

圖3 洋川芎內(nèi)酯I 對星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、Nrf2、iNOS 蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝3）

4 討論

目前認(rèn)為，血腦屏障破壞和氧化應(yīng)激是SAE 重要的病理生理基礎(chǔ)，各種損傷因素如感染、炎癥、顱腦損傷、卒中、神經(jīng)退行性疾病等，均會導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。一方面，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞通過延長足突、遷移，對BBB起到直接的物理支持作用，還能分泌如血管生成素-1（ANG-1）、膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF） 的一些保護(hù)性細(xì)胞因子［11］。膿毒癥時(shí)，炎性因子、活性氧族（ROS） 和活性氮族（RNS） 持續(xù)大量產(chǎn)生，直接造成星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷，導(dǎo)致血腦屏障物理結(jié)構(gòu)被破壞。另一方面，過度活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞不僅會持續(xù)、大量分泌炎癥因子，而且在氧化應(yīng)激反應(yīng)過程中產(chǎn)生的各種自由基通過激活多種炎癥信號通路，又進(jìn)一步刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子。此外，過度活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞還能分泌包括血管內(nèi)皮生長因子、NO 和內(nèi)皮素等活性因子，通過不同方式造成BBB破壞［12-13］。

氧化應(yīng)激是破壞血腦屏障的重要因素。有研究表明，膿毒癥患者的長期認(rèn)知功能障礙與膿毒癥早期即出現(xiàn)的氧化應(yīng)激有關(guān)［14］。Nrf2 在對抗氧化損傷的過程中扮演著關(guān)鍵角色。馮竟成、徐革等［15-16］研究表明，上調(diào)Nrf2 介導(dǎo)的抗氧化通路對大鼠血腦屏障具有保護(hù)作用。另有研究顯示，上調(diào)Nrf2/HO-1 表達(dá)可使星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生具有保護(hù)作用的反應(yīng)性增生［17］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS 誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性增加，細(xì)胞活化的主要標(biāo)志蛋白GFAP 表達(dá)升高，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)iNOS 表達(dá)上調(diào)，SOD 活性降低，MDA 和NO 水平升高。川芎有效成分在治療膿毒癥方面的研究也有較多報(bào)道［18-19］。洋川芎內(nèi)酯I 是一種從川芎中提取出的單體。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，以不同濃度的洋川芎內(nèi)酯I 干預(yù)后，星形膠質(zhì)細(xì)胞活性降低，GFPA、iNOS 表達(dá)下調(diào)，Nrf2 表達(dá)上調(diào)，SOD 活性升高，MDA 和NO 水平降低； 在同時(shí)加入Nrf2 特異性阻滯劑ML385 后，洋川芎內(nèi)酯I 的保護(hù)作用被減弱，提示洋川芎內(nèi)酯I 可能是通過上調(diào)Nrf2 表達(dá)起到對LPS 誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用，因ML385 并不能完全抑制洋川芎內(nèi)酯I 這種保護(hù)作用，提示洋川芎內(nèi)酯I 可能還通過其他通路同時(shí)發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，洋川芎內(nèi)酯I 可減輕LPS 誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化，減輕氧化應(yīng)激產(chǎn)物的釋放，增加抗氧化產(chǎn)物的表達(dá)，其機(jī)制可能與上調(diào)Nrf2 表達(dá)有關(guān)，但仍需大量實(shí)驗(yàn)研究加以確定。