朱 寧，凌海燕，楊安東，趙軍寧，李小芳

（1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041； 2.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137）

四氫姜黃素是姜黃素在體內(nèi)的主要活性代謝產(chǎn)物，具有與姜黃素類似的藥理作用，被認為是體內(nèi)姜黃素的主要有效形式，是一種極具開發(fā)價值的化合物，但低水溶性限制了其活性的發(fā)揮。

在現(xiàn)有的提高難溶性藥物溶解度的制劑策略中，脂質(zhì)制劑是改善難溶性藥物生物利用度的幾種有前景的方法之一［1］。但是由于脂質(zhì)制劑復(fù)雜的體內(nèi)處置過程，使得目前大部分脂質(zhì)制劑的處方設(shè)計中采用的溶解度、可分散性、乳滴粒徑等簡單指標［2-3］對生物利用度的影響并不突出［4-7］，導(dǎo)致其體外評價結(jié)果與體內(nèi)性能相關(guān)性低，成為困擾脂質(zhì)制劑開發(fā)的瓶頸。脂質(zhì)制劑在口服后，隨著分散和消化的進行，藥物在消化液中形成過飽和狀態(tài)［8］，可能導(dǎo)致藥物迅速沉淀，從而降低吸收。因此，衡量脂質(zhì)制劑性能的關(guān)鍵指標是制劑在消化后保持藥物溶解或過飽和的能力。

大多數(shù)藥物吸收的主要驅(qū)動力是被動擴散，游離藥物在胃腸道的濃度越高，吸收驅(qū)動力越強。脂質(zhì)制劑在體外模擬消化條件下藥物溶出曲線下面積（AUC） 可反映藥物過飽和狀態(tài)保持的程度和時間，因此能夠預(yù)示藥物吸收的程度［9］。本研究通過D-最優(yōu)混料設(shè)計得到不同處方，參考簡化體外消化法［10］，以AUC 為考察指標對處方進行了篩選，以期改善現(xiàn)有四氫姜黃素脂質(zhì)制劑研究缺乏對脂質(zhì)消化的模擬的現(xiàn)象［11-13］。

1 材料

Zetasizer Nano ZS 納米粒度電位儀（英國Malvern 公司）； ST16R 離心機（美國Thermo Fisher 公司）； MIX-25渦旋混合儀（杭州米歐儀器有限公司）； XS205 電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）； Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）； HNY-303 恒溫水浴搖床（天津歐諾儀器股份有限公司）； XP-213 偏振光顯微鏡（上海天省儀器有限公司）； JEM2100 高分辨透射電鏡（日本電子株式會社）。

四氫姜黃素原料藥（實驗室自制，由天然姜黃素催化氫化并純化所得，純度≥98%）； 四氫姜黃素對照品（美國Sigma 公司，批號BCCB4086，純度99.3%）。大豆油（浙江田雨山藥用油有限公司）； 玉米油（江西益普生藥業(yè)有限公司）； 蓖麻油、橄欖油、油酸、油酸乙酯、十二烷基三甲基氯化銨 （分析純，成都市科龍化工試劑廠）；Transcutol HP ［二乙二醇單乙基醚，嘉法獅（上海） 貿(mào)易有限公司］； 吐溫85、吐溫80、吐溫20、氫氧化鈉、無水氯化鈣、聚乙二醇400 （分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司）； Cremophor EL （聚氧乙烯蓖麻油，南京都萊生物技術(shù)有限公司）； Cremopher RH40 （聚氧乙烯氫化蓖麻油，德國BASF 公司）； Imwitor 742 （辛癸酸單雙甘油酯，北京鳳禮精求商貿(mào)有限責(zé)任公司）； 模擬禁食人工腸液FaSSIF V2、模擬餐后人工腸液FeSSIF V2 （英國Biorelevant 公司）； 豬胰酶（8×USP，上海麥克林生化科技股份有限公司，批號C10234345）； 4-溴苯硼酸（上海源葉生物科技有限公司，純度98%，批號S06A6K2217）。鹽酸（分析純，成都金山化學(xué)試劑有限公司）； 乙腈（色譜純，美國Fisher 公司）；氨水 （分析純，成都長聯(lián)化工試劑有限公司，含量25% ～28%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX Extend-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）； 流動相乙腈-0.05% 氨水（含10 mmol/L 十二烷基三甲基氯化銨） （38 ∶62）； 體積流量1.0 mL/min； 柱溫25 ℃； 檢測波長288 nm； 進樣量10 μL。

2.2 溶解度測定 采用振搖法測定四氫姜黃素在油、表面活性劑、助表面活性劑中的飽和溶解度。取過量四氫姜黃素分別加入裝有各輔料的離心管中，25 ℃、120 r/min 振搖48 h，8 000 r/min 離心10 min，精密稱取上清液0.2 g，用無水乙醇稀釋，作為供試品溶液，在“2.1” 項下色譜條件下進樣測定，結(jié)果見表1。

表1 四氫姜黃素在不同輔料中的平衡溶解度

由此可知，四氫姜黃素在長鏈油脂中溶解度普遍較低，但在蓖麻油中溶解度較高，為46.3 mg/g； 在中鏈油脂中MCT、Imwitor 742 溶解度約為12～15 mg/g； 在表面活性劑中吐溫80 溶解度最高，超過200 mg/g； 在助表面活性劑中Transcutol HP 對四氫姜黃素的溶解度達381 mg/g，遠超其他助表面活性劑。

2.3 處方的初步篩選

2.3.1 四氫姜黃素在處方中的溶解度 參考脂質(zhì)制劑分類系統(tǒng)的典型處方［14］，并結(jié)合四氫姜黃素在輔料中的溶解度對部分輔料進行了適當(dāng)調(diào)整，得到9 個空白脂質(zhì)處方，見表2。按處方中各成分的比例取輔料混合均勻，制備空白處方，將過量四氫姜黃素加入裝有空白處方的離心管中，25 ℃、120 r/min 振搖48 h。按“2.1” 項下色譜條件測定四氫姜黃素在各處方中的平衡溶解度。

表2 四氫姜黃素在不同類型脂質(zhì)處方中的平衡溶解度及分散后的乳滴粒徑（n＝3）

由此可知，四氫姜黃素在各處方中的溶解度與油脂比例呈負相關(guān)關(guān)系，ⅢB、Ⅳ型處方中的溶解度比Ⅰ、Ⅱ、ⅢA 型處方有大幅度提升。由于四氫姜黃素的服用劑量較高，溶解度在300 mg/mL 以上的ⅢB、Ⅳ型處方更為適合。ⅢBM 和ⅢB-L 型處方中四氫姜黃素溶解度分別為377.6、330.9 mg/g，較為接近，故對這2 種處方作進一步比較。

2.3.2 乳滴粒徑 分別將空白和載藥處方以100 倍純水稀釋并充分分散后，用激光粒度儀測定粒徑。由表2 可知，粒徑隨著脂質(zhì)含量的下降而減小，且含長鏈脂質(zhì)的處方的分散粒徑明顯大于含中鏈脂質(zhì)處方?？瞻字|(zhì)處方分散后，中鏈脂質(zhì)處方透明度高于同型的長鏈脂質(zhì)處方，與粒徑測定結(jié)果相符。但載藥后ⅢB-M 及Ⅳ型處方則變?yōu)榘咨煌该魅橐海?jīng)顯微鏡觀察，乳液中產(chǎn)生了微小的藥物結(jié)晶顆粒； ⅡM 和ⅢA-M 型則由于載藥量較小，外觀與空白處方相差不大。

2.3.3 在人工胃液中的溶出試驗 分別將1.5 g 四氫姜黃素溶于5 g ⅢB-M、ⅢB-L、Ⅳ型空白處方中，各取0.50 g裝填入0 號硬膠囊中，以人工胃液（0.01 mol/L HCl 和0.15 mol/L NaCl，pH 2.0，由于脂質(zhì)處方中不含蛋白酶的底物，故未加入胃蛋白酶） 為溶出介質(zhì)，采用2020 年版《中國藥典》 四部通則0931 溶出度與釋放度測定法槳法測定，轉(zhuǎn)速為75 r/min，于5、15、30、45、60、90、120 min各取樣5 mL，0.22 μm 微孔濾膜過濾，測定四氫姜黃素含量，計算溶出度，結(jié)果見圖1。

圖1 3 種處方在人工胃液中的溶出曲線

由此可知，3 種類型處方的溶出速率從快到慢為ⅢBL、ⅢB-M、Ⅳ，ⅢB-L 型可乳化分散，在15 min 時溶出度即達90%； ⅢB-M 型溶出度較低，2 h 時約為61%； Ⅳ型最終溶出度僅為38%，這是由于其載藥后黏度較大，溶出速度較慢，并且隨著其中表面活性劑和助溶劑的溶解，殘留的四氫姜黃素遇水迅速產(chǎn)生沉淀，導(dǎo)致溶出度較低。

2.3.4 ⅢB-M、ⅢB-L 處方體外消化比較 為了模擬四氫姜黃素-脂質(zhì)制劑在體內(nèi)消化過程，參考文獻［14］ 報道，分別采用模擬禁食腸液和模擬餐后腸液為介質(zhì)，并加入豬胰酶以模擬餐前和餐后狀態(tài)下處方在腸道的消化過程。

將0.42 g NaOH、3.44 g NaHPO4、6.19 g NaCl 溶于0.9 L 純凈水中，調(diào)節(jié)pH 至6.5，純凈水補足體積至1 L，得緩沖液。將2.24 g 模擬禁食腸液粉末溶解于緩沖液中，即得模擬禁食腸液； 將4.04 g NaOH、8.65 g 冰醋酸、11.87 g NaCl 溶于0.9 L 純凈水中，調(diào)節(jié)pH 至6.5，補足體積至1 L，即得緩沖液； 將11.2 g 模擬餐后腸液粉末溶于緩沖液中，即得模擬餐后腸液； 分別在2 種介質(zhì)中加入0.5%豬胰酶、氯化鈣27.7 mg，渦旋1 min，即得消化介質(zhì)，組成見表3。

表3 模擬禁食和餐后消化液組成

分別取“2.3.3” 項下含藥處方0.50 g，加入37 ℃、含50 mL 模擬腸液消化液的離心管中，60 r/min 振搖，于0、0.25、0.5、1、1.5、2 h 各取消化液0.5 mL，加入0.5 mmol/mL 4-溴苯硼酸甲醇10 μL，搖勻，終止脂解反應(yīng)［15］，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

由圖2 可知，在消化體系中，四氫姜黃素濃度達到高峰后均有下降趨勢，這是由于處方在快速分散達到過飽和后產(chǎn)生沉淀所導(dǎo)致的。在模擬禁食腸液中，ⅢB-L 型溶出AUC 高于ⅢB-M 型，這與模擬胃液中的溶出試驗結(jié)果一致。而在模擬餐后腸液中，ⅢB-L 型與ⅢB-M 型的AUC 差異較小，可能是由于模擬餐后腸液中具有更高濃度的膽鹽、磷脂及脂質(zhì)消化產(chǎn)物［16］，對四氫姜黃素的溶解度增大導(dǎo)致，提示四氫姜黃素的脂質(zhì)處方可能具有正向食物效應(yīng)［17］，即餐后給藥可增加其生物利用度。綜合M、L 型處方在2 種消化介質(zhì)中的表現(xiàn)，選擇長鏈的蓖麻油作為脂質(zhì)，對四氫姜黃素溶解度更高的模擬餐后腸液作為脂解試驗的介質(zhì)。

圖2 ⅢB-M、ⅢB-L 型處方溶出曲線

2.4 D-最優(yōu)混料設(shè)計 根據(jù)四氫姜黃素在各型處方中的溶解度結(jié)果可知，當(dāng)蓖麻油比例為25%時（ⅢB 型），載藥量可達330 mg/g，因此預(yù)估蓖麻油比例≤0.3 時，載藥量將大于300 mg/mL。結(jié)合Pouton［1］對各類脂質(zhì)制劑處方組成的界定（表4），將表面活性劑吐溫80 范圍設(shè)置為0.2 （Ⅲ型處方下限） ～0.8 （Ⅳ型處方上限），助表面活性劑Transcutol HP 比例≤0.5。通過Design Expert 12 軟件進行D-最優(yōu)混料設(shè)計，結(jié)果見表5。

表4 脂質(zhì)制劑處方分類

表5 D-最優(yōu)混料設(shè)計結(jié)果

按表5 的處方比例制備空白脂質(zhì)處方，并在處方中加入過量四氫姜黃素，25 ℃下振搖48 h，8 000 r/min 離心10 min，按“2.3.4” 項下方法進行體外消化試驗，于0.25、0.5、1、2、3、4 h 各取消化液0.5 mL，加入0.5 mmol/mL 4-溴苯硼酸甲醇溶液10 μL，搖勻，終止脂解反應(yīng)，0.22 μm 微孔濾膜過濾，測定四氫姜黃素質(zhì)量濃度。通過Prism 8.0 軟件繪制時間-濃度曲線，見圖3，計算曲線下面積AUC，結(jié)果見表5。

圖3 各處方體外消化試驗溶出曲線

通過Design Expert 12 軟件對表5 數(shù)據(jù)進行回歸擬合，得方程為AUC＝-139.98A＋846.38B＋275.09C-1 547.80AB-51.65AC- 1 673.94BC＋4 354.12A2BC＋8 010.82AB2C＋3 585.47ABC2（R2＝0.983 8），方差分析見表6。由此可知，失擬項P＝0.272 7，R2＝0.989 3，，表明模型擬合程度較好，能較準確地預(yù)測評價指標； 當(dāng)A為0.076，B為0.800，C為0.124 時，AUC 達到峰值，為435.6 mg/（mL·min）。溶解度最佳擬合方程為溶解度＝-1 943.4A＋78.41B-679.57C＋3 315.32AB＋6 395.61AC＋3 510.66BC-12 512.57ABC（P＜0.01）。輔料比例取AUC優(yōu)化值時，溶解度的預(yù)測值為346.52 mg/g。

表6 方差分析結(jié)果

由等高線圖（圖4） 可知，四氫姜黃素在處方中的飽和溶解度與油脂的比例量具有負相關(guān)關(guān)系，但AUC 與輔料比例的關(guān)系更為復(fù)雜，AUC 隨表面活性劑比例增加而增加，但當(dāng)表面活性劑的量一定時，油脂和助表面活性劑其中之一偏大，AUC 會明顯降低。

圖4 溶解度（A）、AUC （B） 等高線圖

2.5 驗證試驗 按預(yù)測的最優(yōu)處方進行輔料的配制，加入過量四氫姜黃素混合，振搖48 h 以達到飽和濃度，取離心后的載藥處方，進行消化試驗，測定其體外釋放濃度，重復(fù)3 次，結(jié)果見表7。由此可知，驗證試驗與模型預(yù)測相符，模型重復(fù)性和預(yù)測性良好。

表7 驗證試驗結(jié)果（n＝3）

2.6 載藥量研究 將“2.5” 項下所得飽和載藥量的含藥最優(yōu)處方混合，添加空白輔料稀釋混勻，制得載藥量分別為飽和載藥量20%、40%、60%、80%、100% （71、142、213、284、355 mg/g） 的處方F20～F100，按“2.3.4” 項下方法進行消化試驗，測定消化液中四氫姜黃素質(zhì)量濃度。

由圖5A 可知，在4 h 的消化過程中，F(xiàn)20、F40 在質(zhì)量濃度達到最高后幾乎保持不變； F60 在60 min 達到最高后緩慢降低； F80、F100 在60 min 達到峰值后迅速下降，4 h后甚至接近F20。釋放曲線AUC 順序為F100、F60、F80、F40、F20，F(xiàn)60～F100 的AUC 差距不大（圖5B）。這是由于四氫姜黃素在體系中的過飽和度較低時，可以較長時間保持亞穩(wěn)態(tài)，但過飽和度越高，藥物聚集速度越快，形成沉淀速度也加快，導(dǎo)致更快接近平衡濃度（圖6）。這一結(jié)果提示，藥物在消化液中的高過飽和度會帶來較大的沉淀風(fēng)險，可能導(dǎo)致其在體內(nèi)的暴露低于預(yù)期。綜上所述，暫定載藥量為60%飽和載藥量，即213 mg/g。

圖5 不同載藥量四氫姜黃素脂質(zhì)制劑在體外消化時的溶出曲線（A） 和AUC （B）

圖6 載藥量對消化4 h 后四氫姜黃素質(zhì)量濃度的影響

3 討論

本研究以四氫姜黃素的脂質(zhì)處方在簡化體外脂解模型中的濃度-時間曲線下面積為指標，采用D-最優(yōu)混料設(shè)計優(yōu)選了脂質(zhì)處方，結(jié)果表明以蓖麻油、吐溫80、Transcutol HP 質(zhì)量比為7.6 ∶80 ∶12.4 時，脂質(zhì)處方具有最大的體外脂解試驗曲線下面積。在此基礎(chǔ)上通過體外消化試驗對最佳載藥量進行了初步摸索。

本研究采用體外AUC 作為衡量制劑性能的指標，為脂質(zhì)制劑的處方研究提供了一種新的手段； 改進了簡化脂解試驗的方法，讓處方的分散在脂解過程中進行，能夠同時考察處方的分散性能； 讓被考察處方以各自的飽和載藥量進行脂解試驗。因此，就使脂質(zhì)制劑體外脂解試驗中的AUC 成為綜合指標，考察了處方的分散性能、載藥量、在分散和消化時保持藥物過飽和的能力，比通常采用的溶解度、乳滴粒徑、乳化時間等簡單指標更能反映制劑在體內(nèi)的性能。

在脂解試驗中溶出曲線普遍顯示出先升后降的趨勢，這是由于藥物在初始階段快速溶出，濃度迅速升高，隨后由于過飽和狀態(tài)的不穩(wěn)定而發(fā)生沉淀，導(dǎo)致濃度下降，被稱為“彈簧-降落傘” 過程［18-19］，是脂質(zhì)制劑等過飽和制劑釋藥的一個共同特點。正是由于這種不規(guī)則的釋藥曲線，使得AUC 而非溶出度成為一個衡量脂質(zhì)制劑性能的良好指標。

本研究發(fā)現(xiàn)，載藥量與體外AUC 并不呈完全的等級相關(guān)，這可能與試驗條件有關(guān)。如果增大介質(zhì)用量，會減小體系的過飽和度，降低沉淀速度，從而使AUC 等級與載藥量趨于一致； 若采用較短的消化時間（30～60 min），載藥量與AUC 呈較好的等級相關(guān)。但本研究采用50 mL 消化液體積及4 h 消化時長能更準確地反映胃腸道的生理狀態(tài)，其試驗結(jié)果也更好地體現(xiàn)了脂質(zhì)處方體內(nèi)表現(xiàn)的復(fù)雜性。但當(dāng)載藥量達到飽和濃度60%以上時，載藥量與體內(nèi)暴露量的關(guān)系難以根據(jù)本實驗預(yù)測，需要進一步結(jié)合體內(nèi)生物利用度、藥效學(xué)研究結(jié)果進行確認。